全 文 ：基金项目：NSFC-河南人才培养联合基金(No. U1204308)和河南省教育厅高等学校重点科研项目(No. 13A180437)
收稿日期：2015-04-09 接受日期：2015-04-29
拟南芥ZYP1蛋白的原核表达、多克隆抗体制备及细胞学行为分析
毋瑞华 杨妍 刘征 程征 田保明 位芳*
郑州大学生命科学学院郑州 450001
*通讯作者，fangwei@zzu.edu.cn
摘 要 为分析联会复合体(synaptonemal complex, SC)相关蛋白ZYP1在植物减数分裂过程细胞学行
为，本研究通过克隆拟南芥(Arabidopsis thaliana) ZYP1基因片段，构建重组载体pET-28a(+)-ZYP1，优化大
肠杆菌 (Escherichia coli）诱导表达体系，将亲和层析纯化后的 ZYP1融合蛋白，免疫新西兰大白兔
(Oryctolagus cuniculus)，制备 ZYP1蛋白的多克隆抗体，并通过Western blot和酶联接免疫吸附剂测定(
Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay, ELISA)确定抗血清的特异性和效价。结果表明，成功构建的拟南
芥 ZYP1原核表达载体，在大肠杆菌中以 1.0 mmol/L异丙基 -β- D-硫代半乳糖苷 (isopropyl-β- D-
thiogalactoside, IPTG)，37 ℃诱导表达 4 h后，融合蛋白得到高水平表达。所制备的多克隆抗体具有较高
的特异性和灵敏性，通过免疫荧光染色，能够检测或定位植物细胞内ZYP1蛋白抗原。同时，免疫荧光分
析结果表明，ZYP1蛋白在减数分裂前期过程的细线期开始出现，双线期逐步减少，到达终变期时几乎消
失，因此，ZYP1蛋白的动态变化与SC的形成与解散一致，是调控减数分裂期同源染色体联会的重要组
成。研究结果有助于深入分析联会复合体相关蛋白ZYP1在植物减数分裂过程中的生物学功能。
关键词 拟南芥，ZYP1，亲和纯化，多克隆抗体，免疫荧光染色
Prokaryotic Expression, Polyclonal Antibody Preparation and
Cytological Analysis of ZYP1 in Arabidopsis thaliana
WU Rui-Hua YANG Yan LIU Zheng CHENG Zheng TIAN Bao-Ming WEI Fang*
School of Life Sciences, Zhengzhou University, Zhengzhou 450001, China
* Corresponding author, fangwei@zzu.edu.cn
Abstract To analyze the cytological behavior of synaptonemal complex (SC) related protein ZYP1 in plant
meiosis, a recombinant vector pET28a- ZYP1 by cloning fragment of ZYP1 gene was constructed. The
induction condition of the fusion protein expression in Escherichia coli was optimized. Polyclonal antibody
was produced by immuning New Zealand rabbits (Oryctolagus cuniculus) with the protein which was purified
by Ni- NTA affinity chromatography. The specificity and titer of the purified polyclonal antibody was
examined by Western blot and ELISA. The results showed that the Arabidopsis thaliana ZYP1 prokaryotic
expression vector was successfully constructed, and the optimized protein expression induction condition in E.
coli was 1.0 mmol/L isopropy-β-D-thiogalactoside (IPTG) at 37 ℃ for 4 h. The polyclonal antibody had high
specificity and sensitivity. It was able to detect and locate the antegin of ZYP1 protein in plant cells by
immunofluorescence staining. The results of immunofluorescence staining showed that ZYP1 protein
appeared at leptotene and gradually reduced at diplonema and nearly disappeared at diakinesis. The ZYP1
protein was an important part of regulating the synapsis of homologous chromosomes in meiosis, and the
Online system: http://www.jabiotech.org
农 业 生 物 技 术 学 报
Journal of Agricultural Biotechnology
2015, 23(12): 1568~1575
DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2015.12.005
联会复合体 (synaptonemal complex, SC)是同
源染色体间由各蛋白组分聚集而成的超级复合结
构，其在减数分裂前期Ⅰ发挥作用。这种复合结构
对染色体的配对、联会、交换和分离有一定影响(刘
春霞等, 2010)。SC在细线期出现，偶线期逐步组
装，粗线期趋于成熟，而从双线期开始解体(Börner
et al., 2004)。若其出现异常，将直接导致减数分裂
不能正常进行，甚至不育 (Osman et al., 2006)。
ZYP1是拟南芥(Arabidopsis thaliana)中 SC的组成
蛋白，也是高等植物中所分离的第一个联会复合体
相关蛋白(Heyting, 1996; Osman et al., 2006)，编码
841个氨基酸。
近年来，有关ZYP1蛋白在减数分裂过程中的
作用研究逐渐深入。ZYP1蛋白信号在细线期后期
出现，粗线期开始延长，直至信号扩展到整个同源
染色体(Higgins, 2013)，终变期时几乎消失。其与
同源染色体联会和交叉相关 (Knoll et al., 2012)。
在ZYP1缺失的情况下，SC不能正常形成，致使减
数分裂前期Ⅰ进程推迟(Khoo et al., 2012)。ZEP1
为ZYP1在水稻(Oryza sativa)中的同源蛋白，与其他
横向细丝蛋白功能相似，也会影响水稻的正常联
会。拟南芥缺少ZYP1横向细丝蛋白的突变体及
水稻缺少ZEP1横向细丝蛋白的突变体，都不能正
常形成SC，同源染色体交叉也都出现缺陷(Libuda
et al., 2013)。在拟南芥ZYP1突变体中，交叉频率
比正常的减少 70%(Higgins et al., 2005)；而在水稻
ZEP1突变体中，交叉频率较野生型有所增加(Bara-
kate et al., 2014)。染色体交叉出现缺陷造成大约
编码 30%到 50%基因的染色体片段发生区域间异
位重组，进而引起多价体的形成 (Drouaud et al.,
2013)。对植物育种来说这是一个很大的问题，因
为其限制了出现遗传变异、基因隔离和新的遗传性
状基因渗入的可能性(Wang et al., 2010)。
目前有关 ZYP1蛋白在减数分裂过程作用中
的相关研究主要集中在利用免疫荧光技术，通过制
备抗体对细胞内ZYP1蛋白进行定位和定量分析
(Zhang et al., 2013)。抗体是研究基因功能的重要
工具，根据抗体制备的原理和方法可以分为多克隆
抗体、单克隆抗体及基因工程抗体3种。而利用家
兔(Oryctolagus cuniculus)制备多克隆抗体具有敏感
性高、稳定性好等优点，此技术经过长期实践已经
发展得较为成熟 (Arur, Schedl, 2014)。本研究通过
PCR的方法扩增ZYP1基因片段，再与原核表达载
体相连，在大肠杆菌(Escherichia coli)细胞中诱导高
效表达，纯化蛋白后免疫新西兰大白兔，制备多克
隆抗体(刘欢等, 2015; 巩培杰等, 2013)，经荧光标
记后，利用免疫荧光染色技术，结合减数分裂各时
期细胞中染色体的变化特征，对ZYP1蛋白进行细
胞定位分析。本研究所制备的多克隆抗体与植物
细胞内ZYP1蛋白有较好的结合能力，而且进行免
疫荧光染色时所选的减数分裂细胞内染色体形态
清晰，各时期特征鲜明，易于鉴别区分。这为深入
分析联会复合体相关蛋白ZYP1在植物减数分裂过
程细胞学行为提供了基础资料。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株和质粒
pET-28a(+)质粒由本实验室保存。大肠杆菌
(Escherichia coli)DH5α和BL21(DE3)感受态细胞购
自康为生物(北京)公司。
1.1.2 主要试剂
Pfu酶、限制性内切酶BamHⅠ、XhoⅠ和DNA
连接酶购自Thermo(美国)；PCR胶回收试剂盒和质
粒提取试剂盒购自天根生物(北京)公司，RNA反转
录试剂盒及异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(isopropy-β-
D-thiogalactoside, IPTG)等常用分子生物学试剂购
自康为生物(北京)公司；辣根过氧化物酶(horserad-
ish peroxidase, HRP)标记的羊抗兔 IgG购自博士德
生物(武汉)公司，ECL化学发光检测试剂盒、弗氏
完全佐剂、弗氏不完全佐剂和荧光二抗购自Sigma
(美国)；引物由上海生工生物(上海)公司合成。
1.1.3 实验动物
新西兰大白兔(Oryctolagus cuniculus)2只，体重
1.5~2.0 kg，由郑州大学动物实验中心提供。
dynamic changes was consistent with the formation and dissolution of the synaptonemal complex. This study
is helpful to deep analysis of the biological functions of ZYP1 in plant meiosis, which is the related protein of
synaptonemal complex.
Keywords Arabidopsis thaliana, ZYP1, Affinity purification, Polyclonal antibody, Immunofluorescence staining
拟南芥ZYP1蛋白的原核表达、抗体制备及细胞学行为分析
Prokaryotic Expression, Polyclonal Antibody Preparation and Cytological Analysis of ZYP1 in Arabidopsis thaliana 1569
农业生物技术学报
Journal of Agricultural Biotechnology
1.2 方法
1.2.1 原核表达载体pET-28a(+)-ZYP1的构建及鉴定
在TAIR(https://www.arabidopsis.org/)中查到拟
南 芥 (Arabidopsis thaliana)ZYP1 基 因 ( 登 录 号:
AT1G22260)，利用Primer Premier 5设计带有BamH
Ⅰ和XhoⅠ酶切位点(下划线部分)的引物：
Primer-F：5GGGGGATCCATGCTGTGATAACAAAATTGG 3；
BamHⅠ
Primer-R：5GGGCTCGAGCTTCTTATCCTCTGATGTCTT3
XhoⅠ
以CTAB法(十六烷基三甲基溴化铵法，Hexa-
decyltrimethy Ammonium Bromide) ( 宗 成 志 等,
2011)提取拟南芥花序中的ZYP1总RNA，并做反转
录获得 cDNA，再以该 cDNA为模板，通过 PCR扩
增目的片段。PCR反应体系(20 μL)：模板 cDNA
(1.8 mmol/L) 2 μL、正向和反向引物 (25 μmol/L)
0.5 μL、dNTP (2.5 mmol/L)2 μL、10×buffer 2 μL、
Pfu (2 μmol/μL) 0.5 μL，用灭菌双蒸水补足 20
μL。PCR的反应程序：94 ℃预变性5 min；95 ℃变
性 30 s，60 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 100 s，循环 35
次；72 ℃延伸10 min。
分别用 BamHⅠ和 XhoⅠ对 PCR产物和载体
pET-28a(+)进行双酶切，用T4连接酶连接切产物。
连接产物用 CaCl2法通过热激转化至大肠杆菌
DH5α菌株，涂布在LB固体平板(酵母膏 5 g/L, 胰
蛋白胨 10 g/L,氯化钠 10 g/L,琼脂粉 15 g/L;含 50
μg/mL氨苄青霉素)上，37 ℃恒温培养过夜，次日挑
取单菌落做菌落验证，挑取阳性的单菌落于LB液
体培基(胰蛋白胨10 g/L,酵母膏5 g/L,氯化钠10 g/
L; 含 50 μg/mL氨苄青霉素)中 37 ℃过夜培养，用
试剂盒提取质粒，进行 BamHⅠ、XhoⅠ双酶切验
证。将鉴定为阳性的菌落送公司测序，保存测序正
确的菌种。
1.2.2 pET-28a(+)-ZYP1融合蛋白的表达和鉴定
将经验证为阳性的质粒pET-28a(+)-ZYP1转化
至大肠杆菌 BL21(DE3)中，并涂布到 LB固体(含
50 μg/mL氨苄青霉素)平板上，37 ℃培养过夜。挑
取单菌落接种于LB液体培养基(含50 μg/mL氨苄
青霉素)中过夜培养。次日，按体积比1∶100的比例
接种到100 mL的LB液体培养基(含50 μg/mL氨苄
青霉素)中培养至OD600达到 0.6~0.8时，加入 IPTG
(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷, Isopropyl β-D-1-
Thiogalactopyranoside)使其终浓度为1.0 mmol/mL，
用以诱导ZYP1融合蛋白的表达。冰浴中进行超声
波破碎(每个循环均为破碎5 s,暂停3 s,共10 min)，
依次取菌液、破碎后的上清、重悬的菌体沉淀进行
12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium
dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,
SDS-PAGE)检测融合蛋白的表达。
经 IPTG诱导表达的产物，破碎后取上清和沉
淀，使用 anti-His Tag(兔源)作为一抗，HRP标记的
羊抗兔 IgG作为二抗，进行Western blot检测(Arur,
Schedl, 2014)。
1.2.3 ZYP1融合蛋白的纯化
大量诱导融合蛋白表达，诱导结束后，离心收集
菌体沉淀，用磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solu-
tion, PBS)重悬沉淀，加入溶菌酶(终浓度 1 mg/mL)
孵育30 min后，在冰浴中进行超声波破碎。参照王
增等(2009)的方法，对包涵体的可溶性处理：将沉淀
重悬于洗涤缓冲液(0.01%TritonX-100, 50 mmol/L
Tris-Cl, 10 mmol/L乙二胺四乙酸(ethylene diamine
tetraacetic acid, EDTA), pH 7.9)中，反复洗涤 3次，
12 000 r/min 4 ℃离心 10 min，分离上清和沉淀；沉
淀重悬于 Binding Buffer(20 mmol/L Tris- HCl, pH
7.9, 5 mmol/L咪唑, 0.5 mol/L NaCl, 8 mol/L尿素)
中，使沉淀充分溶解；离心收集上清用 0.22 μm膜
过滤，使用Ni Sepharose 6 fast flow纯化柱纯化目标
蛋白(纯化步骤按说明书进行)，12%SDS-PAGE检
测目标蛋白纯化结果。
1.2.4 多克隆抗体的制备
待新西兰大白兔于新环境中稳定 1 d后，耳静
脉取血，取血量约3 mL，作为检测抗血清效价时的
阴性对照。初次免疫取1.5 mg纯化蛋白与2 mL弗
氏完全佐剂混合，乳化器乳化充分后，采用皮下多
点注射的方法免疫新西兰大白兔。2周后取0.5 mg
纯化蛋白与1 mL弗氏不完全佐剂混合，同样方法对
白兔加强免疫。每次加强免疫前均从兔子耳缘静脉
少量取血，取血量约3 mL，使用琼脂糖免疫凝胶扩
散法检测抗血清效价。每次加强免疫使用剂量相
同，第3次加强免疫后，免疫剂量仍为0.5 mg/mL，从
耳缘静脉少量取血，Western blot检测抗血清特异
性，ELISA检测抗血清效价(王新桐等, 2014)。效价
合格后，颈动脉放血，血液4 ℃放置过夜，次日收集
血清，分装后-20 ℃冻存(张平等, 2008)。
1570
1.2.5 免疫荧光染色技术
早上 10点采集未开放的拟南芥花序，放入固
定液(无水乙醇∶冰乙酸=3∶1)中固定后，再放入酶
解液(5%的果胶酶与1%的纤维素酶)中酶解2 h，解
剖针击碎，75%乙醇冲入滤网过滤到离心管中，离
心(8 000 r/min, 5 min)，弃上清，加500 μL固定液混
匀可得细胞悬液(杨旭, 代西梅, 2009)。取适量细
胞悬液滴于干净载玻片上，洗耳球吹干压片观察细
胞各时期形态。
选择含有分裂期的拟南芥玻片于缓冲溶液(sa-
line sodium citrate, SSC)中漂洗，漂洗过程在 42 ℃
水浴锅中进行，用 0.1%TritonX-100增大细胞膜的
通透性。牛血清蛋白(bovine albumin, BSA)封闭
后，37 ℃恒温分别孵育抗血清和荧光二抗(Hsieh et
al., 2009)。滴加PI染液和抗荧光猝灭剂，荧光显微
镜观察结果。
2 结果与分析
2.1 pET-28a(+)-ZYP1表达载体构建及鉴定
选取的ZYP1基因片段长度为678 bp。从拟南
芥花序中提取的RNA反转录获得 cDNA，以该 cD-
NA为模板，通过PCR扩增目的片段(图1A)。并将
扩增片段连接至pET-28a(+)上，对阳性重组质粒进
行双酶切鉴定，可观察到大小在678 bp左右的片段
(图1B)。进一步测序结果证明，成功构建融合蛋白
表达载体pET28a(+)-ZYP1。
2.2 ZYP1融合蛋白的表达与纯化
将重组质粒转入大肠杆菌 BL21(DE3)，经
IPTG诱导表达后收获菌体沉淀和上清进行 SDS-
PAGE，与转化有空载体 pET28a(+ )的大肠杆菌
BL21(DE3)相比，25 kD处上清中没有融合蛋白表
达，沉淀中有表达，表明融合蛋白以包涵体的形式
图 1 ZYP1基因的PCR扩增(A)以及重组质粒pET28a(+)-
ZYP1的酶切验证(B)
Figure 1 Identification of plasmid pET-28a(+ )-ZYP1 by
PCR (A) and enzyme digestion (B)
M1：DL2000 marker；1：ZYP1基因片段PCR扩增产物。M2：
DL10000 marker；2：重组质粒 pET28a(+)-ZYP1；3：BamHⅠ
和XcoHⅠ双酶切重组质粒pET28a(+)-ZYP1
M1: DL2000 marker; 2: PCR product of ZYP1 gene fragment.
M2: DL10000 marker; 2: The plasmid pET-28a(+ )-ZYP1; 3:
The plasmid pET- 28a(+ )-ZYP1 digested with BamHⅠ and
XhoⅠ
2000
1000
750
500
250
bp M1 1
A
6000
4000
2000
1000
250
500
bp M2 2 3
B
图2 ZYP1融合蛋白的SDS-PAGE检测
Figure 2 SDS-PAGE analysis of the recombinant ZYP1
protein
M：蛋白分子量标准；1：未诱导条件下菌体蛋白；2：1.0
mmol/L IPTG诱导 4 h菌体蛋白；3：诱导后的菌体蛋白破碎
上清；4：诱导后的菌体蛋白破碎沉淀
M: Protein molecular weight marker; 1: Mycoprotein without
IPTG induction; 2: Mycoprotein induced with 1.0 mmol/L
IPTG for 4 h; 3: The soluble of the total protein after ultrasoni-
cation; 4: The sediment of the total protein after ultrasonication
100
70
55
40
35
15
25
10
kD M 1 2 3 4
图 3 不同条件下重组ZYP1蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)
中的表达
Figure 3 The expression of recombinant ZYP1 protein in
Escherichia coli BL21(DE3) under different condition
1~6：分别为 0.3、0.5、0.8、1.0、1.4和 2.0 mmol/L IPTG诱导 4
h；7~11：1.0 mmol/L IPTG分别诱导2、4、6、8和10 h；M：蛋白
分子量标准
1~6: 0.3, 0.5, 0.8, 1.0, 1.4 and 2.0 mmol/L IPTG for 4 h in-
duced, respectively; 7~11: 1.0 mmol/L IPTG induced for 2, 4,
6, 8 and 10 h induction, respectively; M: Protein molecular
weight markers
70
55
40
35
25
15
10
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 M kD
拟南芥ZYP1蛋白的原核表达、抗体制备及细胞学行为分析
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存在于沉淀中(图2)。
诱导温度为 37 ℃时，随着 IPTG浓度的升高，
蛋白表达量也随之升高，当 IPTG浓度为1.0 mmol/
L时，融合蛋白表达量达到最高(图 3)，为 1.55 mg/
mL，当 IPTG浓度继续增大时，融合蛋白表达量基
本不变，融合蛋白表达量随诱导时间的延长而增
加，诱导4 h后蛋白表达量基本不变。
将离心收集到的菌体超声破碎，取破碎后的沉
淀重悬于洗涤缓冲液中洗涤，除去细胞碎片其他杂
质蛋白，再将其重悬于上样缓冲液中，溶解后使用
镍柱纯化，得到纯度较高的目标蛋白(图4)。
2.3 抗血清特异性检测和效价测定
2.3.1 Western blot结果
以诱导表达 ZYP1蛋白的菌液和纯化的融合
蛋白为抗原，转移到 NC膜上，依次用抗血清和
HRP标记的羊抗兔 IgG孵育，漂洗后化学发光。结
果如图5所示，抗血清能够与约25 kD处的ZYP1蛋
白特异结合，证明所制备的多克隆抗体具有较好的
特异性。
2.3.2 ELISA结果
以纯化后的融合蛋白为抗原，抗血清以 1∶1
000、1∶5 000、1∶10 000、1∶50 000、1∶100 000、1∶
200 000和1∶500 000倍数稀释，间接ELISA法测定
免疫后获得的抗血清效价。制作滴定曲线，结果如
图 6所示。检测表明，抗体效价约达 1∶500 000，明
显高于未免疫兔血清。
2.4 ZYP1多克隆抗体的免疫定位
取未开放的幼小拟南芥花序，经细胞悬液制片
法后在光学显微镜下观察可以看到减数分裂期的
细胞，37 ℃恒温条件下孵育抗血清(一抗)和荧光二
抗，经充分漂洗之后在显微镜下观察到减数第一次
分裂前期细胞中出现荧光信号，在减数分裂细线期
出现，偶线期逐渐增多，随着减数分裂的继续进行，
粗线期趋于成熟，双线期开始减少，到达终变期时
几乎消失(图 7)。这表明ZYP1蛋白的动态变化与
SC的形成与解散一致，是调控减数分裂期同源染
色体联会的重要组成。
图4 纯化的ZYP1融合蛋白的SDS-PAGE检测
Figure 4 The purification of recombinant ZYP1 protein
detected by SDS-PAGE
M：蛋白分子量标准；1：第一次洗脱(11% elution buffer)；2第
二次洗脱(50% elution buffer)；3：第三次洗脱(100% elution
buffer)。箭头：重组ZYP1蛋白
M: Protein molecular weight marker; 1: Elution of the first time
(with 11% elution buffer); 2: Elution of the second time(with
50% elution buffer); 3: Elution of the third time(with 100%
elution buffer). Arrow: The recombinant ZYP1 protein
55
40
35
25
15
10
kD M 1 2 3
25 kD
图5 Western blot检测抗血清特异性
Figure 5 The specificity of antiserum detected by West⁃
ern blot
M：蛋白分子量标准；1：诱导表达全菌；2：纯化的ZYP1融合
蛋白。箭头：ZYP1重组蛋白
M: Prestained protein markers; 1: Total protein with IPTG in-
duction; 2: The purified ZYP1 protein. Arrow: The detected
ZYP1 recombinant protein
35
25
15
kD M 1 2
图6 间接ELISA检测ZYP1多克隆抗体效价
Figure 6 The titer detection of the ZYP1 polyclonal anti⁃
body by indirect ELISA
1: 1∶1000; 2: 1∶5000; 3: 1∶10000; 4: 1∶50000; 5: 1∶100000;
6: 1∶200000; 7: 1∶500000
0
0.3
0.6
0.9
1.2
1.5
1.8
2.1
1 2 3 4 5 6 7
免疫血清 Immune serum
未免疫血清 Negative serum
OD
45
0
稀释倍数 Dilution times
1572
3 讨论
由于原核表达系统在 IPTG的诱导下可实现
目标蛋白的大量表达，因此已成为制备特异性抗
体的常用方法，同时也为研究特定蛋白质的性质
和功能以及不同蛋白质间的相互作用和生化功能
提供了方便。本研究将 ZYP1基因克隆到 pET原
核表达载体上，用 IPTG来诱导融合蛋白表达。为
探究 IPTG诱导pET28a原核表达的最适条件，设置
0.3、0.5、0.8、1.0、1.4和 2.0 mmol/L的浓度梯度，同
时做时间梯度，分别为 2、4、6、8和 10 h，发现当
IPTG浓度为 1.0 mmol/L，诱导 4 h后表达量达到最
高，表明该体系可以实现ZYP1融合蛋白的高效表
达。亲和层析是最有效的生物活性物质纯化方
法，将带有 6个His标签的融合蛋白通过金属螯合
色谱进行分离，从而达到较好的纯化效果(王增等,
2009; Lin et al., 2007)。本研究在使用亲和层析法
时依次使用 11%、50%、100%的 Elution buffer分 3
次洗脱柱子，且柱子重复两次上样，得到了高纯度
的融合蛋白。
免疫荧光技术是将免疫学方法(抗原抗体特异
结合)与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原
在细胞内分布的方法。荧光素所发的荧光可在荧
光显微镜下检出 (Wiliem et al., 2013; Hosouchi et
图7 拟南芥中ZYP1蛋白在减数第一次分裂前期的免疫荧光定位
Figure 7 Immunolocalization of ZYP1 protein in Arabidopsis thaliana at early prophase I of meiosis
10 μm
10 μm
10 μm
10 μm
A
D
G
O
10 μm
10 μm
10 μm
10 μm
E
H
P
B
10 μm
10 μm
10 μm
10 μm
C
F
I
Q
PI染液染色
counterstained with PI
免疫荧光染色
immunolocalization
叠加
Merge
细线期
Leptotene
偶线期
Zygotene
粗线期
Pachytene
双线期
Diplonema
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al., 2002; Bennett et al., 2003)。这是常用的细胞内
蛋白定位方法。通过制备拟南芥ZYP1蛋白多克
隆抗体进行免疫荧光染色，国外有研究发现ZYP1
蛋白是联会复合体的组成部分，其在减数第一次分
裂前期出现并发挥作用，在野生型拟南芥中减数分
裂正常进行，而在ZYP1突变体或RNAi干扰的野
生株中减数分裂都会受到一定的影响，同源染色体
的配对和分离不能正常进行，从而导致单价体的形
成，染色体交叉也收到干扰,使得DNA双链断裂修
复受损,减数分裂进行推迟(Barakate et al., 2014)。
本研究采用直接免疫荧光法，通过抗原抗体结合的
原理，将获得的多克隆抗体稀释后直接敷于拟南芥
细胞悬液制成的玻片上，实现多克隆抗体与拟南芥
细胞内ZYP1蛋白的结合，再将兔种来源的荧光二
抗敷于玻片上，与多克隆抗体反应。荧光显微镜下
可以清晰的看到减数分裂细线期细胞内出现绿色
荧光，偶线期逐渐增多，双线期开始减少，到达终变
期几乎消失。本研究采用直接免疫荧光法，将抗体
直接敷于玻片上与抗原结合,用缓冲液洗去与其他
杂蛋白非特异性结合的抗体，只将特异性结合的保
留下来，从而能很好的实现对细胞内ZYP1蛋白的
定位分析，同时可对植物减数分裂前期细胞中的
ZYP1蛋白进行直接的蛋白质组织学与细胞学定量
分析检测，记录ZYP1蛋白在植物减数分裂中的细
胞学行为。
4 结论
本研究通过克隆拟南芥ZYP1片段基因，构建
重组载体 pET-28a(+)-ZYP1，利用大肠杆菌诱导表
达体系，表达重组蛋白。通过亲和层析的方法获得
纯化的ZYP1融合蛋白，免疫新西兰大白兔，制备
ZYP1蛋白多克隆抗体。Western blot检测到抗血
清有较高的特异性，为后期研究工作提供了保障。
取幼小的拟南芥花序制备细胞悬液并压片，将获得
的ZYP1蛋白抗体进行免疫荧光染色，在荧光显微
镜下观察到拟南芥减数分裂前期细胞中出现绿色
荧光信号，表明ZYP1蛋白在植物减数分裂前期表
达，在减数分裂细线期出现，偶线期逐渐增多，随着
减数分裂的继续进行，粗线期趋于成熟，双线期开
始减少，到达终变期时几乎消失。这为进一步探究
ZYP1蛋白在植物减数分裂中的作用机制提供了基
础资料。
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(责任编辑 靳晓霞)
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