全 文 ：第3 1卷 第 5期
1 2 9 9年 9月
厦 门大 学学报 (自然科学版 )
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1 992
· 研究简报 ·
杜氏藻与大肠杆菌融合初探①
刘广发 楼士林 赖瑞卿 李庆顺
(生 物 学 系 )
杜氏藻 (历 a nz l’ el l aP eir c eiN ic l oi a )系真核单胞绿藻 ,无纤维素细胞壁 . 细胞膜外由糖蛋白
类物质组成柔软的包被 「`〕. E . : 01 1 ( C m ` )内含带 C m ` 基因的质粒 . 以对氛霉素 ( C。 )抗性的变化
作为杜氏藻和大肠杆菌融合的选择标记 , 因而首先测定了它们在各 自琼脂培养基上对 C m (原
始浓度 1 2 59 / l )的抗性水平 ( T a b , 1 ) .
T a 卜. 1 A e o m p ar io o n o f C m r e s i吕t i b己i t y 悦 t w e n D . 扣兹邝己f a n d E . e o l ` ( C m , )
C o cn
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由 T a b . 1 可见 , 杜氏藻的 C m 致死浓度小于 8 0 p pm , 而 E . ` 时茗( C m ` )则高达 2 0 0 p pm 二
者差异十分明显 .
进行细胞融合的前提是制备双方的原生质体或球状体 . 以 0 . 5 m ol 八山梨醉和 5 m m of 1/
H E P E S p H 7
.
5 为缓冲液 ,加入链林蛋白酪达终浓 2 00 u/ m l汇’ 〕 . 在此醛解液中加入处于对数
生长期的杜氏藻达 l x 10 已 个 / m l , 26 ℃酶解 1 h . 参照文献「3」进行电镜祥品制备 ( iF g . 1) .
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, t h e 沈 l l e o a t i , im b u e d w it h f ib r e s o f g l y c o p r o t e in ( X 4 8 0 0 0 )
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① 本文 1 991 一。 8一 1 9 收到 ,国家自然科学基金资助课题
第5 期 刘广发等: 杜氏藻与大肠杆菌融合初探
在光镜下可以看到 , 约 85 环的杜氏藻失去了双鞭毛成为 圆形至椭圆形的原生质体 . 经暗
室单侧光照法诱导 4 h 后 , 获得纯度为 98 %的杜氏藻原生质体 . 将这些原生质体移到原液体培
养基 〔毛 l中 , 其 24 h 的鞭毛再生率可达 8 % , 即它们的活性良好 .
用文献【5〕方法制得 E . : 01 1( C m , )的球状体 . 分别吸取杜氏藻原生质体和 E . co il ( C m r )球
状体 , 使二者的比例约为 1 : 10 . 以 P EG 一钙离子法卜月进行融合处理 ( iF g . 2) .
肠 9 . 2 F u s io n be t w e e n t h e
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从 iF g . 2 可以看出 ,一个杜 氏藻原生质体可以吸附多个 E . ` 01 1(C m r )的球状并通 过细胞的
内容作用把整个球状体吞入胞内 . 整个过程历时 0 . 5~ 2 h . 据统计 , 吸附有球状体的杜 氏藻原
生质体约占总数的 20 % . 经融合处理后在无 C m 的琼脂平皿上再生的杜 氏藻约为 5肠 .
杜氏藻经上述融合处理于弱光处 (l 0 0 L u x) 培养 48 h 后 , 和三组对照分别接种于含各
种浓度 C m 的琼脂培养基上 ,从中检出 C m 抗性 比原杜氏藻高的融合子 ( T ab . 2) .
T a b
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s p 。 e i e ,— —0 60 80 10 0 1 2 0 1 50 18 0C : + + 十 十 十 一 一 一 一 一C : 十 + 十 + 一 一 一 一 一+ 十十 +F u , a n t ` + + + 弓一 + + + + 十 士 一C : : D . P石 r’ 。 ` w i t h o u r a n y t er a t n l e n t . C : : D , P心 icr ￡了w a 吕 p u t t o g e t l、 e r w it l i E . ` 0 1￡( C m . ) , p a s s in g t ll r o u g ha ll t h e s t a 只e , o f t l、 e f u , io n . N o r e t h a r t h e y w e er on t p r o t o p l a o t s a n d / o r , p l飞e r o p la , t , . C 3 : D . P o i。 石 w a st r e a t e d b y a l l t ll e p r o e 。 , , e : o f f u , io n b u t n o E . 0 0 11 ( C耐 ) w a s a d d e d . + :块 g r e e s o f g r o w in g 一 : N o g r o w -in g . 筛选得到的融合子外观都酷似 D . 加 10 1 . 但它们的氯霉素抗性却分别比原出发藻种提高了 3 0写~ 1 0 0% . 统计数字表明 , 如果以融合 后在无 Cm 的琼脂平皿上再生 出的藻落数为1 0 。肠 , 则在含 C m 为 80 、 10 0 、 12 。 及 150 p p m 的琼脂培养基上长出融合子的百分率分别为5 % 、 18 % . 8 %和 2 % . 由 T a b . 2 尚可知 ,三种对照都只能在 C m 浓度为 0 和 60 p p m 的培养基中生长 . 可见实验中的多种药品对 D , P ie rc ` 的抗 C m 水平无明显影响 . 综上述 . 可以认为杜氏藻与大肠杆菌间的融合确已发生 . 融合子对 C m 抗性的成倍提高是由于大肠杆菌质粒上所携带的抓霉素乙酸转移酶 ( C A T ) 基因通过融合已转移到杜氏藻细胞中 ,且得到 一定的表达 .
经过内容作用进入杜氏藻细胞的大肠杆菌经系列取样证明 , 它们似乎难以复制自己 , 但融
.5 7 4
.厦门大学学报 (自然科学版)2 99 1年
合后的第4 1d , 至少尚能在个别杜氏藻中发现大肠杆菌的踪迹 ( iF g . 3) .
大肠杆菌是形体十分微小的原核生
物 ,而 D . P ie crP i 细胞的体积约是它的 4 0
倍 . 实际上 D . P ` cr *el 是把一至多个大肠杆
菌吞进细胞内的 ( iF g . 2) . 本实验从一个方
面为线粒体起源的 “ 内共生学说 ” 提供了新
的支持 . 以 C m 抗性的提高来筛选融合子
是一种较方便然而也是初步的方法 . 制备
D N A 探针 以探查大肠杆菌基因组 (或质
粒 )擂入 D . 户蕊 cr 成 染色体组的状况 , 该实 iF g . 3 A ~ i d ua yr E . 诫 (c m , ) a( r or w de )
验正在进行中 . idn u c , e d i“ ` o D · 户` 邝` aws f o u dn
本实抢得到我校电镜室倪子绵、 陈萍同志的 o n t h e z 4 t h 血 y a ft e r f哪 i o n ( x 3 6
帮助 ,谨此致谢 . 0 0 0 ) · “ t , ` atr ch g r a n u 拢`
参 考 文 献
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T h e y w e r e f u s e d w i r h t h e s p l、 e r o p l a s t s o f 石 , OC l i ( C m
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b y P o ly e t h y l e n e g ly e o l ( P E G ) m e t h o d
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