全 文 ：第 33卷第 6期
20 1 0年1 1月
河 北 农 业 大 学 学 报
JOURNA L OF AGRICULT URAL UNIVERS IT Y OF HEBEI
　 　 Vol.33 No.6
Nov .2 0 1 0
文章编号:1000-1573(2010)06-0021-05
拟南芥抗灰霉病相关基因 BRG2的 RNAi
载体构建及转基因植株的筛选
郝丛丛 , 　陈　展 , 　邢继红 , 　董金皋
＊ (河北农业大学 植物分子病理学实验室 , 河北 保定 071001)
摘要:为研究 BRG2 基因在拟南芥抗灰霉病过程中的作用及其调控机理 , 试验构建了含拟南芥抗灰霉病相关基
因 BRG2 特异片段反向重复结构的 RNA 干扰(RNAi)载体 ,通过根癌农杆菌介导转化拟南芥及潮霉素筛选和
PCR检测 , 获得了 3 株阳性转基因植株;半定量 RT-PCR检测转基因株系中 BRG2 的表达情况 , 结果发现 ,转基
因株系中 BRG2 的表达产物比野生型(WT)明显降低 , 且转基因株系之间差异明显 ,表明该干扰载体转入拟南芥
能特异引起植株中 BRG2 基因表达量下降。
关　键　词:拟南芥;灰霉病;B RG2;RNAi
中图分类号:S 432.23 文献标志码:A
Construction of RNAi expression vector for resistance-related
gene BRG2 of Arabidopsis against Botrytis cinerea
and screening transgenic plants
HAO Cong-cong , CHEN Zhan , XING Ji-hong , DONG Jin-gao
(Plant Mo lecular Patholog y Lab., Agricultural Univ ersity of H ebei , Baoding 071001 , China)
Abstract:To identify the function and specific mechanism o f Arabidopsis BRG2 gene in the de-
fense response to Botry tis , the RNAi vector containing BRG2 gene-specific sequences in the
sense and antisense orientations w as constructed and transferred into Arabidopsis by using the
f loral-dip method , and 3 transgenic lines w ere obtained through hygromycin B screening and
PCR assay s.The expression product o f BRG2 in t ransgenic lines w as obviously reduced com-
pared wi th that of Col-0(WT)by simi-quantity RT-PCR analysis.In addition , there are some
remarkable di fferences in BRG2 expression products betw een transgenic lines.The re sults re-
vealed that the RNAi vecto r has been inse rted the genome of Arabidopsis and induced the de-
crease o f BRG2 gene expression.
Key words:Arabidopsis thaliana ;Botry tis cinerea ;BRG2;RNAi
　　灰霉病(由灰葡萄孢 Botry tis cinerea 引起)是
蔬菜生产上的一种世界性毁灭病害 ,严重影响着蔬
菜的产量和品质。近年来 ,随着温室大棚蔬菜面积
的扩大 ,灰霉病的发生日益严重 ,在我国现已成为设
施栽培蔬菜生产的重大障碍。目前 ,灰霉病的防治
仍以化学防治为主 ,但长期大量的使用化学药剂不
＊收稿日期:2010-09-09
基金项目:河北省自然科学基金项目(08B021)和河北农业大学“ 9816”科技重点项目资助.
作者简介:郝丛丛(1986-),女 , 河北省衡水市人 , 在读硕士生 ,研究方向:生物化学与分子生物学.
通讯作者:董金皋(1963-),男 , 河北省邢台市人 , 教授 ,研究方向:植物分子病理学.E-mail:shmdjg@hebau.edu.cn
邢继红(1977-),女 , 河北省沧州人 , 副教授 ,研究方向:植物分子病理学.
　　　　　 河 北 农 业 大 学 学 报 第 33卷
仅对环境造成污染 ,影响人类健康 ,而且由于灰葡萄
孢对杀菌剂频繁产生抗性[ 1-2] ,致使田间防治效果明
显下降。因此寻找 、分离植物抗灰葡萄孢基因 ,并通
过基因工程手段 ,培育具有相应抗病性的蔬菜新品
种 ,无疑是根治灰霉病的理想途径之一。拟南芥是
研究植物与病原物互作的模式植物之一 ,迄今为止 ,
人们已经从拟南芥中克隆到了 20多个抗病基因 ,其
中部分抗病基因已经应用到生产上。近 10年来出
现了关于鉴定 、分离植物灰霉病抗性基因的报道 。
美国的 Mengiste实验室鉴定克隆了几个编码转录
因子 R2R3MYB 、WRKY33和编码蛋白激酶 BIK 的
基因[ 3-5] 。有研究者通过研究灰葡萄孢侵染拟南芥
的基因表达模式 , 鉴定出转录因子 WRK70 和
ZFA R1的编码基因[ 6] 。这些基因失活 ,植物易感染
灰霉病。本实验室前期研究利用 DDRT-PCR和反
式 Nor thern杂交技术获得了拟南芥感灰霉病生态
型 Ler 接种灰葡 萄孢后诱导不表达的基 因
AT4G39180.1[ 7] ,推测其与拟南芥抗灰霉病相关 ,
命名为 BRG2(Botryt is cinerea-resistant related
gene)。为了明确该基因的功能及其在拟南芥抗灰
霉病过程中的作用 ,本研究构建了 BRG2 基因的
RNAi表达载体 ,并对拟南芥进行了遗传转化 ,为进
一步研究该基因的功能奠定基础。
1　材料和方法
1.1　试验材料
拟南芥(Arabidopsis thaliana)Ler 、Col-0生态
型由美国丹佛植物科学中心夏亦荠博士提供;大肠
杆菌 DH5α菌株为本实验室保存;pCAMBIA1300
双元载体为北京生命科学研究所马力耕教授惠赠 。
1.2　拟南芥基因组 DNA的提取(CTAB法)
采用 CTAB 法提取拟南芥 Ler 基因组 DNA ,
经 0.8%琼脂糖凝胶和紫外分光光度计检测。
1.3　引物的设计
根据 BRG2基因 DNA全长序列及植物双元载
体 pCAMBIA1300的酶切位点 ,在 BRG2基因内部
第 3 673个碱基至第 4 098个碱基之间设计引物 ,扩
增 676 bp序列作为正义基因片段(包含一段内含子
序列)。PCR引物分别含有 BamH Ⅰ和 SacⅠ限制
性内切酶位点 , 引物序列为:BRG2L +:TCTA-
GATGGAACGACCCTGAGA T ;BRG2R+:GGA T
CCG TCACTCCG TCCTGG TA 。在 BRG2 基因内
部第4 083个碱基至第 4 350个碱基之间设计引物 ,
扩增426 bp 序列作为反义基因片段 , PCR引物分别
含有 BamH Ⅰ和 Xba Ⅰ的限制性内切酶位点 ,引物
序列为:BRG2L -:GAGCTCTGGAACGACCCT-
GAGA T ;BRG2R -:GGATCCTAAGGTCGG-
TAGGG T TT 。
1.4　正 、反义基因片段的扩增 、克隆测序
以拟南芥 Ler 生态型的 DNA 为模板 ,分别用
引物 BRG2L +/BRG2R +和 BRG2L -/BRG2R -
扩增 BRG2的正 、反义基因片段。PCR反应体系:
Buf fer 2.5 μL ;dN TPs 2.0μL;MgCl2 2.0 μL;上游
引物 1.0 μL ;下游引物 1.0 μL;基因组 DNA 2.0
μL;Taq聚合酶 0.3 μL;H 2O 14.2 μL。PCR扩增
条件为:95 ℃预变性 5 min;94 ℃变性 30 s ,55 ℃退
火 30 s , 72 ℃延伸 1 min , 35 个循环;72 ℃延伸
10 min 。
扩增产物经 1%的琼脂糖凝胶检测后 ,回收目
的片段 ,回收产物分别与 pMD19-T simple vecto r
连接 ,转化大肠杆菌 DH5α。对阳性克隆进行 PCR
验证。对含有目的片段的质粒进行测序 , 利用
DNAMAN 软件与 BRG2基因序列进行比对。将测
序正确的质粒分别命名为 T19-BRG2F 和 T19-
BRG2R。
1.5　RNAi载体构建
BRG2基因的 RNAi载体构建策略如图 1所示。
将 T19-BRG2F 、T19-BRG2R和 pCAMBIA1300质粒
分别进行双酶切后 ,回收正义 、反义基因片段和
pCAMBIA1300载体片段 , 用 T4 连接酶连接。连
接产物转化 DH5α感受态细胞 ,采用 PCR和酶切鉴
定阳性克隆 。
图 1　BRG2 基因 RNAi表达载体示意图
Fig.1　Construction of RNA interference vector for BRG2
1.6　拟南芥转化
将构建好的 RNA i载体转化农杆菌GV3101感
受态细胞 ,挑取活化的含有目的载体的 GV3101 单
菌落于 5 mL 新鲜 YEB 液体培养基(Hyg 25 μL/
mL , Rif 125 mg/L)中 , 28 ℃ 220 r/min 震荡培养
13 h ,使 OD600值达到 1.2 ～ 1.6 之间。室温 , 4 000
22
　第 6期　郝丛丛等:拟南芥抗灰霉病相关基因 BRG2的 RNAi载体构建及转基因植株的筛选
r/min ,离心 10 min ,弃上清 ,用转化介质重悬沉淀
至 OD 600值达到 0.8 左右 。将拟南芥 Col-0 花盆倒
扣于装有菌悬液的烧杯中 ,使植株的花序浸没在菌
液中 ,浸润持续 5 min ,转化后将植株黑暗保湿培养
24 h后转移到培养室培养。待拟南芥角果大部分
都变枯黄后 ,即可收 T 0 代种子。 T0 代种子经消毒
后 ,播种于选择培养基上进行潮霉素抗性筛选 。选
择生长正常的绿苗 ,将其移植到营养土中继续培养 。
1.7　转基因拟南芥的 PCR检测
利用 CTA B法提取拟南芥基因组 DNA , 进行
PCR扩增检测 , PCR引物设计参照 HYB 基因内部
片段两端序列 ,引物的序列为:HGYR:5′-ACGTC-
CTG TAGAAACCCCAACC-3′, HGYL :5′-TCCC
GGCAATAACA TACGGCGT-3′。
1.8 半定量 RT-PCR
采用 Trizol法 ,分别提取转基因和野生型的总
RNA ,经 1%琼脂糖凝胶电泳检测后用 TaKaRa 公
司的 AMV 反转录试剂盒合成 cDNA 。分别以野生
型和转基因株系的 cDNA 为模板 ,用 BRG2基因特
异引物进行 PCR扩增 。同时扩增拟南芥 Act in 基
因为内参。 PCR 反应体系:cDNA 模板 1.0 μL;
Buffer 2.5μL;dN TPs 2.0μL;上游引物1.0μL;下
游引物 1.0 μL ;Taq聚合酶 0.3 μL;H 2O 17.2μL。
PCR扩增条件为:94 ℃预变性 5 min;94 ℃变性
30 s ,退火温度 30 s , 72 ℃延伸 50 s , 20 ～ 35 个循
环;72 ℃延伸 10 min。扩增产物用 1%的琼脂糖凝
胶检测。
2　结果与分析
2.1　正义 、反义基因片段的扩增
以拟南芥 Ler 生态型的基因组 DNA 为模板 ,
分别用引物 BRG2L +/BRG2R +和 BRG2L -/
BRG2R-扩增目的基因的正义和反义基因片段 。
电泳检测发现 ,均获得与目的片段大小一致的单一
条带(图 2)。将目的条带进行回收后 , 分别与
pMD19-T Simple Vecto r 连接 、转化 DH5α, 构建
T19-BRG2F 和 T19-BRG2R载体 。
1～ 5.反义基因片段;6～ 10.正义基因片段
图 2　BRG2基因正义 、反义片段的扩增
Fig.2　PCR results of the antisense and sense of BRG2
2.2　T19-BRG2F 、T19-BRG2R载体的 PCR验证
利用载体上的 M13引物对所构建 T19-BRG2F
和 T19-BRG2R载体进行 PCR 检测。所得到的扩
增条带均为单一条带 ,与目的片段的大小一致(图
3)。选取阳性的单克隆样品进行测序 ,测序结果与
目的基因片段的序列完全一致。
M:DNA marker;1～ 3:PCR扩增条带.
图 3　T19-BRG2F(A)、T19-BRG2R(B)载体的 PCR 检测
Fig.3　PCR results of T19-BRG2F and T19-BRG2R(B)
2.3　正义 、反义基因片段和 pCAMBIA1300的制备
将 T19-BRG2F 和 T19-BRG2R 质粒分别用
Xba Ⅰ/BamH Ⅰ和 BamH Ⅰ/Sac Ⅰ进行双酶切 ,酶
切产物在 1.0%的琼脂糖凝胶中电泳检测 。发现均
酶切出目的条带(图 4A 、B), 回收目的条带。
pCAMBIA1300质粒用 Xba Ⅰ和 Sac Ⅰ双酶切 ,酶
切产物在 1.0%的琼脂糖凝胶中电泳检测(图 4C),
回收载体片段。
M:DNA marker;1～ 2:酶切产物.
图 4　T19-BRG2F(A)、T19-BRG2R(B)和
pCAMBIA1300(C)双酶切电泳图谱
Fig.4　Enzyme digest result of T19-BRG2F ,
T19-BRG2R and pCAMBIA1300
2.4　RNAi载体鉴定
试验对所构建的 RNAi质粒载体分别用 Xba
Ⅰ/BamH Ⅰ和 BamH Ⅰ/Sac Ⅰ进行双酶切验证 ,结
果发现 ,均酶切出单一条带 ,与目的片段大小一致
(图 5)。表明 RNAi载体构建成功 。
23
　　　　　 河 北 农 业 大 学 学 报 第 33卷
M :Marker;1.XbaⅠ和 SacⅠ双酶切;2.X ba Ⅰ和 B amH Ⅰ双酶切;
3.BamH Ⅰ和 SacⅠ双酶切
图 5　RNAi质粒载体的双酶切电泳图谱
Fig.5　Enzyme digest result of RNA
　　interference vector for BRG2
2.5　转基因植株的抗性筛选及 PCR鉴定
Flo ral dip 法将所构建的 RNAi载体分别转化
拟南芥 Co l-0 ,收获 T 0 代种子 ,在培养皿中进行潮
霉素抗性筛选。转基因幼苗由于具有潮霉素抗性 ,
能够正常生长 ,为绿色 ,而非转基因幼苗由于没有潮
霉素抗性 ,为白化苗。提取潮霉素抗性植株的基因
组 DNA 进行 PCR检测(图 6),所有抗性植株中均
扩增到了特异目的条带 ,且片断大小与预期一致 ,而
非转基因植株中则没有扩增到任何条带 ,表明目的
外源基因已经成功整合到拟南芥基因组中。
M :marker;1～ 3.转基因植株;4.野生型对照　　
图 6　拟南芥转基因植株的 PCR 检测
Fig.6　PCR amplification of HYB in transgenic plants
2.6　转基因拟南芥的 RT-PCR检测
以阳性转基因植株的 cDNA 为模板 ,用 BRG2
基因和 Actin基因各自的特异性引物进行 PCR 扩
增反应 ,均获得了与目的条带大小一致的片段 。半
定量 RT-PCR 结果显示 , 3 个转基因植株中 BRG2
基因的表达量与野生型相比有不同程度的降低(图
7),表明该干扰载体转入拟南芥能特异地引起植株
BRG2基因表达量下降。
　　1～ 3为株转基因植株;4.野生型植株
图 7　BRG2 基因的半定量 RT-PCR分析
Fig.7　Simi-quantity RT-PCR analysis of
　　the expression analysis of BRG2
3　讨论
RNAi是近些年来获得迅猛发展的一项有效沉
默基因表达的技术 ,具有特异性 、稳定性 、高效 、快速
以及不改变基因组的遗传组成等特性 ,为人们研究
未知功能的基因提供了新的反向遗传学手段 ,被广
泛应用于植物的基因功能验证 ,遗传改良研究等各
个方面[ 8-10] 。该技术能够强有力地抑制序列特异的
目的基因表达 ,抑制效率高 ,操作简便 ,具有可重复
性 ,并且可以获得遗传上稳定的突变体[ 11] 。与传统
的同源重组基因敲除技术相比 , RNAi技术还可以
同时沉默同一基因家族的多个基因 。与 T-DNA 技
术相比 ,RNAi技术可以与诱导性启动子和细胞特
异性启动子结合使用 ,使其抑制基因表达的时间可
以随意控制在不同发育阶段或不同的器官组织中。
与反义 RNA技术相比 , RNAi技术在低于反义核酸
几个数量级的浓度下 ,使目标基因表达降到极低水
平甚至完全敲除。迄今为止 ,利用 RNAi技术已经
鉴定了线虫 、果蝇 、昆虫 、真菌 、植物 、哺乳动物中许
多新基因的功能 ,其中在拟南芥功能基因的研究中
应用最为广泛[ 12] 。本试验在未获得 BRG2基因的
T-DNA插入突变体的前提下 ,利用 RNAi技术构建
了该基因特异的沉默载体 ,经转化后获得了阳性转
基因植株 ,并初步验证了所构建载体的干扰效果 ,为
下一步的基因功能研究工作奠定了基础。从半定量
RT-PCR结果可以看出 , 3 个转基因植株中 BRG2
基因的表达量均比野生型有不同程度的降低 ,且转
基因株系之间差异明显 。表明 RNAi转基因株系中
BRG2 的表达确实受到不同程度的干扰 , 并且
RNAi转基因株系间基因沉默效果存在差异 。分析
转基因株系 BRG2表达水平差异的原因可能与转
入干扰基因的拷贝数及在基因组插入位点有关 。下
一步将拟南芥野生型和所获得的 BRG2 基因的
RNAi突变体接种灰葡萄孢 ,观察突变体是否感病
(野生型为抗病),从而初步确定该基因与拟南芥抗
灰霉病的关系。
参考文献:
[ 1] 　William son B , Tudzynski B , Tudzynski P , et a l.Botry-
tis cinerea:the cause of g rey mould disea se [ J] .Mo-
lecula r Plant Pathology , 2007 , 8:561-580.
[ 2] 　李保聚 , 朱国仁 ,赵奎华.番茄灰霉病在果实上的侵染
部位及其防治新技术 [ J] .植物病理学报 , 1999 , 29:
63-67.
24
　第 6期　郝丛丛等:拟南芥抗灰霉病相关基因 BRG2的 RNAi载体构建及转基因植株的筛选
[ 3 ] 　M eng iste T , Chen X , Salmeron J , et al.The BOTRY-
T IS SUSCEP TIBLE1 gene encode s an R2R3MYB
transcription fac to r pro tein that is requir ed fo r biotic
and abio tic stress response s in Arabidopsis[ J] .Plant
Cell , 2003 , 15(11):2551-2565.
[ 4 ] 　Denby K J , Kumar P , Kliebenstein D J.Identification
of Botry tis cinerea susceptibility lo ci in Arabidopsis
tha liana[ J] .Plant Journal , 2004 , 38(3):473-486.
[ 5 ] 　Veronese P , Nakagami H , Bluhm B , et al.The mem-
brane-ancho red BOTRYT IS-INDUCED KINASE1
play s distinct r ole s in Arabi dopsis re sistance to necro-
trophic and biotr ophic pathogens [ J] .Plant Cell ,
2006 , 18(1):257-273.
[ 6 ] 　AbuQamar S , Chen X , Dhawan R , et al.Expression
profiling and mutant analy sis revea ls comple x regula-
tory netw orks involved in Arabidopsis response to
Botry tis cinerea[ J] .Plant Journal , 2006 , 48:28-44.
[ 7 ] 　邢继红 ,瓮巧云 , 董金皋.拟南芥抗灰霉病菌相关基因
的差异表达分析[ J] .植物病理学报 , 2006 , 36(6):562-
565.
[ 8 ] 　Mattew L.RNAi fo r plant functional g enomics[ J] .
Compara tive and Functional Genomics , 2004 , 5:240-
244.
[ 9] 　Ogita S , Uefuji H , Yamguchi Y , et a l.P roducing de-
caffeinated coffee plants [ J] .Nature , 2003 , 423:823.
[ 10] 　Kusaba M , Miyahara K , Lida S , e t a l.Low g lutenin
content 1:a dominant mutation that suppresse s the
g lutenin multigene family via RNA silencing in rice
[ J] .The P lant Cell , 2003 , 15:1455-1467.
[ 11] 　王雷 ,种康 ,许智宏.植物功能基因组学研究的有效工
具——— RNAi技术[ J] .植物生理学通讯 , 2003 , 39(6):
705-710.
[ 12] 　Bisht M S , Mukai Y.Genomic in situ hybridization i-
dentifies g enome dono r o f finger millet(E leusine cor-
acana)[ J] .Theo r Appl Gene t , 2001 , 102:825-832.
(编辑:李　川)
(上接第 15页)
[ 8] 　Lara M V , Drincovich M F ,Mǜller G L , et al.NADP-
malic enzyme and H SP70:co-purification o f both pro-
teins and modification of NADP-malic enzyme proper-
ties by asso ciation with H SP70[ J] .P lant Cell Phy si-
ol , 2005 , 46(6):997-1006.
[ 9 ] 　Bates E E , Vergne P , Dumas C.Analy sis o f the cy-
tosolic HSP70 gene family in Zea mays [ J] .Plant Mo l
Biol , 1994 , 25(5):909-916.
[ 10] 　Wrobel R L , OBrian G R , Boston R S.Comparativ e a-
nalysis of BiP gene expression in maize endo sperm
[ J] .Gene , 1997 , 204(1-2):105-113.
[ 11] 　Lund A A , Blum P H , Bhattr amakki D , et al.Heat-
stress response of maize mito chondria[ J] .Plant Phy s-
iol , 1998 , 116(3):1097-1110.
[ 12] 　Yu Y , Mu H H , Mu-For ste r C , et al.Po lypeptides of
the maize amy loplast st roma.Stromal lo ca lization of
starch-biosynthetic enzymes and identification o f an
81-kilodalton amy loplast stromal heat-shock cognate
[ J] .Plant Phy siol , 1998 , 116(4):1451-1460.
[ 13] 　Rochester D E , Winer J A , Shah D M.The structure
and expression of maize genes encoding the majo r heat
shock pro tein , H SP70[ J] .EMBO J , 1986 , 5(3):451-
458.
[ 14] 　Hopf N , P lesofsky-Vig N , Brambl R.The heat shock
response of pollen and o ther tissues of maize[ J] .Plant
M ol Bio l , 1992 , 19(4):623-630.
[ 15] 　La tijnhouwer s M , Xu X M , Mller S G.Arabidopsis
st romal 70 kDa heat shock pro teins are essential for
chlo roplast development[ J] .P lanta , 2010 , 232(3):
567-578.
[ 16] 　Duan Y H , Guo J , Ding K , et al.Characteriza tion of a
w heat HS P70 gene and its expression in re sponse to
st ripe rust infection and abiotic stre sses[ M] .Mol Biol
Rep , 2010 M ay 27 , [ Epub ahead of print] .
(编辑:梁　虹)
25