全 文 ：
2011 年 第 56 卷 第 30 期：2486 ~ 2498
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英文版见: Li L J, Ren F, Wei P C, et al. Identification of AtSM34, a novel tonoplast intrinsic protein-interacting polypeptide expressed in response to osmotic
stress in germinating seedlings. Chinese Sci Bull, 2011, 56, doi: 10.1007/s11434-011-4793-4
《中国科学》杂志社
SCIENCE CHINA PRESS 论 文 专辑: 娄成后教授诞辰 100 周年纪念
拟南芥液泡膜水孔蛋白的互作蛋白 AtSM34参与种子
萌发的渗透胁迫响应
李丽娟①†, 任飞②†, 魏鹏程①, 陈其军①, 陈珈①, 王学臣①*
① 中国农业大学生物学院, 植物生理学与生物化学国家重点实验室, 北京 100193;
② 北京市农林科学院林业果树研究所, 北京 100093
† 同等贡献
* 联系人, E-mail: xcwang@cau.edu.cn
2011-07-27 收稿, 2011-09-01 接受
国家重点基础研究发展计划(2006CB100100)、国家自然科学基金(3077019)和高等学校学科创新引智计划(B06003)资助
摘要 水孔蛋白(aquaporin, AQP)广泛参与植物的各种生理活动, 但还有许多调控机制未被发
现. 为进一步对其调控因子进行研究, 运用酵母双杂交筛选拟南芥液泡膜水孔蛋白 TIP1;1
(tonoplast intrinsic protein, TIP)的互作子, 这是拟南芥中第一个被发现的液泡膜上具有高度水
转运活性的蛋白. 以 AtTIP1;1 为诱饵, 筛选得到一个新的 TIPs 结合蛋白, 并在酵母和植物细
胞中验证了这种结合. 该蛋白被命名为 AtSM34, 编码一个含 309 个氨基酸的多肽, 预测分子
量为 34 kD, 具有 1个单独的MYB/SANT样结构域. AtSM34启动子融合GUS组织化学染色分
析显示, 其表达主要位于花、茎和叶中, 尤其是维管束组织, 并且响应渗透胁迫. AtSM34定位
于内质网, 截断分析显示其 N端(1~83位氨基酸)对于其定位至关重要. 过表达 AtSM34导致转
基因植物对外源甘露醇、山梨醇及脱落酸更加敏感, 表现为萌发延迟. 进一步研究发现,
AtSM34也可与 AtTIP1;2和 AtTIP2;1结合, 这 2个 TIP蛋白对液泡渗透调节发挥着重要作用,
并在种子萌发阶段大量表达. 这暗示着AtSM34可能通过影响水孔蛋白基因的表达, 参与种子
萌发早期阶段的渗透胁迫响应.
关键词
拟南芥
渗透胁迫
液泡膜水孔蛋白
内质网
水孔蛋白(aquaporin, AQP)是细胞膜上介导水分
渗透调节的一类通道蛋白[1], 对植物生长发育发挥重
要作用 . 水孔蛋白的调节及其综合功能的发挥对于
胁迫条件下保持水分平衡具有重要作用[2].
水孔蛋白的活性可被多种因素所调控 , 包括磷
酸化、异聚化、pH、Ca2+、温度以及溶质浓度等, 调
节其开闭方式 [3~6]. 最近有研究发现, 一些膜结合蛋
白或细胞质蛋白可通过与水孔蛋白的互作 , 甚至形
成蛋白复合体, 来参与调控水孔蛋白的表达、活性及
其在膜定位的动态转运 . 在动植物中都不乏有这样
的例子. 单独 1 个 AQP0 四聚体可与 2 个钙调素
(calmodulin, CaM)分子以 Ca2+依赖的方式结合, 并且
调控其通道活性[7]. 热激蛋白(heat shock protein 70,
Hsp70)可与 AQP2 互作, 并在鼠肾细胞中调控其转
运 [8]. 植物中的研究发现 , 黄瓜花叶病毒(Cucumber
mosaic virus, CMV)1a 可与拟南芥的 TIP1 和 TIP2 存
在互作, 并可能通过互作来调控 CMV 在液泡膜上的
复制[9]. 大豆胞质内的谷氨酸盐合酶可与 NOD26 的
C 端相互作用, 对促进氮源的高效吸收固定、阻止氨
毒害具有重要作用 [10]. 还有一些蛋白可通过与水孔
蛋白的互作, 调控水孔蛋白的数量及定位, 从而响应
外界的环境胁迫. 在拟南芥中过表达辣椒的 E3 泛素
连接酶同源基因 Rma1H1, 导致 AtPIP2;1 蛋白表达下
降 , 并且在原生质体中抑制了 PIP2;1 从内质网
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(endoplasmic reticulum, ER)向质膜的转运. 由于体内
质膜水孔蛋白的下降 , 转基因拟南芥植物的抗旱性
大大提高[11].
液泡作为植物所特有的重要器官, 在膨压调节、
渗透调控、细胞信号存储和降解等方面发挥着重要作
用. 液泡膜内在水孔蛋白(tonoplast intrinsic proteins,
TIPs)是一类液泡膜定位的水孔蛋白[12]. TIP 基因表达
的变化可能会影响水通过液泡膜的运动 , 从而影响
植物的非生物胁迫响应[13]. 对冰草花叶植物(Mesem-
bryanthemun crystallinum)渗透胁迫的研究发现 , 甘
露醇诱导的水分失衡使 McTIP1;2 (McMIPF)蛋白表
达升高, 并且导致其重新分布于内涵体组分, 这些变
化暗示着 McTIP1;2 对渗透胁迫的响应[14].
AtTIP1;1 属于拟南芥液泡膜水孔蛋白亚家族 ,
是最早在爪蟾卵母细胞表达系统中发现的具有高度
水转运活性的蛋白之一[15]. 拟南芥中 AtTIP1;1 的敲
除突变体 tip1;1-1 及 TIP1;1 与 TIP1;2 的双突变体
tip1;1-1/tip1;2-1 都没有显示出与野生型有任何明显
不同的表型, 这可能是 TIP 同源基因的功能冗余所造
成的[16,17]. 但这些研究背后也暗示着与 AtTIP1;1 相
关的功能及调控机制可能仍未被发现.
本研究希望通过寻找 AtTIP1;1 的互作蛋白来更
好地探索其功能. 我们以 AtTIP1;1 为诱饵, 通过分裂
泛素化酵母双杂系统筛选得到一个新的互作蛋白 ,
并且在双分子荧光互补(bimolecular fluorescence com-
plementation, BiFC)实验中证实了二者的互作. 所得
到的新蛋白编码一个 309 个氨基酸的多肽, 预测分子
量为 34 kD, 并且含有一个 MYB/SANT 样结构域, 因
此命名其为 AtSM34, 与 maMYB 具有相同的 AGI 编
号 [18], 虽然其并未被归入拟南芥中所鉴定的典型
MYB 基因[19]. 过表达 AtSM34 可导致转基因植株的
萌发和早期生长阶段对外源渗透胁迫比野生型更加
敏感. 进一步研究显示, 其定位于内质网, N 端对于
其定位具有重要作用. 进一步研究发现, AtSM34 与
AtTIP1;2 和 AtTIP2;1 这 2 个在种子萌发阶段大量表
达的 TIP 蛋白也有结合. 这暗示着 AtSM34 可能通过
与 AtTIPs 的结合, 影响拟南芥种子萌发时期内源 TIP
基因的表达.
1 材料与方法
(ⅰ) 植物材料及生长条件. 所有实验使用拟南
芥 Columbia-0 为野生型. 转基因标记野生型液泡的
种子 35S::spRFP–AFVY(云扁豆蛋白的 C 端液泡分选
信号 AFVY 四肽, 融合于红色荧光蛋白(red fluores-
cent protein, RFP)的 C 端)由 Warwick 大学的 Lorenzo
Frigerio 博士惠赠. 拟南芥种子在 0.5%次氯酸钠中浸
泡 15 min, 用灭菌的重蒸水漂洗 5 次, 播种于 1/2 MS
培养基(Sigma, 美国)中, 含 1%蔗糖, 0.5%植物凝胶
(Sigma), pH 调至 5.8. 放入 4℃冰箱春化 3 d, 然后移
入光照培养箱. 长日照条件 22~23℃, 16 h (光)/20℃,
8 h (暗)为周期光照培养. 取生长于 1/2 MS 加 1%蔗
糖培养基的 6 d 小苗, 于 1/2 MS 液体培养基加入研究
所需的胁迫条件进行处理 , 随后进行后续 mRNA
分析.
(ⅱ) 酵母分裂泛素化系统筛选及互作分析. 本
实验选用 DUAL 膜系统(DUALsystems Biotech, 瑞士)
筛选膜蛋白 AtTIP1;1 互作蛋白. TIP1;1 编码区用 SfiI
酶切位点克隆于 pTMBV4 诱饵载体. 所用引物如下:
TIP1 正向: 5′-GGCCATTACGGCCTTAAAAATGCC-
GATCAGAAACATC-3′; TIP1 反向: 5′-GGCCGAGG-
CGGCCCCGTAGTCTGTGGTTGGGAGCT-3′.
拟 南芥 NubG-x cDNA 文 库 (P02210) 被 用于
AtTIP1;1 互作蛋白的筛选鉴定. cDNA 的筛选使用酵
母菌株 DSY-1, 酵母转化步骤见 DUAL 系统技术指
南. 转化子涂布于亮氨酸、色氨酸和组氨酸, 并加入
10 mmol/L 3-氨基-1,2,4-三氮唑(3-AT)的三缺培养基.
得到的阳性克隆在上述培养基重复培养, 并进行 β-
半乳糖苷酶活性检测 . 蓝色的阳性克隆质粒从酵母
中提取并转化大肠杆菌 E. coli 后进行测序. 为进一
步验证互作 , 分离出来的捕获质粒分别与含诱饵
pTMBV4-TIP1;1 或对照 pMBV-Alg5 的酵母 DSY1 一
对一进行转化.
(ⅲ) 双分子荧光互补(BiFC)研究与共聚焦成像
分析. BiFC 分析参照文献[20]中所述. 实验所用引
物: TIP1-B 正向: 5′-GCTCTAGAATGCCGATCAGA-
AACATCG-3′; TIP1-B 反向: 5′-CGGGATCCGTAGT-
CTGTGGTTGGGAGCT-3′; TIP12-B 正向: 5′-GCTC-
TAGAATGCCGACCAGAAACATCG-3′; TIP12-B 反
向: 5′-CGGGATCCGTAATCGGTGGTAGGCAAT-
TG-3′; TIP21-B 正向: 5′-GCTCTAGAATGGCTGGA-
GTTGCCTTTGG-3′; TIP21-B 反向: 5′-GGGGTACC-
GAAATCAGCAGAAGCAAGAGG-3′; SM34-B 正向:
5′-GCTCTAGAATGGATTTTTTCGACGAAGAC-3′;
SM34-B 反向: 5′-CGGGATCCATTAGCTGGAGTTT-
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TCGAGC-3′; SM34-250B 正向: 5′-GCTCTAGAATG-
GGTAAGATTCGCGTCGGTT-3′ (限制性内切酶位点
如下画线所示).
PCR 扩增得到 AtTIP1;1, AtTIP1;2 和 AtTIP2;1 编
码区 , 分别克隆于 pUC-SPYCE 载体 [ 2 0 ]并测序 .
AtSM34 编码区全长及截去 N 端 1~83 位氨基酸的片
段(AtSM3483aa)插入 pUC-SPYNE 载体并测序正确.
pUC-SPYNE-AtSM3483aa 和 pUC-SPYNE-AtSM34 与
上述质粒及对照载体分别用 PEG 介导转化拟南芥叶
肉原生质体 [21], 所有转化用不同批次的拟南芥叶肉
原生质体材料至少重复 3 次. FM4–64 (N-(3-triethy-
lammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino) phenyl)hex-
atrienyl) pyridinium dibromide; Invitrogen, 美国 )用
DMSO 溶解至 1 mmol/L, 并用 W5 溶液将母液稀释至
15 μmol/L 用于叶肉原生质体染色, 染色 2 h 后用 W5
溶液漂洗 3 遍, 激光共聚焦显微镜(LSM 510 META,
Zeiss, 德国)下进行观察.
激光共聚焦显微镜(LSM 510 META)用于图像分
析, 在 40 倍油镜(Plan-NEOFLUAR, NA 1.3)下进行观
察. 黄色荧光蛋白(yellow fluorescent protein, YFP)检
测激发波长为 488 nm, 在发射波长为 515~530 nm 处
收集. FM4–64 和 RFP 的检测激发波长为 543 nm, 在
发射波长为 585~615 nm 处采集. 荧光采集为多通道
模式 . 所用共聚焦图像 LSM 采用图像浏览器 3.2
(Zeiss)并输出为 TIFF 文件.
(ⅳ) AtSM34 启动子区的分离及 GUS 组织化学分
析 . 为研究 AtSM34 的组织特异性表达 , 用 KOD
DNA 聚合酶以基因组 DNA 为模板 PCR 扩增 AtSM34
基因 ATG 上游 1035 bp 的启动子区, 所用引物如下:
正向: 5′-CGCGGATCCTACTCAAAGCAAACAAAC-
GAAG-3′; 反向 : 5′-GGCGAATTCTGTTGCTCTGT-
TGCACTGTAGA-3′( 限制性内切酶位点如下画线
所示).
扩增产物测序正确后用 BamHⅠ和 EcoRⅠ位点
插 入 pCAMBIA1391 载 体 [22]. 之 后 转 化 农 杆 菌
GV3101 并转化拟南芥 Col-0. GUS 染色分析按照文
献[22]所示.
( ⅴ ) AtSM34-GFP 融合蛋白的亚细胞定位 .
AtSM34 可读框全长用 XbaⅠ和 BamHⅠ位点克隆于
瞬时表达载体 pUC-EGFP[23] 35S 启动子下游. 用 Xba
Ⅰ 和 BamH Ⅰ 内 切 酶 将 AtSM3483aa 片 段 从
pUC-SPYNE-AtSM3483aa 切下 , 连入 pUC-EGFP.
AtSM34 编码区也由 PCR 扩增, 融合至绿色荧光蛋白
(green fluorescent protein, GFP)的 C 端, 并通过 SpeⅠ
和 SalⅠ酶切位点连入改造后 35S 驱动的 pCAMBI-
A1300 载体[24]. 所用引物如下: 正向: 5′-GACTAGT-
ATGGATTTTTTCGACGAAG-3′; 反 向 : 5′-ACGC-
GTCGACTTAATTAGCTGGAGTTTT-3′ (限制性内切
酶位点如下画线所示). 构建的 DNA 质粒由 PEG 介
导转化拟南芥叶肉原生质体[21].
AtSM34 编码区融合 GFP 克隆至 pBI121 载体[25],
由 3 5 S 驱动 , 进行稳定表达研究 . 通过农杆菌
GV3101 介导转化拟南芥 . 激光共聚焦显微镜观察
35S::AtSM34-GFP 转基因的卡那抗性拟南芥幼根. 5
个不同的 35S::AtSM34-GFP 转基因株系用于融合蛋
白的定位观察. GFP 的激发光波长为 488 nm, 515~
530 nm 收集, Zeiss 40 倍油镜下观察. 观察 ER, 转化
的拟南芥叶肉原生质体和 35S::AtSM34-GFP 转基因
根, 用 1 μmol/L red-orange-fluorescent BODIPY 558/
568-conjugated brefeldin A (B7449, Invitrogen, Eugene,
OR, 美国)染色 30 min. 荧光检测激发波长为 543 nm,
发射波长在 585~615 nm.
(ⅵ) 反转录半定量和实时定量 PCR 分析. 样
品收集和总 RNA 提取使用 RNA 纯化试剂盒(BioTeke,
北京), 方法参照说明书. 反转录使用 M-MLV 反转录
酶(Promega, Madison, WI, 美国)和 Oligo-dT18 引物
(TaKaRa, 大连). 合成的 cDNA 用于半定量和定量
PCR 分析.
半定量 RT-PCR 分析所用 SM34 基因特异的引物
如下: 45420-171 正向: 5′-TGAACCTGCCAAATCGC-
TAC-3′; 45420-741 反向: 5′-ACCTTCCGCATCTCCA-
CC-3′. 以 ACTIN2/8 (At3g18780) mRNA 表达作为内
参. 半定量 RT-PCR 所用的特异引物为: 5′-TCTTC-
CGCTCTTTCTTTCCA-3′和 5′-GAGAGAACAGCTT-
GGATGGC-3′[26]. ACTIN2/8 和 AtSM34 分别扩增 23
和 29 个循环. PCR 程序如下: 94℃, 30 s; 56℃, 30 s;
72℃, 50 s. 最后, 72℃, 7 min, 完成产物合成. 实时定
量 PCR 分析所用 AtSM34 基因的特异引物如下: 45420
正向: 5′-TGATGATTACGCTCAGTTT-3′; 45420 反向:
5′-ACCTTCCGCATCTCCACC-3′. 实时定量 PCR 分
析所用 ACTIN2/8 基因的引物为: ACTIN2/8-正向:
5′-GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG-3′; ACTIN2/8-
反向: 5′-AACGACCTTAATCTTCATGCTGC-3′[27].
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所检测基因的相对表达水平对照 ACTIN2/8 表达的标
准曲线用 2△△CT 方法[28]计算. 实时定量 PCR 实验进
行 3 次独立的重复.
(ⅶ) 过表达 AtSM34 株系分析. Pfu DNA 聚合
酶用如下引物从拟南芥幼苗 cDNA 扩增得到 AtSM34
编码区全长 . 45420 正向 : 5′-GCTCTAGAATGGA-
TTTTTTCGACGAAGAC-3′; 45420 反向: 5′-GGGG-
TACCATTAGCTGGAGTTTTCGAG-3′ (限制性内切
酶位点如下画线所示).
扩增片段用 XbaⅠ和 KpnⅠ位点连入改造的
pSuper1300 载体[29]并测序正确. 改造 pSuper1300 载
体, PCR 扩增得到 FLAG 片段用 KpnⅠ和 SacⅠ位点
插入到 pSuper1300 载体 . 所构建载体(pSuper1300-
AtSM34-FLAG-TNOS)转化农杆菌 GV3101, 并采用悬
滴法转化野生型拟南芥[30]. 转基因植株用 25 μg/mL
的潮霉素进行筛选 . 具有抗性的转基因植株移入土
中温室生长. 根据 T2 代和 T3 代种子的抗性分离比,
选取 T3 代纯和株系进行表达分析和表型鉴定.
野生型 AtSM34 转基因过表达株系 (OE-6 和
OE-10)每种大约 60 粒种子铺于含 1% (w/v)蔗糖的 1/2
MS 培养基上, 分别加入 400 mmol/L 甘露醇、400
mmol/L 山梨醇、1 μmol/L 脱落酸(abscisic acid, ABA).
4℃培养 3 d, 然后移入长日照条件 22℃培养. 每天计
算萌发数(以胚根露出)持续 5 d. 植物生长 7 d后照相.
实验进行 3 次独立重复.
(ⅷ) Western blot 分析. 培养的植物材料用蛋白
提取缓冲液提取总蛋白. 用 Bio-Rad Minigel 电泳仪
系统(Bio-Rad, 美国) 12% (w/v)的胶进行 SDS-PAGE.
分离的蛋白转移至 PVDF 膜, 然后用 flag 抗体(Sigma)
作为一抗(1:10000 稀释)孵育. 之后用 TBS-T 缓冲液
洗 3 遍, 再用辣根过氧化物酶耦联亲和纯化的羊抗兔
IgG [H+L]作为二抗孵育 1 h. 再重复前面的漂洗过程,
之后用增强的化学发光系统 (ECL, Amersham Bio-
sciences, 瑞士)检测膜上的蛋白.
2 结果
2.1 酵母泛素分裂系统分析 AtSM34与 AtTIP1;1
的互作
为寻找 AtTIP1;1 的互作蛋白, 以其为诱饵用分
离泛素化酵母双杂交系统(DUAL)筛选拟南芥 6 d 小
苗的 NubG-x cDNA 文库. 对从阳性克隆分离得到的
捕获质粒进行测序. 进一步分析发现 1 个独特的克隆,
编码 1 个含 309 个氨基酸的多肽(AtSM34, At5g45420),
预测分子量为 34 kD, 具有类似 MYB/SANT 样结构
域 . 最近有报道其可能作为膜滞留的转录因子对根
毛的伸长具有重要作用[18].
为证实 AtSM34 与 AtTIP1;1 的互作, 捕获质粒
pDL2-Nub-AtSM34 重 新 转 化 至 表 达 有 pTMBV4-
TIP1;1-Cub 诱饵载体的酵母菌 DSY1. 转化子可以在
含 10 mmol/L 3-AT 的 SD/-His-Trp-Leu 培养基上生
长, 用 X-gal 进行 β 半乳糖苷酶活性检测为阳性(图 1
(a)). 阴 性 对 照 pDL2-Nub-AtSM34/pMBV-Alg5 和
pTMBV4-TIP1;1-Cub/pAlg5-NubG 均未观察到互作 ,
说明 AtSM34 和 TIP1;1 可以在酵母细胞中发生相互
作用.
2.2 双分子荧光互补(BiFC)研究
双 分 子 荧 光 互 补 (BiFC) 实 验 进 一 步 证 实 了
AtTIP1;1 与 AtSM34 的结合. TIP1;1 融合于 YCE,
AtSM34 融合于 YNE, 分别共转化 35S::spRFP-AFVY
转基因植株及野生型拟南芥的叶肉原生质体 . 重组
的 YFP 荧光定位于斑点状类似前体液泡的小囊泡结
构(图 1(c))中. 以前有报道 35S::spRFP-AFVY 广泛定
位于中央大液泡腔内 [31]. 液泡融合是动态变化的 ,
带有 RFP 的 AFVY 四肽可以标记各种囊泡, 也可同
时标记蛋白存储液泡(protein-storage vacuoles, PSVs),
密集型囊泡 (dense vesicles, DV)或堆积前体囊泡
(precursor-accumulating vesicles, PAC)[32]等. 图 1(c)
中箭头所指的 YFP 荧光与散布于中央大液泡周围的
红色小囊泡结构是有重合的. 此外, 为进一步验证这
个结构, 我们用荧光染料 FM4-64 将原生质体进行染
色, FM4-64 作为一种有利工具, 可以在活细胞中追
踪囊泡内吞的运输过程[33]. YFP 荧光能够与 FM 4-64
染料在胞内部分共定位 , 但不位于中央大液泡膜上
(图 1(c)中部叠加图), 表明该结合可能发生于小囊泡
中, 暗示 AtSM34 有可能参与囊泡运输过程.
与上述 BiFC 分析相比, 当 TIP1;1 分别融合于分
裂的 YFP 的 N 端和 C 端, 瞬时转化 FM4-64 染色的
拟南芥叶肉原生质体 . 水孔蛋白在体内行使生物学
功能时可以形成同源四聚体. 重组的 YFP 荧光主要
位于中央大液泡的膜上及其紧邻的球形小液泡上(图
1(c)下排图片). 这些结果暗示, AtTIP1;1 与 AtSM34
的互作发生于囊泡中, 而不在中央大液泡膜上.
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图 1 酵母泛素分裂系统及双分子荧光互补(BIFC)实验分析 AtTIP1;1与 AtSM34的结合
(a) 酵母泛素分裂系统实验分析 AtTIP1;1 与 AtSM34 的结合. 将 pTMBV4-TIP1;1-Cub 与 pDL2-Nub-SM34 共转化酵母 DSY1, 共转化的
酵母细胞可以在 SD/-Trp-Leu 与含 10 mmol/L 3AT 的 SD/-His-Len-Trp 培养基上生长, 且 β-半乳糖苷酶检测为阳性; (b) YNE-AtSM34/
YCE, YCE-AtTIP1;1/YNE 和 YNE-AtTIP1;1/YCE 共转化拟南芥叶肉原生质体的 YFP 荧光观察; (c) 双分子荧光互补实验分析 AtTIP1;1
与 AtSM34 的结合. YNE-AtSM34 与 YCE-AtTIP1;1 或 YNE-AtTIP1;1 与 YCE-AtTIP1;1 共转化拟南芥叶肉原生质体的 YFP 荧光观察. 上
排图片中箭头所指的 YFP 发光结构与 35S::spRFP–AFVY 转基因植株 RFP 标记的红色小液泡结构是有重合的. 中间一排图片是荧光染料
FM4-64 将共转化 AtTIP1;1 与 AtSM34 的原生质体进行染色. 下排图片是荧光染料 FM4-64 将共转化 YNE-AtTIP1;1 与 YCE-AtTIP1;1 的原
生质体进行染色. 为了观察方便, 将 YFP 荧光用绿色表示. YFP, 黄色荧光蛋白信号; DIC, 明场; Merge, 2 张图片的叠加. 比例尺为 5 µm
此外, 在对照组 YNE-AtSM34 与 YCE 空载体、
YCE-AtTIP1;1 与 YNE 空载体及 YNE-AtTIP1;1 与
YCE 空载体转化原生质体都没有检测到 YFP 信号
(图 1(b)).
2.3 AtSM34的组织表达方式
半定量 RT-PCR 检测 AtSM34 在拟南芥中不同组
织器官的表达. 从拟南芥的根、茎、叶、花和幼嫩的
果荚中提取总 RNA, 以 ACTIN2/8 的表达作为上样对
照. 如图 2 所示, 在花、叶和茎中都检测到 AtSM34
较高的表达水平, 而在根和果荚中表达较低.
进一步用 AtSM34 启动子驱动的 GUS 报告基因
(AtSM34promoter::GUS)详细研究 AtSM34 的表达模
式. 3 个以上的不同拟南芥转基因株系用于研究分析.
刚萌发种子的子叶(图 2(a)中白色箭头所指)、幼苗(图
2(b)~(d))中都可以观察到明显的 GUS 染色. 2 周大的
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图 2 AtSM34的组织特异性表达
半定量 RT-PCR 分析 AtSM34 在野生型拟南芥不同器官里的表达. 总 RNA 从 4 周龄的 Col-0 野生型拟南芥的根、茎、叶、花和荚果中
提取. ACTIN2/8 作为内参基因. (a)~(h)为 AtSM34 启动子::GUS 转基因植株的 GUS 组织化学染色. (a) 萌发 24 h 的种子; (b) 2 d 大的小苗;
(c) 3 d 大的小苗; (d) 5 d 大的小苗; (e) 2 周大的小苗; (f) 4 周龄莲座叶; (g) 5 周龄的花; (h) 5 周龄花序上的茎
小苗(图 2(e)), 莲座叶, 尤其维管束部分(图 2(f))也可
以观察到强烈的 GUS 信号. 成熟的茎(图 2(h))和花萼
及花瓣(图 2(g))也检测到 GUS 染色. 然而, 在根和幼
荚中几乎检测不到 GUS 活性.
2.4 AtSM34定位于内质网
Tair 网站 (http:/ /www.arabidopsis.org)预测 ,
AtSM34 定位于内质网. 为检测 AtSM34 的亚细胞定
位, 35S 驱动的 GFP 分别融合于 AtSM34 的 C 端
(AtSM34-GFP)及 N 端(GFP-AtSM34), 并瞬时转化拟
南芥叶肉原生质体 . 共聚焦显微镜观察到类似于内
质网的绿色荧光结构. 以前研究显示, 叶肉原生质体
中 ER 的定位方式呈丝网状分布[34]. 为进一步证实,
叶肉原生质体用 ER 特异的红色染料 BODIPY 558/
568-conjugated brefeldin A 进行染色. GFP 的绿色荧
光与标记 ER 的红色荧光均能够共定位(图 3(a)). 这
说明 GFP 融合于 AtSM34 的 N 端或 C 端不会影响其
定位方式(图 3(a)).
进一步观察稳定表达 35S::AtSM34-GFP 的转基
因拟南芥, 其 ER 染料染色后的幼根中 GFP 荧光也与
染料的红色荧光相重合 (图 3(a)下排图片 ), 说明
AtSM34 定位于 ER. 这与 maMYB 在烟草表皮细胞中
的定位相一致[18].
2.5 N端 83个氨基酸对于 AtSM34亚细胞定位具
有重要作用
疏水分析网站(http://www.ch.embnet.org/software/
TMPRED_form.html)预测显示, AtSM34 的 N 端 83 个
氨基酸存在 2 个跨膜结构域. 当 GFP 与 AtSM3483aa
融合 , 绿色荧光遍布于细胞质、细胞核(图 3(b)中
间一排图片), 说明 N 端区域对其 ER 的亚细胞定位
具有重要作用 . 对照 35S::GFP 则显示为遍在的
2011 年 10 月 第 56 卷 第 30 期
2492
图 3 AtSM34在拟南芥叶肉原生质体与幼苗根细胞中的亚细胞定位
(a) AtSM34 分别融合 GFP 的 N 端与 C 端瞬时转化拟南芥叶肉原生质体(上面与中间一排图片), 或是 35S::AtSM34-GFP 转基因稳定表达
拟南芥幼苗的根(下排图片), 同时用 ER 标记染料 BODIPY 558/568-conjugated brefeldin A 染色; (b) 上排图片是拟南芥叶肉原生质体转
化 35S::GFP 空载体; 中间一排图片是 AtSM34 缺失 N 端 83 个氨基酸后的亚细胞定位; 下排图片是 AtSM3483aa 与 TIP1;1 的 BIFC 结
合实验. GFP, 绿色荧光蛋白信号; YFP, 黄色荧光蛋白信号; DIC, 明场; Staining, 染色; Merge, 2 张图片的叠加. 比例尺为 5 µm
表达方式.
为进一步检测这段序列是否与 AtTIP1;1 结合相
关, 将 YNE-AtSM34△83aa 和 YCE-AtTIP1;1 共转化
拟南芥原生质体. YFP 荧光重新定位于中央大液泡膜
上(图 3(b)下排图片), 这与一些 TIP 成员在叶肉原生
质体中的定位非常相似[12]. 这证明 AtSM34 的 N 端前
83 个氨基酸不是其发生互作所必需的, 可能作为跨
膜域与其亚细胞定位密切相关.
2.6 AtSM34过表达株系对渗透胁迫和 ABA敏感
为研究 AtSM34 的生物学功能 , 我们分析了
Super 启动子驱动的 AtSM34 过表达的 20 个不同转基
因株系, 在阳性转基因植株中检测了 AtSM34 基因的
表达水平, 实时定量 PCR 结果显示, 转基因植株中
OE-6 和 OE-10 两个不同株系中 AtSM34 的 mRNA 表
达水平要明显高于野生型(图 4(a)). flag 抗体检测转
基因植株 flag 标签的 Western blot 分析进一步证实了
2493
论 文
图 4 AtSM34在过表达株系的实时定量 PCR转录分析和Western blot蛋白表达分析
(a) AtSM34 在 2 周龄野生型与过表达株系(OE-6 和 OE-10)的实时定量 PCR 转录分析. ACTIN2/8 作为内参基因; (b) AtSM34 在野生型与过
表达株系(OE-6 和 OE-10)的 Western blot 蛋白表达分析. 从成熟叶片中抽提总蛋白, 用 12%的凝胶分离并用考马斯亮蓝染色. 分离后
的总蛋白利用 FLAG 抗体进行 Western blot 分析
其表达. OE-6 和 OE-10 中均可检测到相应的蛋白条
带, 而在野生型中没有表达(图 4(b)). OE-6 和 OE-10
的纯合株系用于后续实验研究.
为进一步阐明 AtSM34 的可能功能, 我们进行了
一系列胁迫处理并观察其萌发和生长时期的表型 .
在正常生长条件下, 所有植株都能正常萌发和生长.
但在加入高浓度的甘露醇、山梨醇和 ABA 的 1/2 MS
固体培养基上, 过表达植株 OE-6 和 OE-10 的萌发和
早期生长明显延迟于野生型(图 5(a)).
3 d 后, 在含 400 mmol/L 甘露醇的 1/2 MS 培养
基上, 有约 70%的野生型已经萌发, 而转基因过表达
植株萌发率不到 20% (图 5(b)). 与此相似, 在含 400
mmol/L 山梨醇的 1/2 MS 培养基上, OE-6 和 OE-10
的萌发率约为 30%和 40%, 而野生型(wild type, WT)
的萌发率约为 72% (图 5(b)). 在含 1 μmol/L ABA 的
1/2 MS 培养基上生长 2 d, 有约 40%的过表达株系萌
发, 而 60%以上的野生型已经萌发. 这些结果说明,
过表达 AtSM34 使种子萌发和植物早期生长对于渗透
胁迫和 ABA 更加敏感.
2.7 AtSM34胁迫响应的表达方式
为进一步研究渗透胁迫下 AtSM34 的表达方式,
生长 6 d 的野生型小苗用甘露醇处理不同时间段, 实
时定量 PCR 检测 AtSM34 的表达. 结果显示, 渗透胁
迫下 AtSM34 的表达量随时间而变化(图 6(a)), 在处
理 8 h 达到最大, 约为对照的 2 倍. 而在处理 24 h 后
表达量则迅速降低.
实时定量 PCR同时检测了 AtSM34在其他胁迫下
的表达方式 . 与渗透胁迫相似 , 在 ABA, 甲基紫精
(methyl viologen, MV)以及葡萄糖 4 和 12 h 处理下,
AtSM34都有一定的诱导表达. 这显示 AtSM34能被不
同非生物胁迫所诱导 , 并且可能参与植物的环境胁
迫响应.
2.8 AtSM34与其他亚型 TIP互作的研究
BiFC 研究发现, AtSM34 也可与 TIP1;2 和 TIP2;1
发生互作, 且拟南芥原生质体共转化 YNE-AtSM34 和
YCE-AtTIP1;2 (或 YCE-AtTIP2;1), YFP 荧光分布方式
与前面非常相似(图 7(a)). 同时, 在 YCE-AtTIP1; 2/
YCE-AtTIP2;1 和 YNE 空载体共转化的对照组没有检
测到荧光信号.
另外, 酵母泛素分裂系统分析发现, AtSM34 和
TIPs 的 结 合 具 有 一 定 特 异 性 , AtSM34 也 可 与
AtTIP1;3 结合, 但不能与 AtTIP2;2 和 AtTIP3;2 发生
互作(图 7(b)). 因此, 也不能排除还有其他水孔蛋白
会与之结合.
2.9 渗透胁迫下 AtSM34 对拟南芥 TIP基因表达
的影响
TIP1;1, TIP1;2 与 TIP2;1 是液泡膜水孔蛋白 1 和
2亚家族中表达量最高的一类基因[1], 在 BiFC实验中
显示都可与 AtSM34 互作. 因此, 我们选择了这些亚
型来进一步检测 AtSM34 对其基因转录水平的影响.
实时定量 PCR 所用 TIP 基因引物参照 Beebo 等人[17]
的报道 . 如图 8 所示 , 正常和处理条件下 TIP1;1,
TIP1;2 和 TIP2;1 基因的表达水平在转基因植株中均
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2494
图 5 过表达 AtSM34导致转基因植物对渗透胁迫更加敏感
(a) WT 与过表达植株(OE-6 和 OE-10)在 1/2 MS 培养基及加入 400 mmol/L 甘露醇、400 mmol/L 山梨醇和 1 mol/L ABA 胁迫处理下的
种子萌发及早期生长. 春化后生长 5 d 进行拍照, 含有 400 mmol/L 山梨醇的培养基春化后生长 9 d 进行拍照; (b) WT 与过表达植株(OE-6
和 OE-10)在 1/2 MS 培养基及加入 400 mmol/L 甘露醇、400 mmol/L 山梨醇及 1 mol/L ABA 胁迫处理下 5 d 的萌发率统计折线图. 每种
植株大约使用 60 粒种子进行萌发实验. 标准偏差为 3 次独立的生物学实验结果所得
发生了一定变化. 渗透处理 12 h 后, 这 3 个 TIP 基因
在 WT 和过表达植株 OE-6, OE-10 的表达量都降低,
但在过 表达植株中 降低更快 . 这说明过量 表达
AtSM34 可能在渗透胁迫下影响了拟南芥种子萌发时
期一些内源 TIP 基因的表达.
3 讨论
通过研究我们鉴定了一个新的蛋白 AtSM34, 它
可能作为拟南芥液泡膜水孔蛋白的互作蛋白 , 并在
酵母和植物细胞中验证了它们的结合 . 在动物中已
经有很多水孔蛋白的互作蛋白被报道 , 但在植物中
2495
论 文
图 6 AtSM34基因在胁迫条件下的表达分析
(a) 300 mmol/L 甘露醇处理拟南芥 6 d 大的幼苗, 利用实时定量 PCR 检测处理不同时间段 AtSM34 的表达分析; (b) 将 6 d 大的拟南芥幼
苗在 300 mmol/L 甘露醇、10 μmol/L ABA, 5 μmol/L MV 及 3%葡萄糖等各种胁迫下进行处理 4 和 12 h, 以 1/2 MS 处理作为对照, 提取
总 RNA 进行实时定量 PCR 分析. ACTIN2/8 作为内参基因. 标准偏差为 3 次独立的生物学实验结果所得
图 7 AtSM34与其他 TIPs的结合研究
(a) 双分子荧光互补实验分析显示 AtSM34 能与 AtTIP1;2 和 AtTIP2;1 结合. YFP, 黄色荧光蛋白信号; DIC, 明场; Merge, 2 张图片的叠
加. 比例尺为 5 µm; (b) 酵母泛素分裂系统实验分析 AtSM34 与其他 TIPs 的结合. AtSM34-Cub/pAlg5-NubG 作为阴性对照. (Ⅰ) 为 SD/
-Trp-Leu 培养基; (Ⅱ) 为含 10 mmol/L 3-AT 的 SD/-Trp-Leu-His 培养基; (Ⅲ) 为 β-半乳糖苷酶活性检测
很少有报道 , 除了一些已知水孔蛋白形成同源或异
源聚合体[35]. TIP 是植物中含量最丰富的一类水孔蛋
白 , 因此对其相关蛋白的探索将有助于阐明其功能
及其调控机制.
众所周知, 在所有植物水孔蛋白合成过程中, 在
其成熟前都是通过分泌途径到达其最终的亚细胞定
位区域. 已有研究显示, TIP 蛋白大部分定位于液泡
膜上[12]. 但在渗透胁迫下, McTIP1;2 (McMIPF)蛋白
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2496
图 8 渗透胁迫处理下 TIPs基因在WT与过表达植株(OE-6和 OE-10)中的相对表达量
利用实时定量 PCR 检测渗透胁迫处理下 WT 与过表达植株(OE-6 和 OE-10)中 TIP1;1, TIP1;2 和 TIP2;1 基因的相对表达量. 1/2 MS 培养基
生长 6 d 的拟南芥幼苗, 在加入 300 mmol/L 甘露醇的液体培养基中浸泡 12 h. 柱状图表示该基因相对野生型表达量的倍数变化. ACTIN2/8
作为内参基因. 标准偏差为 3 次独立的生物学实验结果所得
可被重新定位于内涵体中 [14]. 最近 , 研究显示水孔
蛋白的转运对其表达和功能调控具有重要作用 [35].
BiFC 共定位结果显示, 互作发生于小囊泡中, 其可
能参与水孔蛋白从内质网到液泡的分选过程 , 但具
体机制还需进一步研究.
当截去 AtSM34 N 端前 83 个氨基酸, 互作方式
发生了改变 , 可能由于跨膜区的缺失使其位于胞质
中 , 从 而 能 够 与 TIP1;1 的 胞 质 区 直 接 互 作 .
AtSM34∆83 作为可溶性蛋白在胞质中合成, 不再依
赖于分泌途径 . 因此 , 它们的互作发生在液泡膜上 ,
与 TIP1;1 的定位方式一致.
AtSM34 启动子驱动的 GUS 转基因植物研究显示,
在刚萌发种子的子叶(图 2(a))及小苗(图 2(b)和(c))中
可以检测到明显的 GUS 信号, 说明 AtSM34 可能参与
种子萌发及幼苗早期生长.
水孔蛋白在细胞的渗透调节、种子发育晚期的液
泡形态建成及萌发早期阶段均发挥着重要作用 [15].
有报道显示 , 种子成熟和萌发时期都有大量液泡膜
水孔蛋白(α-TIP, β-TIP 和 TIP3s)参与[36,37], 且水孔蛋
白的初始表达量与种子萌发率具有一定相关性 [38].
在生长和发育中 , 液泡膜水孔蛋白调节着液泡的渗
透性并介导细胞间水分运输. 因此, 水孔蛋白有助于
种子萌发的水分吸收 , 并促进组织扩张与细胞增大
所需水分的供应[38,39]. 从定量 PCR 结果来看, 渗透
处理下, TIP1;1, TIP1;2 和 TIP2;1 基因在过表达植株
中表达量更低. 因此, 我们推测, 渗透胁迫下, 过表
达植株由于 TIPs 表达的降低, 水分平衡调节能力减
弱, 吸收水分慢于野生型, 导致过表达植株在高渗下
萌发和生长延缓. 此外, 拟南芥中有 10 个 TIP 亚型,
也不能排除 AtSM34 与其他水孔蛋白互作, 从而导致
渗透胁迫下生长早期的萌发延迟.
为进一步探讨 AtSM34 在渗透胁迫中发挥的作
用, 我们利用实时定量 PCR 检测了渗透胁迫相关的
一系列已知 marker 基因, 其中包括 RD22, RD29A,
DREB2A, COR47, KIN1, KIN2, ERD10, NCED3, ADH1
和 bZIP60 等. 在渗透胁迫 12 h 后, 除 RD29A 在
AtSM34 过表达植株中的表达量明显低于野生型(图
S1), 其他基因的表达变化与表型没有明显的相关性.
一般认为, RD29A 启动子区至少存在 2 个顺式作用元
件, 一个是 ABA 相关的干旱应答元件, 另一个为渗
透压变化所诱导[40]. 这说明 AtSM34 参与渗透胁迫可
能不是通过典型的信号转导途径.
植物中广泛存在 MYB 类蛋白及 MYB 类似蛋白,
它们在生长发育、代谢调控、生物与非生物胁迫应答
过程中具有重要功能[19,41~44]. 一些具有 MYB/SANT
类似结构域而不同于 MYB 样转录因子的蛋白正逐渐
被发现 . 在西红柿和拟南芥中异源表达西红柿特异
的早期结实基因(early fruit specific gene) Lefsm1, 转
基因幼苗发育受严重影响, 导致生长迟缓, 并且缺乏
顶端优势[45]. MYB 相关基因参与了其他许多植物特
异的生理过程, 但是其生理功能没有被完全揭示, 许
多 MYB 类似蛋白的性质尚不清楚[46]. 另外, AtSM34
2497
论 文
有可能作为一个膜滞留的转录因子 , 不排除其与除
水孔蛋 白外的其他 蛋白互作 , 从而导致过 表达
AtSM34 植株萌发的延迟.
AtSM34 在植物早期渗透胁迫响应所发挥的功能
仍需进一步鉴定. 对于 AtSM34 下游目标基因的进一
步研究, 将有助于更深入地阐明其分子生物学功能.
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补充材料
图 S1 渗透胁迫处理下 RD29A基因在野生型(WT)与过表达植株(OE-6和 OE-10)中的相对表达量
本文的以上补充材料见网络版 csb.scichina.com. 补充材料为作者提供的原始数据, 作者对其学术质量和
内容负责.