全 文 ：第 32 卷 第 3 期
2010 年 5 月
北 京 林 业 大 学 学 报
JOURNAL OF BEIJING FORESTRY UNIVERSITY
Vol. 32，No. 3
May，2010
收稿日期:2009--04--02
基金项目:国家科技基础条件平台项目(2005DKA21207)、“十一五”国家科技支撑计划项目(2006BAD07A13--3)。
第一作者:彭玉红。主要研究方向:土壤微生物多样性。电话:010--62889682 Email :yhpeng81@ hotmail. com 地址:100091 北京市颐和
园后中国林业科学研究院林业研究所。
责任作者:焦如珍，副研究员。主要研究方向:森林土壤微生物、微生物肥料研制及应用技术。电话:010--62889663 Email :jiaorzh65@
sina. com. cn 地址:同上。
本刊网址:http:∥www. bjfujournal. cn;http:∥ journal. bjfu. edu. cn
一株分离自含羞草的 β--根瘤菌的
生物学特性研究
彭玉红1 焦如珍1 牟新涛2
(1 中国林业科学研究院林业研究所 2 南非比勒陀利亚大学林业与农业生物技术研究所)
摘要:从海南尖峰岭自然保护区巴西含羞草的根瘤中分离到一株根瘤菌，编号为 caf324，经过 16S rDNA 全序列测定
和系统发育分析，发现 caf324 与 β--根瘤菌含羞草伯克霍尔德菌 PAS44 (AY752958)的亲缘关系很近，相似度达到
99. 7%。通过部分生理生化测定发现，caf324 接触酶、氧化酶和硝酸盐还原试验均为阳性，不能利用明胶和淀粉，不
能利用葡萄糖发酵产酸，不能水解酪素，不能产生吲哚和 3--酮基乳糖;抗逆性研究表明，caf324 的生长范围广，可耐
2%的 NaCl，耐酸碱(pH4 ～ 11)，最高生长温度 45℃。
关键词:β--根瘤菌;含羞草伯克霍尔德菌;16S rDNA 全序列;抗逆性;生物学特性
中图分类号:S154. 3 文献标志码:A 文章编号:1000--1522(2010)03--0117--05
PENG Yu-hong1;JIAO Ru-zhen1;MOU Xin-tao2. Biological characteristics of Burkholderia sp.
caf324 isolated from Mimosa invisa. Journal of Beijing Forestry University (2010)32(3)117--121
［Ch，26 ref.］
1 Research Institute of Forestry，Chinese Academy of Forestry，Beijing，100091，P. R. China;
2 Forestry and Agricultural Biotechnology Institute，University of Pretoria，0002，South Africa.
Isolated from root nodules of Mimosa invisa Mart. ex Colla in the Jianfengling National Nature
Reserve，Hainan Province，a representative strain，caf324，was analyzed by 16S rDNA sequencing，
physical and chemical properties test. The 16S rDNA sequence was compared with related rhizobia and
an unrooted phylogenetic tree was produced. The results show that caf324 is clustered together with β-
rhizobia of Burkholderia mimosarum PAS44 (AY752958)，with a similarity of 99. 7% . Biological
characteristics of this caf324 strain were tested，showing the following results:catalase and oxidase were
positive，indole was not found，gelatin was not hydrolysed and glucose was unable to generate acid
through fermentation. It can endure 2% NaCl and grow in media with pH of 4--11， under the
temperatures up to 45℃ .
Key words β-rhizobia;Burkholderia mimosarum;16S rDNA sequence;adversity tolerance;biological
characteristics
根瘤菌与豆科植物的共生是生物固氮中作用最
强的体系，所固定的氮约占生物固氮 总 量 的
65% ［1--3］。豆科植物在世界范围内广泛分布，按照
Aliens 分类系统，豆科植物可以分为 3 个亚科、748
属、约 2 万种［4］，其中 90%具有形成根瘤的能力［5］。
不同豆科植物由于其生物学特性和环境适应性的需
求，与之共生的根瘤菌也具有多种性状的差异。
早期的根瘤菌分类系统是以互接种族和寄主范
围以及一些简单的形态和生理性状为依据的［6］。
自从异根瘤菌属(Allorhizobium)的建立，根瘤菌被划
DOI:10.13332/j.1000-1522.2010.03.007
分 在 细 菌 门 α--变 形 杆 菌 纲 的 根 瘤 菌 属
(Rhizobium)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium)、中慢生
根瘤菌属(Mesorhizobium)、异根瘤菌属、慢生根瘤菌
属(Bradyrhizobium)和固氮根瘤菌属(Azorhizobium)
等属中［7］，此后研究者们普遍认为根瘤菌只属于 α--
变形杆菌纲。然而 Moulin 等［8］发表了 β--变形杆菌
纲伯克霍尔德菌属(Burkholderia)的 Burkholderia
sp. STM678 和 STM8l5 也属于根瘤菌的报道，此两
菌株经回接试验及结瘤基因 nodA 突变检测证实为
根瘤菌，具有固氮活性，揭示了根瘤菌不仅存在于
α--变形杆菌纲，还存在于 β--变形杆菌纲中。
海南尖峰岭自然保护区位于 18°42′N、108°52′
E，保存有较完整的热带天然林和次生林，物种资源
十分丰富。巴西含羞草(Mimosa invisa)又名美洲含
羞草，原产于巴西，其生命力顽强，与之共生的根瘤
菌也具有对抗不良环境的能力，通过对其进行分类、
生物学特性、抗逆性研究，为优良根瘤菌菌株的筛
选、研究和应用打下基础。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
1. 1. 1 主要仪器与试剂
主要仪器有:生化培养箱、恒温摇床、高速冷冻
离心机、PCR 仪、凝胶成像系统等。DNA Marker 和
PCR 扩增试剂盒购自 TaKaRa 公司。
1. 1. 2 供试菌株
采样时间为 2006 年 4 月。从海南尖峰岭国家自
然保护区海拔 800 m 处采集到巴西含羞草植株的根
瘤，选择肉红色活性高的根瘤，分离纯化后得到一批
菌株，caf324 是从固氮酶活性高的根瘤中分离得到。
1. 2 16S rDNA 的克隆与序列测定
以 caf324 作为供试菌株。基因克隆中的大肠
杆菌 菌 株 为 DH5α (博 大 泰 恒)，质 粒 载 体 为
pMD18--T(Trans 公司)。
1. 2. 1 供试菌株总 DNA 的提取
菌株用 LB 培养基 28℃振荡培养至对数生长
期，12 000 r /min 离心收集菌体，用 TE(pH8. 0)悬浮
细胞，溶菌酶破壁，蛋白酶 K 去除蛋白质，轻轻混
匀，37℃ 水浴 1 h。CTAB /NaCl 65℃ 盐析 20 min，
800 μL 氯仿 /异戊醇(体积比为 24 ∶ 1)抽提，取上清
液转移至新的离心管，加入异丙醇沉淀 DNA。离心
后乙醇洗脱，去上清液，无菌风干，最后溶于 TE
(pH8. 0)中备用［9--11］。
1. 2. 2 16S rDNA 的 PCR 扩增、克隆及测序
以 总 DNA 为 模 板，正 向 引 物 27f:5′--
gagatttgatcctggctcag--3′， 反 向 引 物 1 495r: 5′--
ctacggctaccttgttacga--3′(上 海生工合成)［12--13］，经
PCR 扩增出 16S rDNA。扩增体系为:ddH2O 15. 0
μL，10 × Buffer 2. 0 μL，dNTPs(10 mmol /L)0. 5 μL，
引物 1(10 μmol /mL)0. 5 μL，引物 2(10 μmol /mL)
0. 5 μL，模板 DNA (100 μg /mL)1. 0 μL，Taq DNA
聚合酶 (2. 5 U /μL)0. 5 μL。扩增条件为:94℃预
变性 5 min，35 个循环的扩增(94℃、45 s，52℃、45
s，72℃、1 min)，最后 72℃延伸 10 min。对 PCR 产
物纯化回收后与质粒 PMD18--T 载体进行连接，转
化大肠杆菌 DH5α，筛选阳性转化子。提取质粒
DNA 验证后，送上海生工测序。
1. 3 生理生化试验
柠檬酸盐生长试验、产氨试验、葡萄糖氧化产酸、
葡萄糖发酵产酸、水解酪素、吲哚试验、硝酸盐还原、
苯丙氨酸脱氢酶、乙酰甲基甲醇试验、甲基红试验、接
触酶、氧化酶、3--酮基乳糖、明胶液化、淀粉水解、石蕊
牛奶试验。试验方法均参考文献［14--15］。
1. 4 抗逆性试验
1. 4. 1 菌株活化及接种母液的配制
将待测菌株活化 3 次后接入灭菌的 YMA 培养
液中，置于 28℃摇床培养(48 ± 6)h，根瘤菌在培养
液中的繁殖数量采用分光光度计比色法测定，测定
指标用 600 nm 波长的光密度值(OD600 nm)，将菌株
培养液均加无菌水调释至 OD600 nm为 0. 5 的菌液浓
度，作为其他处理培养的接种母液［16］。
1. 4. 2 耐酸碱试验
用 HCl 和 NaOH 调释 YMA 培养液，分装试管，
每管 4 mL，灭菌后制成 pH 分别为 3、4、5、7、9、10、
11 和 12 的 YMA 培养液。取接种母液分别接至不
同 pH 梯度处理的 YMA 培养液中，将初始浓度调整
到 OD600 nm为 0. 1，3 次重复。置于 28℃摇床，培养
72 h (160 r /min)，用分光光度计测其 OD600 nm值。
以培养基中菌体生长的光密度 OD600 nm≥0. 1 所对
应的 pH 值为该菌株所能耐受的酸碱度。
1. 4. 3 耐盐试验
配制 7 个不同 NaCl 浓度的 YMA 培养液:
0. 01%、0. 4%、1%、2%、3%、4%、5%，分装试管，灭
菌。将菌株接种母液分别接至不同 NaCl 浓度的
YMA 培养液中，接种及培养方法同 1. 4. 2 节。以培
养基中菌体生长的光密度 OD600 nm≥0. 1 所对应的
NaCl 浓度作为该菌株所能耐受 NaCl 浓度。以不接
种根瘤菌为对照，测其 OD600 nm值，3 次重复。
1. 4. 4 温度试验
选用 NaCl 浓度 0. 01%、pH7 的 YMA 培养液作
为基础培养基，分装试管，灭菌。调整温度分别为
10、20、28、37、45、50 和 60℃。接种方法同 1. 4. 2
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节，置于不同温度的水浴锅中培养 7 d，其中 50℃高
温处理 20 min、60℃高温处理 10 min 之后，放置于
28℃水浴培养以测其对短时高温的耐受性。测其
OD600 nm值，记录。
1. 5 数据处理
数据处理采用 Excel 和 Mega4. 0 软件进行分析。
系统发育分析采用 MEGA version 4. 0 UPGMA法。
2 结果与分析
2. 1 16S rDNA 序列
图 1 为 菌 株 caf324 的 16S rDNA 全 序 列
(1 496 bp)。
将所测序列与根瘤菌已知种及相关种进行比
较，得出 16S rDNA 相似性矩阵(表 1)。
图 1 菌株 caf324 的 16S rDNA 全序列
Fig. 1 Full-length 16S rDNA sequence of strain caf324
表 1 菌株 caf324 与高同源性已知菌株的 16S rDNA 相似性矩阵表
Tab. 1 Similarity of caf324 and Burkholderia spp. based on 16S rDNA sequences %
1 2 3 4 5 6 7 8 9
1 caf324 100. 0
2 B. mimosarum PAS44(AY752958) 99. 7 100. 0
3 B. cepacia LMG1222(M22518) 95. 0 95. 4 100. 0
4 B. kururiensis(AB024310) 96. 7 96. 8 94. 9 100. 0
5 B. phenazinium(U96936) 95. 3 95. 6 96. 0 94. 8 100. 0
6 B. phymatum STM815(AJ302312) 95. 7 96. 0 95. 2 96. 8 96. 7 100. 0
7 B. sacchari(AF263278) 97. 9 98. 3 95. 8 97. 1 95. 0 95. 7 100. 0
8 B. sp. Br3470 STM678(AY773198) 96. 9 98. 0 94. 6 95. 5 94. 6 95. 8 97. 0 100. 0
9 B. tuberum STM678(AJ302311) 96. 3 96. 5 94. 6 96. 8 95. 7 96. 9 96. 6 96. 3 100. 0
通过系统发育学分析得出各菌株间相似性及系
统发育树状图(图 2)，caf324 与 β--变形杆菌纲伯克
霍尔德属的含羞草伯克霍尔德菌(B. mimosarum)、
洋葱伯克霍尔德菌(B. cepacia)、鼻疽伯克霍尔德菌
(B. kururiensis)、B. phenazinium、B. phymatum、B.
sacchari、B. sp. 和瘤状伯克霍尔德菌(B. tuberum)
聚为一群，与该分支内其他已知种模式菌株的 16S
rDNA 相似性均在 95%以上。根据 Martinez-Romero
等［17］建议的分类标准，caf324 所在的这个分支应属
于伯克霍尔德菌属。学者们通过对含羞草类植物
(M. pudica、M. diplotricha、M. bimucronata、M.
scabrella、M. casta 和 M. pigra)根瘤菌的研究，也发
现其根瘤菌大多数归属于 β--根瘤菌的伯克霍尔德
菌［18
--24］。caf324 与含羞草伯克霍尔德菌 PAS44 菌
株的亲缘关系最近，相似度为 99. 7%，可初步确定
该菌株为含羞草伯克霍尔德菌［18］。
911第 3 期 彭玉红等:一株分离自含羞草的 β--根瘤菌的生物学特性研究
图 2 菌株 caf324 16S rDNA 序列系统发育树状图
Fig. 2 Phylogenetic tree of caf324 strain derived from 16S rDNA sequences
注:分支数字代表 Bootstrap 值，即计算 100 次出现同种结果的频次;比例尺代表演化距离。
此外，由 诺 尔 斯 通 根 瘤 菌 (Ralstonia
taiwanensis)更 名 后 的 Cupriavidus taiwanensis 的
LMG19425 和 LMG19424［25］2 株 β--变形杆菌纲根瘤
菌菌株聚为一分支。α--变形菌纲的发根根瘤菌
(Rhizobium rhizogenes)、热带根瘤菌(R. tropici)、墨
西哥剑菌(Ensifer mexicanum)和苜蓿中华根瘤菌
(Sinorhizobium meliloti)聚为一群(图 2)。
2. 2 生长特性
菌株 caf324 为革兰氏阴性菌，杆状。菌落半透
明，边缘光滑，突起，黏性大，易挑起，培养 3 d 后菌
落直径为 0. 9 mm。
2. 3 生理生化结果
由表 2 可以看出，菌株 caf324 接触酶和氧化酶
均为阳性，不能将蛋白胨中的色氨酸分解为吲哚，不
能液化明胶，不能利用葡萄糖发酵产酸，这均与含羞
草伯克霍尔德菌 PAS44 (AY752958)相关报道相
符［18］。进一步确定 caf324 为含羞草伯克霍尔德菌。
硝酸盐还原试验中，加入 Griss A 液和 B 液后，
caf324 的培养液颜色立刻由淡黄色变为粉红色，表
示硝酸盐被还原为亚硝酸盐，反应为阳性。此外，
caf324 不能进行 3--酮基乳糖的反应，不能利用淀粉
和水解酪素，这与一般根瘤菌的特性相同。caf324
在石蕊牛奶中培养 2 d 后产碱，使培养基的颜色由
紫色变为蓝色;培养 5 d 后又发生了还原反应，培养
基褪色为淡蓝色。菌株 caf324 使柠檬酸钠斜面培
养基由淡粉红变为玫瑰红，说明该菌株能利用柠檬
酸盐。
表 2 菌株 caf324 与含羞草伯克霍尔德菌 PAS44
部分生理生化特性比较
Tab. 2 Comparison of physical and chemical characteristics
between caf324 and Burkholderia mimosarum PAS44
试验项目 caf324
含羞草
伯克霍
尔德菌
PAS44
试验项目 caf324
含羞草
伯克霍
尔德菌
PAS44
接触酶 + + 柠檬酸盐生长试验 +
氧化酶 + + 产氨试验 +
苯丙氨酸脱氢酶 － 葡萄糖发酵产酸 － －
硝酸盐还原 + 葡萄糖氧化产酸 － －
水解酪素 － 石蕊牛奶还原 +
吲哚试验 － － 石蕊牛奶胨化 －
3--酮基乳糖 － 石蕊牛奶产酸 －
明胶液化 － － 石蕊牛奶产碱 +
乙酰甲基甲醇试验 － 石蕊牛奶酸凝 －
甲基红试验 － 石蕊牛奶酶凝 －
淀粉水解 －
注:“ －”表示不生长，“ +”表示生长。
2. 4 抗逆性
由表 3 可以看出，根瘤菌 caf324 的最适温度为
28℃，对高温耐受性强:在 37℃下能正常生长，45℃
时生长微弱。试验证明 caf324 对短时高温有一定
的耐受性:在水浴 50℃、20 min 和 60℃、10 min 分别
处理后均能在 28℃的培养条件下生长。耐盐能力
强，在 2%的 NaCl 培养基中仍能生长，最适盐浓度
为 0. 4% ～ 1%，而一般的根瘤菌培养基 NaCl 浓度
为 0. 01% ［26］。pH 生长范围宽:pH4 ～ 11 的培养基
条件下均能不同程度的生长，而且在 pH5 ～ 9 均能
生长良好。
021 北 京 林 业 大 学 学 报 第 32 卷
表 3 菌株 caf324 抗逆性试验结果
Tab. 3 Tolerance test of strain caf324
温度 /℃ 结果 盐度(NaCl) /% 结果 pH 结果
10 － 0. 01 + 3 －
20 + 0. 4 + + 4 +
28 + + 1 + + 5 + +
37 + 2 + 7 + +
45 + － 3 － 9 + +
50(20 min) + 4 － 10 +
60(10 min) + － 5 － 11 + －
注:“ －”表示不生长;“ + －”表示微弱生长;“ +”表示生长;“ + + ”
表示生长良好。
3 结 论
1)根瘤菌菌株 caf324 为含羞草伯克霍尔德菌，
目前国内外还没有相关的报道。
2)根瘤菌菌株 caf324 最适温度为 28℃，临界温
度为 45℃。
3)根 瘤 菌 菌 株 caf324 最 适 NaCl 浓 度 为
0. 4% ～ 1%，最高可耐 2% NaCl。
4)根瘤菌菌株 caf324 生长适应 pH 为 4 ～ 11，在
pH 5 ～ 9 范围内生长良好，生长适应 pH 范围广。
5)根瘤菌菌株 caf324 是具有耐高温(45℃)、高
盐(2% NaCl)、酸(pH4)、碱(pH11)，具有多重抗性
的优良根瘤菌菌株。
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(责任编辑 董晓燕)
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