全 文 ：鱼丝丝塑述竺鱼卫业些些坠更`贝竺丝鱼弹 ehn c ol卿2 002 , 10 (4 ) 3 12~ 3 16
· 研究论文 ·
A 28t 四0 8 0 基因可能参与了拟南芥盐代谢的调节 *
刘 康 ` ,2 陈 咖 ’ ,2 陈 静 ’ , 2 王学臣 ’ ,*2 *
( 1
.中国农业大学生物学院 , 北京 10 009 4 ; 2 . 中国农业大学植物生理生化国家重点实验室 ,北京 10 09 4)
摘要 : 为进一步阐明植物盐代谢机理 , 以哥伦比亚生态型 ( C O lu m b ia ytP e) 野生拟南芥 (A用石诚拼括功日从劝月 )及其盐敏感
突变.体 ( sa h voe ir y se ns iivt eZ
, 胡心 )为材料 , 50
~ 比 卜泊C I处理 3 d
,利用 m R N A 差异显示技术分离得到了只在野生型拟南
芥中表达 , 而在 s 。心突变体中不表达的一个未知功能的 A晓四08 0 基因片段 D D巧 6 。 序列同源性分析表明, 它是一类大的蛋
白家族 A A A A T p as e (A Tp a se as so ic aet d ot a v iar e yt of c el lu ar ` t iv iet s) 中的一员。 N o hrt enr bl ot 显示 ,随着N ac l处理浓度的升
高 , 该墓因在野生型拟南芥中的表达量增加 。 而在 ,侧忍突变体中 , 该基因的表达一直处于很低水平 。 这是首次发现 A A A
A T Pas e 与植物的盐代谢有关 。 进一步研究发现 ,线粒体细胞色素氧化酶活性的变化 , 也与该基因在野生型和 `创泛突变体中的
表达呈密切相关 ,表明该基因的编码产物可能参与了拟南芥线粒体细胞色素氧化酶活性的调控。
关键词 : 拟南芥 ; m RN A 差异显示 ; 盐胁迫 ; c DN A
A tZJ 夕卯8 0 G e n e M ay B e ln v o l v e d in R e gu lat ion
o f S a lt M et ab
o l i s m in A l ’a b1’c oIP is ht 月iI 功 a
L i u K a n g ,津 C h e n j i a` 2 C h e n j in g` 2 W a n g X ue e h e n l夕* *
( 1
.
C o ll e ge o f B i o fo ig e ia S e i en e e s
,
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iyt, B iej i n g l0() 0 94
,
C hi n a ;
2
.
S t at e K e y 助b o art o yr o f Pl an t Ph y s i o l o gy a n d B io ch e m i sytr , C h i n a A hg e u 1ut I’a l U n 1v esr iyt, B e ij i n g 10 0094, C h ln a )
人加的以: ih o r d e r ot e却l a in ht e m ce han i sm o f ias t m e at b o l is m in p lan t fu rt h elr % id 月免er n t ial l y e x per s se d ge n e s b e wt e即 iw ld
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e o f e o l切m b i a ytP e an d i ts s众口 (阳 It vo e r ly s en s i tiv e Z) m u t a n t t yP e o f A扭阮帅抽 功月从叨月 w e r e e o m Paer d勿 us in g m RN A
id fe er int al id sP lay et c hn iqu e
.
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,
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s fr a脚 e in 15 a PaI’t o f s e qu e n e e o f A级夕夕口召口 g e n e . S e职cen e an a l y s i s s h o w e d ht at ht i s gen aws a m e m b er o f a Por te i n
企m il y . A A A A冲 as e (A T P as e as so ic a te d ot a v a r ieyt of cel lu ar a c tivit ie s) . N o rt h em bl ot an al iyS s hs o w de ht at ht e e x Per is on 1ve 1 of
A魂四 080 g en e in iw dl t y Pe of A .功日劲叨日加p or ve d iw ht ht e in c er as de c on ce n tr at 1on of as 1t加 a o n e n t , w hi le ht er w a s 加 比v lous
er alt i on s b e幻刃 e en A处四 080 e x P r e s is on lve l an d N aC I ccon e n lt 习 tion in 5 0貂 m ul at n t t yP e . hT is 15 het if srt t im e ot if n d th a t A A A
A T Pas e m ay b e er laet d w iht
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.
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e o n tr o l ht e a e t lv iyt o f e yt o e h r o m e ox id a s e o f m i ot e h o n d ir 民
肠叮袱刘 . :注扭七心叩抽 功日从叨月 ; m R N A id fe r e n ti ia id sP aly et c bn iq u e干CR ; ha stI’e ;s c D N A
盐害是影响植物生长的一个重要因素 , 它对农
业的威胁已成为一个全球性的问题 。 在盐胁迫条件
下 , 植物可以通过基因表达的改变调节其相应的生
理代谢过程 , 进而对胁迫作出适应性反应 。为了解植
物盐代谢机理 ,对这些基因进行研究 ,最终为提高植
* 墓金项目 :国家重点墓础研究发展规划 ( G 19 9 01 7 )项目。
刘 康:女 , 19 7 5年生 ,博士研究生。 -E m a il : < 11公an g@m a il .c 叽e du . c>n ·
二联系作者 。 C~
c
etr
·
收稿日期 : 2 0 01 一 12 一04
物的耐盐水平提供理论依据 1[ 。 在植物耐盐机理研
究中 , Z h u 冈以模式植物拟南芥为材料 , 分离得到了
一个拟南芥盐敏感突变体 犯招 , 并以 `。心 和其它拟
南芥盐代谢相关基因为基础 , 建立 了一个植物盐胁
迫信号转导的模式体系。 这个体系的建立 ,为深入了
解植物的耐盐机理提供了帮助 。但在这个体系中, 仍
有许多环节人们不清楚 ,还需要通过发现新基因 、 明
确基因功能等方法来实现 。 在植物逆境信号转导研
究中 , 利用差异显示技术成功地分离出一些植物逆
第 4期 刘 康等 :A g tZ四 0 80基因可能参与了拟南荞盐代谢的调节
境信号 分子或 逆境胁迫 相关蛋 白的报道见 文献
[3 一] 6
。 这些蛋 白在植物的抗逆胁迫中都发挥着重要
作用 。 由 i La ng 和 Pa r de 叨发展起来的 m R NA 差异
显示技术 (D D RT升 PC R技术 , 具有快速 、 简单 、 灵敏
等特点 , 已被广泛用来克隆特异表达基 因。 在本研究
中 , 以野生型拟南荞及其 5 0 52 盐敏感突变体为材
料 , 利用 D D R T 一P C R 技术克隆得到 了一个受盐胁迫
诱导表达的未知功能基因 A 吸夕夕口召口, 并初步探讨
了它在盐代谢中可能的调控作用 , 为揭示植物的耐
盐代谢机理又增添 了新的内容 。
, 材料和方法
,
.
1 植物材料
哥伦 比亚生态型 ( C O l u m b i a tyP e )野生拟 南荞
(月用石汕珍疵 功刁从劝月 ) 及其 盐敏 感 突变体 ( as h
o v e r l y s e n s i it v e Z
, 5 0 52 )种子在 7 0% 乙醇和 1% 次氯
酸钠中分别浸泡 Z m in 和 10 m in , 播种于 M S 培养
基中 , 2 2 ℃ 、 2 4 h 光照培养 , 光强为 9 0 0 0 lx 。 10 d 后
移入含 50 ~
o比 N aC I 的培养基中 , 处理 3 d 。 收获
整株植物 , 液氮中速冻 , 一7 0 ℃冰箱中保存 , 直 至用
于 m RN A 差异显示 。 用于 N o hrt em 杂交的植株 , 经
表面 消毒后 的种子在 M S 培养基中正常生长 10 d
后 , 分别用 0 、 5 0 、 10 0 、 2 0 0 m
o比 N a C I处理 6 h , 液
氮速冻 , 一7 0 ℃冰箱中保存 。
,
.
2 总 R N A 的提取及纯化
拟 南荞总 RN A 的提 取按 照 T R l z o l 试 剂盒
( G BI C O旧 RL 公 司 )的说明进行 。 总 RN A 中加入
10 u 无 RN as e 的 D N as el , 以去除 D N A 污染 。 用苯
酚和氯仿分别抽提后 , 乙醇法沉淀总 RN A 。
1
.
3 m R N A差异显示
m RN A 差异显示采用 iL an g 和 P a r d e el 刀方法 。 反
转录根据 M B I 公 司的 F ir s t S tr a n d e D N A S扣t h e s i s
儿 t 的说 明进行 , R T 引物为 :5’ 一T T T T TT T T T -A 3’,
5
,一
T T T T T T T T T T T G
一
3
’ 和 5 , 一1 ~ 1 1,1 , r l T T I , T T T C 一3 ’ 。
P CR 上游 or 个碱基随机引物共 10 种 , 下游引物与
R T 相 同 。 P C R 程序如下 : 9 4 ℃ , 1 m in 弓 4 0 ℃ , 2
m in 一7 2 ℃ , 3 0 5 , 4 0 个循环斗 7 2 ℃ , 5 m i n 。 P C R 结
束后 , 将产物在 6%测序胶上 电泳 , 银染法观察结
果 ,参照 B r a n t 和 G svat o[ 司的方法 。
,
.
4 差异片段的回收及再扩增
直接从胶上切取差异片段 , 浸于 5 0 卜 L 重蒸水
中, 室温静置 10 m in , 封闭离心管盖煮沸 2 0 m in 后 ,
离心 , 以上清作为模板用于 PC R 再扩增 。 再扩增时
反应体积为 5 0 协 L , 模板量 2 协 L ,其它条件同 P CR
操作 ,再扩增后的产物用于 No hrt e m b lot 探针标记 。
1
.
5 N o rt h e r n b lo t 分析
取 3 0 协 g 总 RN A 进行甲醛变性电泳 , 毛细管
法转移到 H yb o n d . N 十 尼 龙膜上 , 探针标记 按照
p r o m e g a 公 司的 p ir m e 一 a 一 g e n e L ab e li n g 试 剂盒说明
进行 。 杂交方法同常规报道 9[] 。
,
.
6 c O N A差异片段的克隆 、 序列测定及同源性分
析
根 据 P r o me 即 公 司 的 P G EM一 T E a s y V e e ot r
Ssy ot m “ 说明进行差异片段 的克隆。 由上海基康公
司协助测序。 通过 iht e nr et 进入 G e nB a n k lB as t查询
序列同源性 。
1
.
7 细胞色素氧化酶活性测定
线粒体提取方法参照 G en hc i 等 lpr[ 。 在 1 m L 比
色杯中加入 o . l l n L 磷酸盐缓冲液印H .7 0) , .0 07 m L
1% 亚铁细胞色素 C , 0 . 83 m L 蒸馏水和 15 林 g 线粒
体蛋 白 , 至终体积 l m L 。 在 5 5 0 mn 测定光吸收值 ,每间隔 15 8 读数 , 细胞色素氧化酶活性由细胞色素
C 被氧化 的速率决定 , 5A 5。 ( 。 , 5行 2 1卜 m o l C yt C ·
m in
一` ·
m g
,
p r o et i n ) [
, ` ]。
1
.
8 蛋 白质含盘的测定
参照 B ar d fo dr 阅的方法 。 以 B S A 为标准 , 考马
斯亮蓝 G 一 2 5 0 为显色剂 , 测定溶液在 5 9 5 mn 的光
吸收值 ,浓度单位为 林创协 L 。
2 结果和分析
2
.
1 拟南芥差异条带的获得
以拟南芥野生型及 ` 。貂盐敏感突变体为材料 ,
5 0
~
o比 N a CI 处理 3 d 后 , 进行 m RN A 差异显
示 。 3 种锚定引物和 10 种随机引物 , 共 3 0 种引物组
合 , 共得到 80 条差异条带。 有 34 条只在突变体中表
达 , 有 4 6 条只在野生型中表达 , 其中的一条命名为
D D 1 5 6 ( 图 1 ) 。
2
.
2 N o rt h e r n b lo t 分析
以编号为 D D 1 5 6 差异片段的第二轮 P C R 产物
为探针 ,进行 N o hrt 晚 bl ot 检测 , 证实该基因只在野
生型拟南荞中有阳性杂交信号 , 突变型拟南荞中无
杂交信号 ( 图 2 ) 。
对经不 同 N a C I浓度 ( 0 、 5 0 、 1 0 0 、 2 0 0 mrn o比 )处理的野生型拟南荞做 No hrt ern bl ot 分析 , 结果发
现随着 N a CI 处理浓度的升高 , D D 1 5 6 片段的表达
量增加 , 至 2 0 0 ~ 。比 达到最高 ( 图 3 ) 。
34 1农 业 生 物 技 术 学 报 2 002年
ō、髯幽烹幽
D 16 5
一令 -
ll
图 l , 50 n l n l o lL/ N a C I处理 3 d 后
的野生型拟南芥及其 5 0 52 突变体
的 m RN A 差异显示
Fi g
.
l
.
1l l R到A d ife re n t i a l d is P la y o f
w il d tyP
e
an d it
s m u tan t yIP
e u n d e r
5 0 n l n 10 1/ L N a C l t r e a t l n e n t fo r 3 d
箭头所指为 D D 15 6 差异带。
1
,野生型 ; 2 , 5 0 52 突变体 。
T h e a r o w in d ie at e s th e sP e e i if e b an d
D D 15 6
.
1
,
iw ld tyP
e ; 2
, s “ 2 m uatn t t yP e
·
2
.
3 0 0 1 5 6 片段的克隆及序列分析
将 D D 15 6 c D N A 片段直接克隆到 pG EM 一 T 载
体上 , 测序 , 长度为 4 12 b p 。 在 G enB a l l k 中进行序列
同源 性 比较 , 结果发现 , 它 与拟 南芥 编号为
A itZ夕夕口召口基 因的部分序列完全 一致 ( 图 4 ) 。
A吸夕夕口80 的编 码 产 物 为 一 个 大 的 蛋 白家族
A A A
一
ytP
e A T p a s e ( A T P
a s e s a s s o e iat e d t o a v iar eyt
o f c e ll u la r a e t iv it i e s ) 中的一 员 。 与 A t 2 92 9 0 8 0 蛋 白
同 源 性 最 高 的是 来 自豌 豆 的 另 一 种 A A A
A T P a s e
一
F s tH
, 两者同源性达到 7 2% ( 图 5 ) 。
DD1 5 6
图 2 . 野 生型拟南荞和 5哪 2
突变体的 D D 156 片段
N o hrt
e m b lo t 分析
Fi g
.
2
.
N o hrt
e rn b l o t 叭 al y s i s
fo r D D 15 6 w i ld ty P e a n d it s
m l l ta n t ytP
e o f A
I习西诚少 s招
功a ilB n a
1
, 5 0 5 2 突变体 ; 2 ,野生型。 a . 杂交
结果 ; b . 总 R N A 上样量对照。
1
,
50 52 mu
t a l」t ty P e ;
2
,
w i ld tyP
e
.
a
.
N o rt h e m b lo t :
b
.
T o t a l R N A e o n tT o l
.
A t介摺口刀口
DD1 5 6
A t
`尔 勺d s 刀
DD1 5 6
刁 t名彭少9 08 0
DD 15 6
月 t 2 9 2 9朋0
DD1 5 6
沁瓦公牙夕口刀口
DD1 56
月“ 扭分夕口召口
DD1 5 6
刀 t二今拼汐 0召0
c t g a g c a g g t a t t ` a t a ` g t a a a a t c t c a a o g g` t ` c g e a g a a c g a t c t a g a g a a g` t ` a 65
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t e a e t a a t t a t g a e e g g t t e a a g t e t g gg t t t g a a g a g a e t g a g a a gg a c t c a g e c g c 2 6 0
图 4 . D D 15 6 c D N A 序列与拟南芥 A 级夕90 8口基因
序列同源性比较
F ig
.
4
.
1〕N A s e q u e n c e id e n t ity b e 勺刀e en D D 156 a n d A tZJ 夕90 80
g e n e in A 招西心叩 s括 ht a lb n a
图 3 . 不同 N a C I 浓度处理 下野生型拟南芥的 D D 巧6 片段
N o hrt
e m b lo t 分析
Fi g
.
3
.
N o hrt
e m b lo t an
a ly s is o f D D 1 56 in w i ld tyP
e o f
月招厉d叩51 tb a l抽刀 a un d e r d ife re n t N a C l tre atln e n t
a , N o hrt
em b lo t : b
, 总 R N A 上样量对照 。 ` N o rt he rn b lo t an ly s i s o f
D D 1 5 6; b
,
T o t a l R N A e o n tr o l
.
l
,
0 n u l l o lL/ N
a C I; 2
,
5 0 m r n o lfL N
a C I:
3
,
10 0 r n r n o比 N a C I; 4 , 2 0 0 r 田1 0比 N a C I .
2
.
4 细胞色素氧化酶活性测定
用 0一3 0 0 ~
o比 N a C I 处理 野 生型和 5 0 52 突
变体拟南荞 6 h ,分别提取它们 的线粒体 ,测定其细
胞色素氧化酶活性。 在野生型拟南芥中 , 随着 N a CI
处理浓度的升高 (0 佗0 0 r n r n o F )L , 其细胞色素氧化
酶活性逐渐增强 , 直至 2 0 0 们n们n o比 达到最大 。 继续
升高盐浓度至 3 0 0 ~ O F L
, 细胞色素氧化酶活性有
所降低 。 而在 5 0 52 突变体中 , 其细胞色素氧化酶活
性与 N a C I 浓度变化没有明显关联 。 并且 5。貂 突变
体细胞色素氧化酶的活性始终低于野生型细胞色素
氧化酶的活性 。 以上这些趋势 , 与 A tZJ 夕9 0 8 0 基因在
野生型和 5 0 52 突变体拟南荞中转录水平变化相一
致 ( 图 6 ) 。
3 讨论
第 4期 刘 康等 :A i tZ夕9 08 0基 因可能参与了拟南芥盐代谢的调节 3 1 5
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雪里套
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之氢忌
昙皇会
手l丢
二二二
瓣黔辫访撬瘫滋蟾翰瓣滋扩` ” 昙呈二aTtK犯称砚 r时曰
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图 5 .拟南芥 A itZ夕 908口基因与豌 豆 sF tH基因编码氨基酸的序列同源性比较
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Th e b la e k Par’ t i n di e a t e s sam e s e qu e n e e s ; Th e sh a d o w Part in di e a te s sim i lar s e q u e n e e s .
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图 6.不 同 N a CI 浓度 (0一 30 ~ o比 )处理后的细胞色素氧化
酶活性的比较
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随着拟南荞大规模测序工作完成 , 它的全序列
基 因图谱 已公布于众 ,但在这些基 因中 , 已知功能的
基因占很小一部分 , 尚有 9 0%基 因的功能未知 , 需
要 对它 们 做进 一 步研 究 。 本 实 验克 隆得 到的
A itZ绍 908 0 基 因片段 , 从它的氨基酸序列特点分析 ,
具有 A A A A T P as e 的保 守序列 区 , 因此推测 它属于
此蛋 白家族。 但有关这个基因功能的研究尚未见报
道 。 A A A A T P as “ 是一 类大的蛋 白家族 , 家族成员中
都有一个或者两个 23 0 个氨基酸左右 的保守序列
区 , 它们通过水解 A T P 释放能量 , 执行诸如水解蛋
白 、 调控基 因转录等功能 , 它们对于细胞周期调控 、
膜泡运输 、过氧化物酶体构建 、维持线粒体功能等细
胞生命活动都是必不可少的 l3[J 。 近年来 , 有关它们功
能的研究已越来越引起人们 的注意 。 但有关它们 与
植物盐代谢的关系 ,还未见相关报道 。 在本实验中 ,
A t电 2夕08 0 基 因在野生型拟南荞中 , 随着 N a CI 处理
浓度的升高 , 其转录水平的表达随之增加 , 这提示 ,
A itZ夕9 0 8 0 基因是 一种 受盐胁迫诱导表达 的基因 。
这是首次发现 A A A A T P as e 蛋 白与植物的盐代谢
有关 。
序列同源性分析表明 , A itZ夕夕0 8口的编码产物
与来 自豌 豆 的一个线粒体 A A A 金 属蛋 白酶 R s H
(A F3 9 7 9 0 3) 同源性很高 , 可达 72 % 。 豌豆的此种蛋 白
在功能上与酵母 的 m 一A A A 蛋 白酶相 同 , 可在呼吸
作用 中发挥调控作用 。 酵母 的 m ~ A A A 蛋 白酶是一
种依赖 A T P 的线粒体内膜蛋 白酶 。 可降解线粒体内
的非天然蛋 白 , 如未折叠的细胞色素氧化酶问 。 缺少
m
一
A A A 蛋 白 , 这 些非天然蛋 白就会累积在线粒体
农 业 生 物 技 术 学 报 20 02 年
内, 妨碍线粒体执行正常的生理功能 。 eH派 等阅
的研究表明 , 酵母的 m . A A A 蛋白酶可 以促进线粒
体细胞色素氧化酶基因的拼接和编码蛋 白 , 以及
A T P 的合成 。 缺少 m 一A A A 蛋白酶 , 酵母的细胞色素
氧化酶基因的转录会受到损害。在我们的实验中 , 野
生型拟南芥的细胞色素氧化酶活性变化趋势与
D D 15 6 片段的转录趋势呈现正相关 , 即随着盐胁迫
浓度的升高 , 细胞色素氧化酶活性亦增强 。 在 ` 侧泛
突变体中, 其细胞色素氧化酶活性并未呈现这 一趋
势 ,并且始终低于野生型细胞色素氧化酶的活性 ,这
也与 ` 。心 突变体的 D D 156 片段的转录结果相一
致 。 推测拟南芥 A魂四08 0基因可能与豌豆线粒体
的厂坛万基因功能类似 ,也参与了细胞色素氧化酶活
性的调控。
植物的呼吸作用主要 以细胞色素途径为主 , 细
胞色素氧化酶是最主要的末端氧化酶 , 是线粒体内
膜的标志酶 。 与其它电子传递途径相比 ,传递相同的
电子 , 细胞色素途径相伴随的+H 的转运要多得多 ,
为生物体能提供的 A作 也多lq[ 。 oR bert 和 H an sl ,的
研究表明 , 植物在盐胁迫下 , 其电子传递速率和细胞
色素氧化酶活性都有所增强 。植物在盐胁迫条件下 ,
需要消耗额外的能量来维持正常的生长发育 ilf[ , 这
些额外的能量主要用于合成有机渗透溶质 , 离子主
动吸收 、运输与区域化分配 , 以及盐诱导的代谢变化
等l1M , 这是植物体一种积极的代谢反应 。 拟南芥的
s侧忍盐敏感突变体是否因为 A 级卯卯80 基因表达的
改变 ,影响了其正常的能量供应 ,进而减弱了其对盐
胁迫的适应 , 还需要通过转基因实验加以验证 。 目
前 ,这部分工作正在进行中。
致谢 : 本实验中的拟南荞盐敏感突变体 胡心 由 A对z o n a
大学朱建康博士提供。
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