全 文 ：基金项目：国家自然科学基金“玉米Pto基因的克隆及其调控网络解析”（30700433）。
第一作者简介：邹华文，男，1973年出生，江苏邳州人，副教授，博士，研究方向为植物逆境分子生物学。通信地址：434025湖北省荆州市长江大学农
学院，Tel：0716-8066652，E-mail：zouhuawen73@hotmail.com。
收稿日期：2010-03-08，修回日期：2010-04-19。
玉米ZmPti1在转基因拟南芥中的亚细胞定位
邹华文 1，肖 雪 2，李翠花 1
(1长江大学农学院，湖北荆州 434025；2暨南大学医药生物技术研究开发中心，广州 510632)
摘 要：Pti基因不但在植物的抗病信号传导中起着非常重要的作用，而且玉米中一个类Pti1基因——
ZmPti1还参与了植物抗盐的信号传递。为研究ZmPti1在植物体内亚细胞水平上的分布情况，进而对
ZmPti1基因功能提供更全面的信息，利用绿色荧光蛋白基因(GFP)为报告基因，分别构建了以35S为启
动子表达 ZmPti1-GFP融合蛋白和 GFP游离蛋白的植物表达载体 pGreen0029-35S∷ZmPti1-GFP和
pGreen0029-35S∷GFP。构建好的植物表达载体首先转化感受态的农杆菌菌株GV3101，再通过花浸蘸
法侵染拟南芥，结果得到62株转基因拟南芥株系。在共聚焦激光扫描显微镜下观察ZmPti1在转基因拟
南芥细胞中的定位。结果表明：ZmPti1是一个可溶性蛋白，定位在细胞质内。
关键词：玉米；拟南芥；ZmPti1；亚细胞定位
中图分类号：S184 文献标志码：A 论文编号：2010-0655
Subcelluar Localization of Maize ZmPti1 in Transgenic Arabidopsis
Zou Huawen1, Xiao Xue2, Li Cuihua1
(1College of Agronomy, Yangtze University, Jingzhou Hubei 434025;
2Biopharmaceutical R&D Center of Jinan University, Guangzhou 510632)
Abstract: Pti1 gene plays an important role in plant disease resistance signal transduction. One Pti1-like gene
ZmPti1 participates in the salt resistance signal transduction, as well. To determine the subcelluar localization
of ZmPti1 so as to make clearer of the ZmPti1 function, the green fluorescent protein (GFP) was used as a
reporter gene to construct the plant expression vectors pGreen0029-35S∷ZmPti1-GFP and pGreen0029-
35S∷GFP. The 35S promoter was used to drive the gene expression of ZmPti1-GFP fusion protein and pure
GFP protein. Firstly, the two vectors were transformed into competent Agrobacterium strain GV3103,
respectively. Then, Arabidopsis was infected by transformed Agrobacterium via floral dip method. After
tansformation 62 transgenic Arabidopsis lines were got. Subcellular localization of ZmPti1 in transgenic
Arabidopsis was determined by Confocal laser scanning microscopy. Results showed that ZmPti1 might be a
soluble protein and localize in the cytoplasm.
Key words: maize; Arabidopsis; ZmPti1; subcellular localization
0 引言
在抗病反应中，“gene-for-gene”学说可以很好地
解释植物对病原菌的抗性。该学说认为植物的抗病性
依赖于入侵病原菌无毒基因（Avr genes）产生的一个
“无毒信号”（一种蛋白配体），和植物通过其R基因编
码的一些受体蛋白对这种无毒信号的感受和识别[1-2]。
Pto是R基因的一种，其编码的蛋白Pto可以作为一个
细胞内受体与病原菌无毒基因的编码的AvrPto相互
作用，进而引发植物的抗病性反应[3-4]。用酵母双杂交
的方法筛选在番茄中参与 Pto介导的信号传导蛋白，
结果有10类蛋白与其互作[5]。其中有4类研究的比较
深入，一类是蛋白质磷酸化激酶Pti1，另外3个是转录
因子Pti4、Pti5和Pti6。Pti1可以编码一类丝氨酸/苏氨
酸蛋白激酶，Pti1蛋白序列与Pto蛋白序列有很高的相
中国农学通报 2010,26(14):74-77
Chinese Agricultural Science Bulletin
似性，属于Pto下游的一个组分。Pto可以发生自我磷
酸化，并且可以磷酸化 Pti1，但是 Pti1不能磷酸化
Pto。Pto/Pti1的相互作用可以引起植物的过敏性反
应，过量表达 Pti1的转基因烟草明显提高了对表达
avrPto无毒基因的丁香假单胞杆菌（P. syringae tabaci）
菌株的抵抗能力[6]。
笔者曾从玉米中克隆了一个类Pti1基因（命名为
ZmPti1）(GenBank accession no. AY708048)。半定量
RT-PCR分析显示ZmPti1的表达水平不但受到抗病信
号分子SA的诱导，还受到一些非生物胁迫的诱导，例
如：低温、高盐和甘露醇的诱导；同时，在不同的发育时
期、不同的组织器官内，其表达水平也有很大的差异。
由此推测ZmPti1可能不但参与了生物胁迫的信号传
导途径，而且参与了非生物胁迫的信号传导过程，有可
能作为这两个信号途径的一个“节点”，起着重要的作
用。同时，也很有可能参与了玉米生长发育的调控[7]。
随后的研究发现，在拟南芥中过量表达的ZmPti1株系
明显提高了抗盐性 [8]，显示 ZmPti1基因功能的多样
性。在该研究中，利用绿色荧光蛋白 (Green
fluorescent protein，GFP)基因为报告基因，构建了 35S
启动子控制表达ZmPti1-GFP融合蛋白的植物表达载
体，转化拟南芥，利用共聚焦激光扫描显微镜初步研究
ZmPti1在转基因拟南芥亚细胞水平上的分布。为深入
了解ZmPti1在体内的生化特性及生理功能奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 拟南芥(Columbia生态型)；过量表达游
离GFP（pGreen0029-35S∷GFP）的纯合体拟南芥株系。
1.1.2 菌株及载体 E.coli DH5α，农杆菌GV3101；中间
载体 pBluescriptKS(+)-ZmPti1-dHA-His6，植物表达载
体pGreen0029-35S∷cDNA-GFP均为本实验室保存。
1.1.3 主要试剂 DNA凝胶回收试剂盒购自杭州
V-gene生物技术公司；DNA限制性内切酶、T4-DNA
连接酶、Ex Taq酶、DNAMarker DL2000+15000购自宝
生物大连有限公司(Takara产品)；其他试剂都是国产
分析纯。PCR引物由北京三博远志生物技术有限公
司合成；DNA测序工作由上海生工生物工程技术服务
有限公司完成。
1.2 方法
1.2.1 ZmPti1基因植物表达载体的构建 在原有的
pBluescriptKS(+ )中间载体上，含有 pBluescriptKS
(+)-ZmPti1-dHA-His6片段，在构建植物表达载体的过
程中，首先用BamHⅠ/StuⅠ双酶切上述质粒释放仅含
有ZmPti1 cDNA序列的片段。同时以本实验室的带
有外源基因的表达载体pGreen0029也用相同的酶切，
去除插入的外源基因，回收载体片断，2种回收产物通
过 T4-DNA连接酶连接，构建成强启动子CaMV 35S
控制下的表达载体 pGreen0029-35S∷ZmPti1-GFP。
连接体系4℃反应24 h后转化E. coli DH5α，转化后挑
取阳性克隆提质粒酶切验证，酶切验证正确的菌液送
至上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。
1.2.2 ZmPti1基因的拟南芥转化 正确连接的质粒用
冻融法转化农杆菌GV3101，转化后的农杆菌用花浸
蘸法[9]转化拟南芥。
1.2.3 转基因拟南芥的 PCR分子检测 转化拟南芥T0
代的种子经消毒后播在含卡那霉素(浓度为50 μg/L)的
MS培养基上进行筛选，挑选在抗性培养基上正常生
长的拟南芥植株提取基因组DNA，以DNA为模板，以
ZmPti1片断内部的一对特异引物做PCR鉴定。
1.2.4 转基因拟南芥叶片原生质体分离纯化 直接取室
外培养的拟南芥叶片，先进行表面灭菌，70%乙醇浸泡
5 s，无菌水冲洗2次，再以2%次氯酸钠浸泡10 min，无
菌水冲选3~4遍，把灭菌的叶片放至培养皿中，用小解
剖刀、镊子撕下表皮及去叶脉，叶片在蒸馏水中切成细
丝，后捞起放入酶解液中，封盖。黑暗振荡培养，保持
27℃，酶解12~24 h，振速为50~60 r/min。中间检查原
生质体游离的情况，并及时收获原生质体。
将酶解细胞液过∮50 μm不锈钢滤网，水平离心
1200 r/min，3 min，小心吸去上清，用 0.5 mol/L甘露醇
悬浮原生质体，洗去酶液；后将25%蔗糖直接加入悬浮
液底部，水平离心1200 r/min，10 min，形成糖与醇清晰
界面后小心从糖与醇界面上吸出原生质体层，以备镜
检。
1.2.5 荧光显微镜观察 用Leica体式显微镜观察T1代
各转基因株系在根、茎、叶及花内的荧光表达情况。通
过GFP2通道观察叶绿素自发荧光和GFP荧光，将表
达量高的株系继续筛选至T2代纯合株系，用于制备原
生质体，共聚焦激光扫描显微镜检测。
1.2.6 共聚焦激光扫描显微镜检测 吸取少量分离的根
尖或叶肉原生质体滴在载玻片上，指甲油封片后镜
检。在TCS-SP2共聚焦激光扫描显微镜40×63水镜下
扫描成像，激发光波长为488 nm和568 nm，通过FITC
滤光器和TRITC滤光器分别观察并收集叶绿素荧光
和GFP荧光。采集图片后用CLSM自带软件LCS Lite
进行图形叠加，用Photoshop7.0进行图像处理。
试验于2006年2月开始，2008年5月结束，主要在
长江大学农学院完成，部分试验在北京农林科学院生
物中心和首都师范大学进行。
邹华文等：玉米ZmPti1在转基因拟南芥中的亚细胞定位 ·· 75
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KpnⅠ
ApaⅠ
XhoⅠ
Sa1Ⅰ
CLAⅠ
HindⅢ
EcoRⅤ
EcoRⅠPstⅠStuⅠ
SacⅡ
NOS-KAN
Bg1Ⅱ
Bg1Ⅱ StuⅠ SacⅠ SacⅡNotⅠ
XbaⅠ
ZmPtil
NcoⅠBamHⅠ
H3
LB
1
pSa ori
GFPpGreen0029-35S∷ZmPtil-GFP
About 7400bp
NOS
NptⅠ
RB
35S
2 结果与分析
2.1 ZmPti1基因植物表达载体的构建
取BamHⅠ/StuⅠ酶切回收后的的ZmPti1 cDNA
片段和含有 35S启动子的 pGreen0029载体片段，按照
大约3:1的分子比在T4-DNA连接酶催化下连接，构建
好的载体如图 1。连接体系转化大肠杆菌后，挑阳性
克隆提质粒。对 pGreen0029 载体框架和 ZmPti1
cDNA片段分别进行酶切图谱分析后，选择内切酶Bgl
Ⅱ和EcoRⅤ分别做单酶切验证。结果如图2所示，所
得的酶切片段与期望值完全一致，初步证明已经连接
成功。随后把相应的质粒进行测序，做进一步验证，测
序结果确认了重组质粒的正确性(测序图未显示)。
2.2 转基因拟南芥的分子鉴定
参照Steven介绍的浸花法转化拟南芥，收集转化
当代的种子，在含卡那霉素50 μg/L的MS抗性筛选培
养基上初步筛选出阳性株系。能够在卡那抗性培养基
上存活并保持旺盛的生命力的植株初步认为是转基因
株系，未转基因的株系在卡那抗性筛选培养基上不能
正常生长，并逐渐黄化死去。卡那抗性培养基上的筛
选情况见图3所示，共筛选得到62个转ZmPti1融合基
因株系。
为了排除抗生素筛选过程中的假阳性，需要对抗
生素初步筛选的抗性植株做进一步的分子检测。在抗
性培养基上正常生长的T1代幼苗被转移到土壤中，待
植株充分长大，有足够叶子时，取 2~3片幼嫩的叶子，
提取总DNA，并以 ZmPti1基因的特异引物进行 PCR
扩增。为了避免非特异性扩增，反应的 2条引物分别
来自目的基因和 gfp融合片段，以含有相应插入片段
的质粒模板做阳性对照，以野生型拟南芥基因组DNA
模板（WT）和水为阴性对照。结果如图4所示，野生型
植株和水都没有扩增出相应条带，而大多数转基因株
系可以扩增出与阳性对照相同大小的片段，并且此片
段符合预期大小，初步说明成功地进行了ZmPti1基因
的拟南芥转化。
2.3 转基因株系的共聚焦激光扫描显微检测
为了得到显著的试验结果，笔者首先用Leica体式
荧光显微镜筛选荧光表达强的转基因株系。在所有
PCR检测呈阳性的转基因株系中，以荧光显微镜下筛
选得到表达最强的 1个转基因株系为材料，剪去新鲜
的叶片并切成细丝，置酶解液中过夜酶解，得到原生质
体，随后对原生质体进行荧光观察。结果显示，在转游
离GFP的叶肉细胞原生质体中（图5A），胞浆内的GFP
绿色荧光分布均匀，而在转融合蛋白ZmPti1-GFP的叶
图1 构建后的ZmPti1植物表达载体示意图
M：DNA Marker；1：BglⅡ；2：EcoRⅤ。
图2 植物表达载体的酶切鉴定
M 1 2
5000bp
2500bp
2000bp
1000bp
750bp
图3 抗生素筛选获得的转基因阳性株系
M：DNA Marker；1~12：transgenic lines；
13：pGreen0029-ZmPti1-GFP质粒；14：WT；15：ddH2O。
图4 转pGZmPti1-GFP拟南芥的PCR检测
2500bp
2000bp
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
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肉细胞原生质体中，荧光信号在叶绿体和液泡内均未检
测到，荧光主要分布在胞浆内，且在胞浆内分布不均匀，
推测该蛋白为可溶性蛋白，定位在细胞质内（图5B~D）。
3 结论与讨论
蛋白质是细胞生命或从过程中生物功能的具体执
行者，同时蛋白质在细胞器中的定位对于阐明其功能
A：叶肉原生质体内稳定表达游离GFP的扫描图像；B~D：叶肉原生质体内稳定表达ZmPti1-GFP融合蛋白的扫描图像，其
中B示GFP荧光；C：叶绿素自发荧光，D：GFP荧光、叶绿素荧光图像的叠加图像。
图5 共聚焦激光扫描显微镜下ZmPti1-GFP在叶肉原生质体内的定位情况
具有重要意义，因此，对蛋白质进行亚细胞定位是研究
其功能必不可少的环节之一。现有的研究表明植物类
Pti1激酶拥有不同的生物化学特性、生物学功能、亚细
胞定位等[10-11]。番茄Pti1（SlPti1）是一个定位于细胞质
的可溶性蛋白，并且具有体外自我磷酸化活性，参与植
物抗病反应 [5]。烟草中有 3个与 SlPti1高度同源的蛋
白，分别为 sPti1a、sPti1b以及GmPti1。其中GmPti1具
有自我磷酸化活性，而 sPti1a和 sPti1b没有自我连酸化
的功能[6]。Markus等[12]从玉米中克隆了几个类Pti1激
酶基因，分别命名为 ZmPti1a、ZmPti1b、ZmPti1c和
ZmPti1d，其中ZmPti1c与笔者克隆的ZmPti1序列相似
性最高。研究发现ZmPti1a专一的存在于花粉中，定
位于花粉细胞的细胞膜上，参与胼胝质的沉积过程；
ZmPti1b则定位于细胞质和细胞核中。
利用 protparam 工具（http://www.expasy.ch/tools/
protparam.html）分析 ZmPti1 序列，得到其 GRAVY
（Grand average of hydropathicity）值为-0.379（GRAVY
值的范围在2与-2之间，正值表明此蛋白为疏水蛋白，
负值表明为亲水蛋白），表明该蛋白为亲水蛋白。同时
利 用 TMHMM 程 序（http://www.cbs.dtu.dk/services/
TMHMM/）分析表明该序列不具有跨膜区域，不是膜
蛋白，为可溶性蛋白。共聚焦激光扫描显微检测结果
表明，转融合蛋白 ZmPti1-GFP的叶肉细胞原生质体
中，荧光信号在叶绿体和液泡内均未检测到，荧光主要
分布在胞浆内，表明该蛋白为可溶性蛋白，定位在细胞
质内，从而验证了以上的预测。
笔者利用基因工程技术构建荧光融合蛋白表达载
体，并将其转入拟南芥中进行表达，检测ZmPti1在细胞
中的定位，丰富了Pti1类蛋白亚细胞定位多样性内容。
同时，为进一步研究ZmPti1的生物学功能及阐明其信
号转导的分子机制提供了有力的实验工具和方法。
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