全 文 ：·专题综述· 北方园艺２０１１（２３）：１９０～１９２
作者简介：蹇黎（１９７８－），女，博士，副教授，研究方向为生物化学与
分子生物学。
基金项目：国家自然科学基金资助项目（３９７７０９０３）；贵州省教育厅
自然科学研究资助项目（２００７０８２）。
收稿日期：２０１１－０９－２６
ＩＳＳＲ 和 ＳＲＡＰ标记技术在兰花植物
种 质 资 源 研 究 中 的 应 用
蹇 　 黎
（毕节学院 地理与生命科学系，贵州 毕节５５１７００）
　　摘　要：分子标记技术在兰花种质资源的亲缘关系鉴定与遗传多样性分析、分子遗传图谱的
构建与目的性状基因的标记定位、基因库的构建和基因克隆、辅助育种选择及品种纯度鉴定等研
究领域被广泛利用与推广。现从简单重复序列间扩增（Ｉｎｔｅｒ－ｓｉｍｐｌｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｒｅｐｅａｔ，ＩＳＳＲ）和相关
序列扩增多态性（ＳＲＡＰ）分子标记技术的基本原理、方法、特点以及在兰花植物种质资源的遗传
育种中的应用现状和前景进行了综述与探讨。
关键词：ＩＳＳＲ；ＳＲＡＰ；兰科植物；应用
中图分类号：Ｑ　９４３　文献标识码：Ａ　文章编号：１００１－０００９（２０１１）２４－０１９０－０３
　　兰花（ｏｒｃｈｉｄ）一般是指具有观赏价值兰科
（Ｏｒｃｈｉｄａｃｅａｅ）植物的总称，是有花植物中最大科之
一［１－３］。中国是兰属植物资源分布中心之一，野生兰花
资源和栽培兰花资源极为丰富，几乎遍及全国各地，共
有１７３属１　２００余种，占总兰科植物的１／６［４］。兰花不
仅具有观赏价值，而且还具有很高药用价值和经济价
值。但不同的兰科植物的形态特征及生物特征具有很
大的差异，再加上兰花植物资源的保护研究以及资源
的有效合理利用与推广未实现高效一体化，因此，解决
这些问题必须借助于先进的研究技术与方法。
分子标记是继形态学标记、生物化学标记以及细
胞学标记之后发展起来的一种直接反应遗传物质
ＤＮＡ水平多态性的一种遗传标记，具有基因组变异丰
富、标记数量多、目标基因的表达不受生物的发育阶段
及环境影响、检测手段方便快捷、成本较低等特点，已
成为资源系统鉴定与种质资源育种研究的最高效的手
段之一。ＩＳＳＲ（Ｉｎｔｅｒ－ｓｉｍｐｌｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｒｅｐｅａｔ，简单重复
序列 间 扩 增）和 ＳＲＡＰ（相 关 序 列 扩 增 多 态 性，
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ—ｒｅｌａｔｅｄ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）都是基于
ＰＣＲ标记系统的一种新型的显性分子标记技术。
ＩＳＳＲ是在微卫星基础上发展起来［５］，结合了简单重复
序列（Ｓｉｎｇｌｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｒｅｐｅａｔ，ＳＳＲ）标记技术和随机引
物扩增多态性 ＤＮＡ（Ｒａｎｄｏｍ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ
ＤＮＡ，ＲＡＰＤ）标记技术的优点，其引物不但能在种间
通用，而且更能揭示物种间的多态性，其检测手段非常
方便快捷。ＳＲＡＰ综合了ＲＡＰＤ和ＡＦＬＰ的高效、重
复性好、便于目标基因的克隆与测序等诸多优点［６］。
ＩＳＳＲ和ＳＲＡＰ标记技术现已广泛应用于兰花种质资
源的亲缘关系鉴定与遗传多样性分析、分子遗传图谱
的构建与目的性状基因的标记定位、基因库的构建和
基因克隆以及育种辅助选择与品种的纯度鉴定等方面
的研究。现从以上几方面来综述ＩＳＳＲ与ＳＲＡＰ分子
标记技术在兰花植物种质资源研究中的应用现状，并
对其资源更合理高效的保护和利用进行探讨。
１　ＩＳＳＲ与ＳＲＡＰ原理及特点
ＩＳＳＲ与ＳＲＡＰ分子标记技术是检测种质资源间
（内）的基因片段差异性最高效、最理想的遗传标记
方法。
１．１　ＩＳＳＲ分子标记
ＩＳＳＲ分子标记是在微卫星基础上发展起来的一
种显性遗传标记，结合了ＳＳＲ和ＲＡＰＤ标记的优点，
是在不用知道ＳＳＲ两端的碱基序列的基础上添加２～
４个随机核苷酸，在ＰＣＲ反应过程中，此引物既保证了
锚钉序列的位点的退火温度，也可以减少其它靶点的
退火几率，对基因组片段的差异进行检测，其扩增产物
在经过电泳分析进行多态性分析。ＩＳＳＲ标记技术具
有其引物可在种间通用、稳定性好、多态性高、无需知
道ＳＳＲ靶标序列信息、重复性好、易操作、快捷方便、成
本低等诸多优点。不足之处在于不同引物及不同材料
间ＰＣＲ扩增反应最佳条件可能也不尽相同；很难区分
显性纯杂合基因型。目前，许多兰花品种均建立和优
化了各自最适的ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系。
１．２　ＳＲＡＰ分子标记
ＳＲＡＰ分子标记是一种结合了 ＲＡＰＤ、ＡＦＬＰ、
ＲＦＬＰ等分子标记优点并克服其缺点的ＰＣＲ标记系统
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北方园艺２０１１（２３）：１９０～１９２ ·专题综述·
的显性新型标记，是通过独特的双引物（１７ｂｐ上游引
物和１８ｂｐ下游引物）设计对启动子或内含子区域进
行特异扩增，其引物具有通用性。该标记是建立在不
同种质资源的启动子、内含子与间隔区长度的不同而
致使其种间和种内表现出明显的多样性。ＳＲＡＰ分子
标记具有多态性高、重复性好、易操作、快捷方便、成本
低、在基因组中分布均匀、易对特定序列进行测序与相
关基因的克隆等诸多优点。
２　ＩＳＳＲ与ＳＲＡＰ技术的应用
ＩＳＳＲ与ＳＲＡＰ分子标记技术与其它分子技术及
传统的常规遗传标记相比较而言，更具有诸多优点，现
今在兰花种质资源的研究中得以广泛应用。
２．１　遗传多样性研究
植物遗传多样性一般是指种间或种内的不同个体
的遗传差异之和，是物种生存适应与发展进化的基本
特征及物种长期进化演变的产物。研究物种的遗传多
样性可以了解与其生长环境之间的关系，采取科学高
效的措施保护濒临物种遗传资源基因，认识生物多样
性的起源与进化，同时也根据资源的ＤＮＡ指纹图谱和
各个目标性状间的多样性，使其植物种质资源更能合
理高效的利用。赵谦等［７］采用ＩＳＳＲ标记技术分析了
１４个蝴蝶兰品种间的遗传关系，结果显示，１４个引物
共扩增出１７９条带，其中多态性条带１４７条，多态性条
带比率为８２％，表明品种间存在着丰富的遗传多样性。
郑玉红等［８］利用ＩＳＳＲ和ＲＡＰＤ分子标记技术在不同
君子兰品种遗传多样性的应用，结果表明，１０条引物
共扩增出６５个位点，平均每条引物扩增出６．５个位
点，其中５４个多态性位点，多态百分率为８１．９５％。吴
振兴等［９］对兰属（Ｃｙｍｂｉｄｉｕｍ）植物ＩＳＳＲ遗传多样性
分析，１５个引物共扩增出８３６条带，其中有２２７条多态
带，多态百分比为２７．２％。孙小琴等［１０］采用ＩＳＳＲ分
子标记对江西省寒兰（Ｃｙｍｂｉｄｉｕｍ　ｋａｎｒａｎ　Ｍａｋｉｎｏ）的
遗传多样性进行了分析，１２条ＩＳＳＲ引物共得到１２３
个位点，其中多样性条带为９７位点（多态性条带百分
率为７８．９％）。高丽等［１１］采用ＩＳＳＲ对湖北野生春兰
资源遗传多样性分析，１１个引物共检测到１２７个位点，
其中１１２个为多态位点，占８８．１９％，表明春兰具有丰
富的遗传变异。马佳梅等［１２］利用ＩＳＳＲ对西双版纳地
区流苏石斛遗传多样性分析，１２个引物共检测出１１７
个位点，其中１０５个为多态性位点，多态性比率为
８９．７４％。Ｗａｎｇ　Ｈ　Ｚ等［１３］利用ＩＳＳＲ对春兰的遗传变
异及品种的鉴定，１９种ＩＳＳＲ引物共检测出２３９个位
点，多态性比率为９９．１６％。Ｌｕ　Ｊ　Ｊ等［１４］利用ＩＳＳＲ对
１５１个墨兰品种的遗传多样性和群居结构进行分析，
１８个引物共扩增出１４　４７８条带纹，每种引物在所有材
料间均遗传多样性，比率为１００％。赖鋆英［１５］利用
ＳＲＡＰ分析了大花蕙兰植物学形态特征及遗传多样
性，结果表明，２９对ＳＲＡＰ引物组合共扩增出４２８条谱
带，其中４２１条为多态带，多态性比例为９８．３％。周艳
霞等［１６］利用ＳＲＡＰ标记分析文心兰部分种质资源的
遗传多样性，１９个引物组合，共产生２７７条多态性条
带，平均每个引物组合产生１４．６个多态性条带。何俊
蓉等［１７］对１３个国兰品种遗传关系进行ＳＲＡＰ分析，
表明５７对ＳＲＡＰ引物，共扩增出７４６条带，其中有７３８
个多态性位点，总的位点多态性比率为９８．９％，平均每
对引物组合产生的位点数为１３个位点。任羽等［１８］利
用ＳＲＡＰ技术对海南省９种石斛种质资源的遗传多样
性及亲缘关系进行了分析，１８对多态性引物共获得
２８５条多态性带，平均每个引物产生１５．８个多态性条
带。蹇黎等［１９］对寒兰品种类型的ＳＲＡＰ分子鉴定，表
明１１对引物共扩增出５８６条带纹，其中５０４条为多态
性，比率为８６．０１％。樊洪泓等［２０］利用 ＳＲＡＰ 和
ＲＡＰＤ　２种分子标记技术对９份石斛种质进行遗传多
样性研究，表明４０对ＳＲＡＰ引物组合共扩增条带
１　９７７条，多态性比率为９０．２％。
２．２　亲缘关系及系统分类研究
ＩＳＳＲ和ＳＲＡＰ分子标记技术能有效的确定兰科
植物种植资源间的亲缘关系及品种间的遗传距离，进
而可以划分杂交种优势群，提高兰花育种效率。严华
等［２１］对３８种国兰亲缘关系进行ＩＳＳＲ标记技术分析，
表明遗传相似系数为０．５８时，供试材料可以分为２
组。赵谦等［７］利用ＩＳＳＲ在１４个蝴蝶兰亲缘关系分析
中的初步应用，鉴定了２２个蝴蝶兰品种／品系在遗传
距离Ｌ＝０．２５４处可分为８个组，品种间的遗传相似系
数范围在０．７３４～０．９３６间，证实部分蝴蝶兰品种间存
在显著的遗传分化。李敏等［２２］利用ＩＳＳＲ技术分析１６
个蝴蝶兰品种的亲缘关系，表明来源于不同地域的１６
个品种在遗传距离Ｌ＝０．２２２５处可分为２个类群。
Ｗａｎｇ　Ｈ　Ｚ等［２３］利用ＩＳＳＲ技术对３１个密花石斛进行
系统学和分子鉴定分析，可将供试材料分为６组群。
Ｗａｎｇ　Ｈ　Ｚ等［１３］利用ＩＳＳＲ技术对春兰的遗传多样性
及亲缘关系进行分析鉴定了品种间的亲缘关系远近。
蹇黎等［１９］利用ＳＲＡＰ分子对寒兰品种类型进行了亲
缘关系分析。樊洪泓等［２０］利用ＳＲＡＰ和ＲＡＰＤ　２种
分子标记技术对９份石斛种质进行遗传多样性及亲缘
关系研究。任羽等［１８］利用ＳＲＡＰ技术对海南省９种
石斛种质资源的遗传多样性及亲缘关系进行了分析。
杨春勇等［２４］利用ＩＳＳＲ标记对人工栽培的石斛进行了
遗传多样性分析和亲缘关系分析。
２．３　品种及种质资源鉴定
ＩＳＳＲ标记技术和ＳＲＡＰ技术能快速高效的对兰
花品种及种质资源进行鉴定。沈颖等［２５］用ＩＳＳＲ技术
对９种石斛属植物进行鉴定分析，７个引物能扩增出
多态性带纹，其中 ＵＢＣ８０７和 ＵＢＣ８６４具有多态性比
率最高，均可以将所有的品种区分。杜富荣等［２６］
用ＩＳＳＲ标记分析不同地区紫茎泽兰群的遗传变异，１２
条引物能有效将所有材料区分开。周艳霞等［２７］对文
心兰种质的ＳＲＡＰ分析，１９个引物能有效将品种
区分。
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·专题综述· 北方园艺２０１１（２３）：１９０～１９２
２．４　遗传图谱的构建
通过构建兰花植物种质资源的遗传图谱来显示其
特异基因或遗传标记的相对位置，为系统研究兰花资
源基因组和特异基因的定位克隆提供理论依据。利用
ＩＳＳＲ技术和ＳＲＡＰ技术构建兰花ＤＮＡ指纹图谱已得
到广泛应用。张芬等［２８］利用ＳＲＡＰ建立兰花指纹图
谱。赵谦等［７］利用ＩＳＳＲ在１４个蝴蝶兰亲缘关系分析
中的初步应用，构建了材料的指纹图谱，并检测出１９
条品系特异性条带，扩增片段大小变幅在２００～
１　７００ｂｐ之间，其中４　７４７得到的品系特异带纹最多。吴
振兴等［９］利用ＩＳＳＲ对兰属植物构建了指纹图谱，扩增的
总带纹变幅１５～８１个不等，其中ＵＢＣ８１１扩增的多态性
带数最多（２６条），ＵＢＣ８２７扩增的带纹数最少（１条）。
３　结语
目前，虽然兰科植物种质资源的保护和育种技术
在不断的发展，新的兰花品种也在不断的育成，但这仍
不能满足国内外花卉市场的需求。在兰花植物种质资
源研究方面，随着分子标记技术的完善与发展，该技术
不但能够准确的鉴定、评价和发掘兰科植物种质资源
的优异特异性状基因，加快兰花品种的培育、兰花特异
基因的克隆、资源的遗传多样性及亲缘关系的鉴定，还
能够高效合理的利用和创新优质种质资源，改良其花
色、香、型等多种农艺性状来丰富兰花种质资源的遗传
基础。综上所述，ＩＳＳＲ和ＳＲＡＰ分子标记技术均具有
操作简便、重复性强、引物通用、多态性好及成本低等
诸多优点，但只是应用到部分兰科植物种质资源遗传
多样性及亲缘关系等方面的基础研究。因此，只有将
分子标记技术融入到育种中才能培育出观赏价值高和
药用性状强的优质优良新品种。
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