全 文 ：收稿日期:2004-11-08
基金项目:国家 863 项目(2001AA212161);国家自然科学基金(30270711)
作者简介:张庆莲(1980-), 女 , 2002 级硕士研究生.
＊通讯作者
文章编号:　0490-6756(2005)01-0210-03
盐生杜氏藻的完整叶绿体分离
张庆莲 ,乔代蓉 ,孙胜春 ,孙晓菲 ,贺庆华 ,曹　毅＊
(四川大学生命科学学院 ,成都 ,610064)
盐生杜氏藻(Dunaliel la salina)是世界上最耐盐的一种单细胞真核绿藻 ,可在含 0.1 ～ 5.0mol/L
NaCl的培养液中正常生长.盐生杜氏藻细胞内的主要调渗物质是甘油 ,在甘油代谢途径中 ,3-磷酸甘油脱
氢酶是一个关键酶.近年来的研究表明杜氏藻(Dunaliel la tertiolecta)细胞质和叶绿体中都存在 3-磷酸甘
油脱氢酶的同工酶 ,且叶绿体上的同工酶与渗透调节作用直接相关[ 1 , 2] .为了解 D.salina 中 3-磷酸甘油
脱氢酶同工酶的细胞定位和分布 ,我们通过冰浴超声波破碎和蔗糖密度梯度离心 ,获得盐生杜氏藻的完整
叶绿体 ,用相差显微镜镜检 、酶的活性分析等方法对其完整性作了初步分析.
1　材料与方法
1.1　材料
盐生杜氏藻(Dunaliella sal ina )为本实验室的保存菌种.
1.2　方法
1.2.1　盐生杜氏藻的培养条件　25℃, 16h光照 、8h 黑暗 ,5%CO2 通气量 , NaCl浓度 0.5 mol/L ,培养液
的成分参考文献[ 3] ,培养物的总体积为 2L.
1.2.2　盐生杜氏藻的　取培养 7d的藻细胞培养液 4500g 离心 10min ,细胞沉淀重悬在新鲜的生长培养
基中充分洗涤 ,然后 4500g 离心 10min ,除去一些细胞外的粘稠物.将离心得到的细胞沉淀重悬在冰预冷
的 15mL 分离缓冲液(1mol/L Sorbitol , 50mmol/L Hepes , 2mmol/L EDTA , 1mmol/ L M nCl2 , 1mmol/L
M gCl2 , 0.5%BSA , 0.1 mol/L DT T ,用 KOH调节到 pH 7.5)中.
1.2.3　叶绿体的分离　将 15mL 重悬细胞液进行冰浴超声波破碎 ,超声波功率 200W ,共作用 64s ,每次
作用时间 8s ,间隔时间 9.9s.然后 4℃2000g离心 10min ,沉淀重悬在 3mL 的分离缓冲液中 ,作为叶绿体粗
提液.将叶绿体粗提液加在蔗糖密度梯度(30%/45%/59%,30mL)上 ,4℃40000g 离心 30min ,吸取 45%
和 59%之间的条带(约 5mL),用 3倍体积的清洗缓冲液(1 mol/L So rbitol , 25mmol/L Hepes ,用 KOH 调
节到 pH 7.5)清洗收集物 ,4℃2000g 离心 10min ,沉淀即为完整的叶绿体.将叶绿体沉淀重悬在 3mL 的清
洗缓冲液中 , 4℃2000g 离心 10min ,以便更好的除去蔗糖溶液和破碎的膜.
1.2.4　酶活性测定　将细胞和叶绿体沉淀分别重悬在 5mL 冰预冷的酶活性分析缓冲液(50mmol/L
Hepes , 5 mmol/ L DTT ,2.5%甘油 ,用 KOH 调节到 pH 7.5)中 ,冰浴超声波破碎 ,超声波功率 200W ,共作
用 300s ,每次作用时间 3s ,间隔时间 5s.4℃40000g离心 15min ,上清用作酶活性分析.3-磷酸甘油脱氢酶
活性测定方法参照文[ 4] .
1.2.5　蛋白质含量的测定　根据 Bradford 的考马斯亮蓝法测定蛋白质含量.以牛血清白蛋白为标准蛋
白[ 5] .
2005年 2月
第 42卷第 1期
四川大学学报(自然科学版)
Journal of Sichuan Universi ty (Natural Science Edition)
Feb.2005
Vol.42　No.1
2　结果与讨论
2.1　相差显微镜检测叶绿体完整性
通过本实验研究 ,我们总结出成功分离叶绿体有以下几个关键因素:1)选择低 NaCl浓度的盐生杜氏
藻培养基.研究报道 ,在低 NaCl浓度下(0.1 ～ 1.5mol/ L)盐生杜氏藻生长状态好 ,叶绿体较大 ,而在高 Na-
Cl浓度下(大于 2.7 mol/L),占细胞体积一半的单一叶绿体被分成许多小的部分 ,与内质网融合从而影响
完整叶绿体的分离效果[ 7] .在本实验中 ,我们对生长在含 0.17mol/L ,0.5mol/ L ,1.0mol/L 三个 NaCl浓度
培养基中盐生杜氏藻分别进行研究 ,发现含有 0.5mol/ L NaCl浓度的盐生杜氏藻培养基最有利于完整叶
绿体的分离;2)培养过程中持续通入 5%CO2.盐生杜氏藻在低 CO2 通气量时生长比较缓慢 ,且在细胞外
会产生很多的粘稠物质阻碍叶绿体的分离 ,而高 CO2 通气量的培养方式可以避免细胞在生长过程中因发
生贴壁现象而导致的生长延缓[ 7] ,另外 ,我们在实验中发现 ,盐生杜氏藻细胞在培养过程中 ,培养基有碱
化趋势(数据未给出).因此 ,持续通入 5%CO2 还有保持培养基恒定 pH 值的作用;3)分离过程中保持等渗
透压的外界环境.由于盐生杜氏藻细胞没有坚硬的多糖细胞壁 ,细胞只是由一层薄的细胞膜包裹 ,因此在
外界渗透压发生变化时可迅速改变细胞包括叶绿体的形态[ 8] .针对这一性质 ,在叶绿体分离过程中 ,所选
用的生长培养基 ,分离缓冲液 ,密度梯度离心缓冲液 ,清洗缓冲液应该保持同样的渗透压防止叶绿体形态
在分离过程中发生改变.在本实验中 ,我们在分离缓冲液 ,密度梯度离心缓冲液 ,清洗缓冲液组分中分别加
入 1mol/L 的 Sorbi tol ,使其与 0.5mol/L 的生长培养基保持等渗透压环境 ,从而保证在分离过程中叶绿体
的体积不发生改变.盐生杜氏藻细胞通过冰浴超声波破碎和蔗糖密度梯度离心 ,获得的叶绿体在 LeiCa
DMIRB相差显微镜(×200)下观察到明显的透明圈(附图),证明所分离到的叶绿体是完整的[ 6] ,计数测
定得出完整叶绿体的分离效率达到 70%.
附图　盐生杜氏藻细胞及叶绿体在相差显微镜(×200)下的形态观察
Fig.　Phase contrast pho tomicrog rah(×200)of the isola ted chlordoplasts and cells of D .salina
A:完整叶绿体;　B:盐生杜氏藻细胞
2.2　细胞质和叶绿体蛋白的酶活性测定
3-磷酸甘油脱氢酶可催化由磷酸二羟基丙酮向 3-磷酸甘油转化的可逆反应.从表 1可以看出 ,细胞
质中 3-磷酸甘油脱氢酶的正逆向活性分别为 3.41 U/mg 和 1.88 U/mg;而叶绿体中 3-磷酸甘油脱氢酶的
正逆向活性分别为 3.72U/mg和 3.26 U/mg.说明我们所分离的完整叶绿体很好地保留了 3-磷酸甘油脱
氢酶的活性.证明所采用的叶绿体分离方法是成功的 ,可用于进一步的盐生杜氏藻 3-磷酸甘油脱氢酶的
研究.由于 3-磷酸甘油脱氢酶在细胞中含量低 ,不稳定 ,我们在酶活性分析缓冲液中加入甘油和 DTT ,这
两种物质可以作为酶活性保护剂稳定 3-磷酸甘油脱氢酶的活性[ 9] .同时 ,通过附表我们可以发现 ,无论在
细胞质还是在叶绿体中 , 3-磷酸甘油脱氢酶的正向活性都要大于逆向活性.这是因为 , 3-磷酸甘油脱氢酶
211第 1期 张庆莲等:盐生杜氏藻的完整叶绿体分离
正反应的最适 pH 为7.5 ,而逆反应的最适pH 为 10 ,在细胞正常生理 pH范围内不可能达到逆反应的最适
pH值.另外 ,附表还显示 ,叶绿体中 3-磷酸甘油脱氢酶的活性大于细胞质中 3-磷酸甘油脱氢酶的活性 ,这
与以往的报道一致[ 10 ,11] .
附表　盐生杜氏藻 3-磷酸甘油脱氢酶的酶活
Table 　Glycero l-3-phosphate dehydro genase activities of Dunaliella salina
总蛋白量(mg) 总活力(U) 比活力(U·mg-1)
胞质蛋白(正) 52.5 179.25 3.41
胞质蛋白(逆) 52.5 99.0 1.88
叶绿体蛋白(正) 0.72 2.35 3.72
叶绿体蛋白(逆) 0.72 2.35 3.26
参考文献:
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Isolation of Intact Chloroplasts from Dunaliella salina
ZHANG Qing-l ian , QIAO Dai-rong , SUN S heng-chun , SUN Xiao-fei ,
HE Qing-hua , CAO Y i
(College of Life Science , Sichuan University , Chengdu 610064 ,China)
Abstract:Cells of Dunaliel la salina f rom the log phase of g row th were broken by sonication on ice-water-
bath and the chloroplasts were isolated by centrifug ation through sucrose g radient.Osmolarity of the grow th
medium , the suspending medium and the sucrose gradient was kept identical to minimize changes in chlo ro-
plast volume and mitochondrial entrapment.The isolated intact chloroplasts w ere stable to washing with
buffered medium.Isolated chloroplast y ield and purity w as dependent on cell culture condition;a cycle of 16
hours light and 8 hours dark w ith continuous high CO2 was optimum.Isolated chloroplasts were about 70%
intact by microscopic examination.The enzyme activi ty of glycerol-3-phosphate dehydrogenase w as w ell re-
tained in isolated chloroplasts.
Key words:Dunaliella salina;chloroplasts;glycerol-3-phosphate dehydrogenase
212 四川大学学报(自然科学版) 第 42卷