全 文 ：文章编号:1000-1573(2005)01-0049-04
拟南芥黑芥子酶基因根特异性表达启动子的克隆
李桂兰1 , 王文颇1 , 臧少先2 , 乔亚科1 ,
杨少辉3 , 薄 涛3 , 李明刚3
①
(1.河北科技师范学院 农学系 , 河北 昌黎 066600;2.河北保定职业技术学院 , 河北 保定 071001;
3.南开大学 分子生物学研究所 , 天津 300071)
摘要:黑芥子酶是一类催化芥子油苷水解的同工酶 , pyk10 是一个在拟南芥根和下胚轴中特异表达的黑芥子酶
基因。本研究用 PCR方法从拟南芥 Columbia生态型基因组中克隆了 pyk10 基因启动子片段。序列分析表明:
该片段全长 1 454 bp ,与已发表的 pyk10 启动子序列(GenBank accession no.AJ292756)同源性达 98%。该启动
子片段中含有多种其他植物基因启动子中发现的通用启动子元件 , 并含有器官和组织特异性转录因子的结合位
点 ACGT-、CANNTG-、GATA-以及 I 盒等顺式元件。
关 键 词:拟南芥;pyk10 ;根特异性;启动子
中图分类号:S 184 文献标识码:A
Cloning of root specific expression promoter of myrosinase
(pyk10)gene from Arabidopsis thaliana
LI Gui-lan1 , WANGWen-po1 , ZANG Shao-xian2 , QIAO Ya-ke1 ,
YANG Shao-hui3 , BO Tao3 , LI Ming-gang3
(1.Hebei No rmal University of Science & Technology , Changli 066600 , China;
2.Baoding Vocation-technical Colleg e, Baoding 071001 , China;
3.Institute for Molecular Biology , Nankai University , Tianjin 300071 , China)
Abstract:Myrosinase are a g roup of isoenzymes catalyzing the hydroly sis of glucosinolates.pyk10 is
a root and hypocotyls specific myrosinase gene from Arabidopsis thaliana.The promoter f ragment
of pyk10 was cloned by PCR method from Arabidopsis thaliana genomic DNA.Nucleotide
sequence analysis showed that the f ragment cloned w as consist of 1 454 bp.Comparison the
sequence obtained wi th that reported (GenBank Accession no.AJ292756) show ed that the
nucleotide homology w as as high as 98%.The pyk10 promoter contains regulatory sequence
elements that have show n to be functional cis-sequences in o ther plant promoters , such as ACGT
-,CANN TG-,GA TA and I-box -cis-elements , which are binding sites for o rgan and tissue-
specific t ranscription factors.
Key words:Arabidopsis thaliana;pyk10 ;root specific;promoter
启动子决定着基因的时空表达 ,在采用分子生物
学手段对农作物进行遗传改良的过程中 ,常常希望插
入的外源基因能够限定在特定的组织中表达 ,从而使
植物获得有益的性状而不影响其它特性 ,这就需要通
过组织特异性启动子对靶基因的表达进行调控。
目前植物基因工程中常用的组成型表达启动子 ,
使外源基因在植物内各部位均表达 ,而特异表达可以
更经济有效的发挥目的基因的作用。另一方面 ,研究
① 收稿日期:2004-09-09
基金项目:河北省自然科学基金(301295);河北省科技攻关项目;河北科技师范学院博士基金项目
作者简介:李桂兰(1963-), 女 ,河北肃宁人 , 博士 , 教授 , 从事植物分子生物学研究.
第 28卷第 1期
2 0 0 5年 1月
河 北 农 业 大 学 学 报
JOURNAL OF AGRICU LT URAL UNIVERSI TY OF HEBEI
Vol.28 No.1
Jan .2 0 0 5
植物基因组织特异性表达的调控方式对植物组织器
官分化及基因调控具有重要意义 。目前已从植物中
分离出多种特异性表达的启动子 ,并用其控制基因在
特定发育阶段或者特定器官中表达 。例如控制花药
发育的基因中有 10% ～ 20%是在花药中特异表
达[ 1 , 2] 。在植物杂种优势利用研究中 , 利用 TA29
barnasex系统已获得了烟草 、油菜 、花椰菜 、莴苣等多
种植物的转基因雄性不育系[ 3] 。将马铃薯 PGT2 的
启动子与 GUS 基因融合转入马铃薯及烟草中 ,能使
该基因的表达限定在转基因植株的根尖端和表皮部
位 ,并表现了较高的表达强度[ 4] 。
黑芥子酶是一类具有催化芥子油苷水解的同工
酶 ,其编码基因是一个庞大的基因家族 ,降解产物参
与植物对病虫害的防御 、硫 、氮的代谢以及生长调节。
黑芥子酶多在芸苔科植物中产生。 pyk10 是从拟南
芥中分离的一个黑芥子酶基因 ,在拟南芥的根和下胚
轴中特异性表达[ 5-8] 。
根系不仅是植物体进行营养吸收 、运输 、储存与
合成的重要器官 ,也是抵抗病虫害和在特殊生态环境
下赖以生存不可缺少的组成部分 。植物基因在根中
特异性表达的研究 ,是揭示植物根系发生 、分化和发
育机制的有效途径[ 9] ,并在植物营养利用及抗病虫害
基因工程研究中具有重要意义。本研究的目的是克
隆 pyk10 启动子 ,以期为今后培育抗根部病虫害和
营养高效利用型转基因植物奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
拟南芥(Arabidopsis thaliana)Columbia 生态型
(由南开大学生命科学学院王宁宁教授惠赠)。DNA
回收试剂盒购自鼎国公司(北京), pMD18-T 载体购
自 Takara公司(大连), E.coli DH-5α由本室保存。
1.2 方法
1.2.1 拟南芥总 DNA的制备 取拟南芥地上部分
作材料 ,采用 SDS 法提取[ 10] 。
1.2.2 PCR扩增 PCR反应体系(50 μL):拟南芥
DNA 100 ng ,dN TP 200μmol L ,上游 、下游引物终浓
度1 μmol L , pfu DNA 聚合酶 3 U 。反应参数:94℃
预变性 5 min ,进入循环 , 94℃变性 1 min , 56℃退火
1 min ,72℃延伸 1.5 min ,30个循环 , 72℃最后延伸
10 min。
1.2.3 PCR产物的克隆 采用 PCR回收试剂盒进
行目的 DNA 片段的纯化 , 克隆到 pMD18-T 载体
上 ,转化 E .coli DH -5α感受态细胞(氯化钙法制
备),蓝白斑筛选阳性克隆 ,碱法小量提取法提取重组
质粒 ,酶切鉴定[ 11] 。
1.2.4 克隆启动子的序列测定 含目的片段的重组
质粒委托上海生物工程技术服务有限公司测序。
2 结果与分析
2.1 PCR 扩增及克隆
从 Genbank 检索到 pyk10 启动子 DNA 序列
(GenBank 注册号:AJ292756)并参考 NITZ 等人[ 8] 的
研究结果 ,设计上下游引物:
上游引物 5′-GCGAAGCTTGGATCCCACT TA
TTACAAGT TTTA-3′
下游引物 5′-GCGCCCGGGTTTGCAGATTAT
AATTGA -3′
为后续克隆方便 ,分别在 5′端添加了 Hind Ⅲ和
BamH Ⅰ位点 ,在 3′端添加了 Sma Ⅰ位点 。运用此上
下游引物 ,以拟南芥总 DNA 为模板进行 PCR ,扩增
获得了约 1.5 kb 的拟南芥 pyk10 启动子片段(图
1),与预期大小相吻合。
图 1 pyk10 启动子 PCR扩增片段的琼脂糖凝胶电泳
Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR
product of pyk10 fragment
1 , 2:pyk10 片段的 PCR产物;3:λDNA EcoR HindШ marker
图 2 pMD18-pyk 重组质粒的酶切鉴定
Fig.2 Identification of recombinant plasmid pMD18-pyk
by restriction enzymes digestion
1:pMD18-pyk 重组质粒;2:Hind Ш and SmaⅠ double digests;
3:maker λ-DNA(Hind Ш +EcoRⅠ)
50 河 北 农 业 大 学 学 报 第 28卷
回收 PCR目的片段 ,与 pMD18-T 载体连接过
夜 ,转化大肠杆菌 DH5α,在含 X-gal 、IPTG 和 Amp
的培养基上挑取白色菌落 ,获得含重组质粒的阳性克
隆 pMD18 -pyk 。利用引物中引入的 Hind Ⅲ和
Sma Ⅰ酶切位点 ,进行 HindⅢ和 Sma Ⅰ双酶切鉴定 ,
结果切出了约 1.5 kb的片段(图 2),表明 pyk10 启
动子片段已插入 pMD18-T 载体中 。
2.2 根特异性表达启动子 pyk10 片段的序列分析
将重组质粒 pMD18-pyk 进行测序 ,结果表明
克隆的片段全长 1 454 bp ,比已发表序列多出 7 个
bp , 同源性达到 98%(图 3)。
图 3 本研究克隆的 pyk10 启动子序列(上行)与 Genbank中的 pyk10 启动子(下行)序列比较
Fig.3 Comparing the pyk10 sequence cloned(up lines)with that in GenBank(under lines)
“·”代表碱基相同;“ ＊”代表碱基缺失;“ △”表示推测的转录起始位点;TATAbox 用双下划线标出
3 讨论
本研究采用 PCR方法从拟南芥 Columbia 生态
型基因组 DNA 中克隆了 pyk10 根特异性启动子(图
1 、2)。序列分析表明 , 所克隆的 pyk10 启动子长
1 454 bp ,比已发表序列多 7个 bp ,二者同源性达到
98%(图 3)。这种微小差异可能来自拟南芥不同生
态型之间的多态性 ,本试验所用拟南芥为 Columbia
生态型 ,已发表序列拟南芥为 C24 生态型[ 8] 。
克隆的 pyk10 启动子中富含A T 序列(4种碱基
数分别为 563 A 、466 T 、215 C 、210 G ,见图 3),18 bp ,
15 bp和 13 bp 三段 A T 富含序列分别位于 234 ～
251 、367 ～ 381 和 1 007 ～ 1 018之间 。已有研究表
明 ,A T 序列含量与基因的转录活性正调控有关 ,将
法国菜豆的 β -菜豆蛋白(β -phaseolin)基因启动子
中的 A T 富含序列插入 CaMV 35S -90 启动子上
游 ,能使 gus基因在转基因烟草中表达量大幅度提
高[ 11] 。此外 , 将豌豆 GS2 基因启动子中一个 33bp
A T 富含序列的缺失 ,结果导致转基因烟草中 gus活
性下降 10倍[ 13] 。因此 , pyk10 启动子可能具有较高
的启动效率。
转录起始位点的基本特征是嘧啶碱基包围的腺
嘌呤 ,TATA 盒与转录起始位点之间的间隔为(32±
7)bp[ 15] 。由此推测 pyk10 启动子的起始位点可能位
于 TATA盒序列(5′-TATA TAAA-3′)自5′端起下
游的第 35个碱基。
51 第 1期 李桂兰等:拟南芥黑芥子酶基因根特异性表达启动子的克隆
pyk10 启动子含有多种在其他植物启动子中存
在的通用启动子元件 。例如 ACGT 核心序列 4 个 ,
位于 CAAT 盒的旁测;3 个 CANNTG 基序 , 17 个
GATA基序以及植物激素应答元件(图 3)。此外还
含有 ACGT -,CANN TG-,GATA-以及 I 盒等器
官和组织特异性转录因子的结合位点[ 14 , 15] 。该启动
子与报告基因 GUS融合在拟南芥中显示出高强度的
根特异表达特性 ,是迄今惟一在成熟植株中仅在根部
表达的启动子[ 8] 。预示 pyk10 启动子在植物抗根部
病虫害 、改善根的质量及提高营养利用基因工程中具
有巨大的应用潜力。
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(编辑:李 川)
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