全 文 ：第 39卷第 3期　　　　　　　　　　 　　　　　上海师范大学学报(自然科学版) Vol.39, No.3
2 0 1 0年 6月　　　　　　　　　　 JournalofShanghaiNormalUniversity(NaturalSciences) Jun., 2 0 1 0
拟南芥 MtN3 /saliva基因家族分析
何　佳 , 黄学勇 , 关跃峰 , 孙铭希 , 朱　骏 , 杨仲南＊
(上海师范大学 生命与环境科学学院 , 上海 200234)
摘　要:MtN3 /saliva基因家族是含有 2个 MtN3/saliva跨膜结构域的膜整合蛋白 ,其成员广泛
存在于真核生物中.目前对该家族功能研究较少 ,对其跨膜结构域的分子功能还不清楚.在拟
南芥中该家族有 18个成员 ,除了最近克隆的 RPG1以外其他 MtN3/saliva基因的功能均不清
楚.对拟南芥 MtN3 /saliva基因家族进行了较为全面的分析 ,包括基因结构 、染色体分布 、蛋白
结构域 、系统进化关系 、基因表达谱等.对其中预测在花药中高表达的 4个基因进行了实时定
量 PCR分析 ,证实有 3个基因在花中高效表达.这些结果促进了对 MtN3/saliva基因家族的深
入了解.
关键词:MtN3 /saliva基因家族;拟南芥;表达分析
中图分类号:Q943.2　　文献标识码:A　　文章编号:1000-5137(2010)03-0290-09
　　　　　　　　　　
收稿日期:2009-12-30
基金项目:国家自然科学基金(30770206).
作者简介:何　佳(1985-), 女 ,上海师范大学生命与环境科学学院硕士研究生;杨仲南(1965-),男 , 上海师范大
学生命与环境科学学院教授.
＊通讯作者
0　引　言
MtN3(MedicagotruncatulaNodulin3)结构域最早发现在苜蓿根部结瘤素(nodulin)MtN3蛋白中[ 1] ,
不久在果蝇胚胎唾液腺(salivarygland)的 saliva蛋白中也发现该保守结构域 [ 2] .此后 ,在小鼠 、人 、海鞘
及矮牵牛 、水稻 、拟南芥等植物中相继发现具有该结构域的蛋白.后来 ,该保守的跨膜结构域被命名为
MtN3 /saliva结构域 ,具有这一结构域的蛋白质统称为 MtN3/saliva蛋白家族 [ 3] .人体研究中曾发现的
Rga(Recombination-activatinggene1 geneactivation)是一个 MtN3 /saliva基因家族成员 ,对重组激活基
因(RecombinationActivatingGene)RAG-1基因的表达起激活作用 [ 4] .小鼠 Rga在玻璃海鞘(Ciona.Intesti-
nalis)的同源蛋白 CiRga对其胚胎发育具有重要作用[ 3] .通过免疫共沉淀试验和酵母双杂交实验发现 ,
Rga蛋白和人体中的离子通道蛋白 TRPV2有相互作用 [ 5, 6] .TRPV2是 TRP(transientreceptorpotential)
离子通道蛋白家族的成员 ,这类蛋白通常与细胞的应激反应有关 [ 7] .Rga有可能定位在内质网 /高尔基
体上的囊泡亚区室 ,并与 TRPV2蛋白在细胞内通过糖基化反应相互作用[ 5, 6] .
植物中的 MtN3/saliva家族基因通常和育性有关系.矮牵牛 NEC1基因在花蜜管与雄蕊中特异性表
达 [ 8] ,该基因的共沉默转基因植株表型为花药不开裂而导致雄性不育 [ 9] .水稻中的 Os8N3基因和水稻
对细菌的易感性有关 ,该基因的 RNAi转基因植株的花粉育性也有一定程度上的降低[ 10] .拟南芥 RPG1
(RUPTUREDPOLLENGRAIN1)是花药发育中起重要作用的该基因家族成员 [ 11] .RPG1是膜整合蛋白 ,
含 7个跨膜区域 ,在花药发育 5 ～ 7期小孢子母细胞和绒毡层中高表达.该基因突变体 rpg1雄性育性显
著降低 ,发育过程中大部分花粉降解 ,只有极少数花粉.突变体四分体时期小孢子质膜功能缺陷 ,导致孢
　第 3期 何　佳 , 黄学勇 , 关跃峰 , 等:拟南芥 MtN3/saliva基因家族分析 　　
粉素随机沉积在小孢子表面 ,花粉外壁发育受到影响和花粉败育 [ 11] .
拟南芥的 MtN3/saliva基因家族总共有 18个成员 ,除了 RPG1外 ,该家族其他成员功能尚不清楚.
本研究通过对鉴定的拟南芥 MtN3 /saliva基因家族成员进行系统分析 ,包括蛋白序列分析 、进化分析和
蛋白质的跨膜结构域分析 、基因的染色体定位 、表达谱 、基因结构分析等 ,希望对拟南芥中 MtN3/saliva
家族基因的功能研究提供有用的参考信息.
1　材料与方法
1.1　拟南芥 MtN3 /saliva家族基因的获得
从 TAIR(htp:∥www.arabidopsis.org)中获得 RPG1蛋白质(At5G40260)的氨基酸序列 ,根据 Pfam
数据库信息(htp:∥pfam.sanger.ac.uk/),分析出其具有的 2个拷贝 MtN3/saliva跨膜结构域 ,并将其作
为检索序 ,在 TAIR数据库中利用 BLASTp(htp:∥www.arabidopsis.org/Blast/index.jsp)的方法搜索基
因组数据最后在拟南芥中找到了 18个 MtN3/saliva家族基因.获得拟南芥 MtN3/saliva家族信息后 ,从
TAIR中下载相应的核苷酸和氨基酸序列.并用 TAIR的染色体绘图工具 (ChromosomeMapTool)将
MtN3 /saliva家族基因定位到 5条染色体上.
1.2　基因结构分析
将从 TAIR获得的拟南芥 MtN3 /saliva家族基因的 CDS序列和对应的全基因组序列 ,利用 Gene
StructureDisplayServer(htp:∥gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php)绘出基因结构图.
1.3　MtN3家族蛋白结构域分析
将从 TAIR获得的这 17个拟南芥 MtN3/saliva家族基因的氨基酸序列以 fasta格式输入 TMHMM
Serverv.2.0主页(htp:∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)参数设置为默认 ,预测出这 17个基因的
蛋白结构.
1.4　基因序列分析及构建系统进化树
利用 ClustalW(htp:∥align.genome.jp/)对获得的 17个拟南芥 MtN3/saliva家族基因的氨基酸序列进
行同源序列比对 ,参数为默认.利用 BOXSHADE(htp:∥www.ch.embnet.org/software/BOX form.html)突
出显示其保守或相似的氨基酸序列.以序列比对的结果为基础 ,利用 Mega软件(版本 4.1)进行进化树
校验生成拟南芥 MtN3/saliva家族成员的无根进化树.进化树生成采用邻接法 (neighbor-joining),由
1000次自举值(bootstrap)重复抽样组成.
1.5　表达分析
1.5.1　基因表达情况的获得
根据 TAIR提供的 e-FPBrowser的链接 ,综合 Genevestigater上的数据 ,得到各基因在各组织中的表
达情况.
1.5.2　RNA抽提反转录
RNase-freewater的制备:在蒸馏水中加入 0.1%体积的 DEPC原液 ,充分混匀 ,静置过夜 ,高温湿热
灭菌 4 h.研臼 、研杵 、小药勺 、三角瓶 ,量筒等的去除 RNase的处理:用锡箔纸包裹用具 , 180 ℃灭菌 2 h
或者 160 ℃高温干热灭菌 4 h.进口 tip头 , eppendorf管(1.5 mL0.5 mL)高压灭菌 ,烘干.塑料器皿用
0.1%DEPC水浸泡或用氯仿洗涤后高温湿热灭菌.
RNA抽提用植物材料:野生型 Col-0培养土中萌发 14 d的幼苗及生长 35 d左右的 Col-0的根 、茎 、
叶和花序.
操作步骤:称取 0.5 g植物材料 ,用液氮研磨成细粉 ,分装于两个 1.5 mL的 eppendorf管中(动作尽
量迅速 ,避 RNA降解).在每管加入 1 mLTRizol用力摆动使混合均匀 ,室温下放置 5 min(注意样品的量
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不要超过 TRIzol的 10%).如果当样品中蛋白 、脂肪 、多糖含量较高时 , 4 ℃, 12000 rpm,离心 10 min,将
上清吸入干净的 1.5 mL的 eppendorf管.并向每管加入 0.2 mL氯仿 ,用力振荡 15 s,室温放置 2 ～
3 min, 4 ℃, 12000 rpm,离心 15 min.离心后将上清液吸入干净的 1.5 mL的 eppendorf管中(约 600 μL),
加等体积异丙醇 ,颠倒混匀 ,室温放置 10 min.4 ℃, 12000 rp,离心 10 min.弃上清 ,加 1 mL75%乙醇 ,振
荡 , 4 ℃, 8000 rpm,离心 5 min.将液体倒掉 ,室温干燥 15 ～ 20 min.溶于适量(30 ～ 50 μL)去 RNase的水
中.55 ～ 60 ℃水浴 10 min,使 RNA充分溶解.吸取部分 ,用于后面部分反应 ,其余储存于 -70 ℃冰箱
(注:在开始下一步反应前需要先电泳检测和紫外分光光度仪检测所提取的 RNA的质量).
1.5.3　RNA反转录 cDNA
在无菌的离心管中将 2μgRNA与 0.5 μgOligo(dT)18混匀 , 70 ℃水浴 5min.取出后迅速置于冰浴中
5 min.然后加入以下组分混匀:5 μL的 5 ×反应缓冲液 , 2.5 μL的 dNTP混合物(各 2 ×10-3 mol/L), 40单
表 1　实验所用的实时定量 RT-PCR引物序列
引物名称 引物序列
28007RF TGTTCTTGTTCTTATCTCCCAT
28007RR CATTTATGGTGATCACAAGGA
62850RF ATTTCTTTCGGCTTGTTCTG
62850RR AAAGACCAGTTCCATTAATGGT
25010RF ATGGATTTACTATGCTCTGC
25010RR AAAACCCAAGAAATTCAAGA
50800RF CATATCATTCGTCGTGTTCTTG
50800RR TATGGTGATGAGAAGAAAGG
位的 RNA酶抑制剂 , 2.5 μL的 0.04 mol/L
焦磷酸钠 , 30单位的反转录酶 AMVRT,加入
去 RNase的水至终体积 25 μL.42 ℃水浴
60 min.72 ℃失活 10 min.反转录出的 cDNA
保存于 -20 ℃冰箱.
1.5.4　定量 PCR
分别将拟南芥的根、茎 、叶 、幼苗 、花等不同
组织总 RNA纯化并反转录合成 cDNA,具体方
法参照 1.5.2.以 cDNA作为模板对 At3G28007,
At5G62850, At4G25010和 At5G50800 4个基
因在不同组织中的表达进行了实时定量
PCR检测.所用引物序列见表 1.
2　结果与讨论
2.1　拟南芥 MtN3 /saliva家族成员确定及染色体分布
在拟南芥中共有 18个 MtN3/saliva家族基因 ,其中 At3G06433是个假基因 ,在后面将不对其进行分
析.其余 17个基因编码的产物均为 260个氨基酸左右的小型蛋白 ,氨基酸数目最大的 At5G50800为
294,最小的 At3G16690仅 230(表 2).除 RPG1(At5G40260)有报道外 ,其他成员在拟南芥中的功能还未
见报道.虽然 At5G13170曾被命名为 SAG29(SenescenceAsociatedGene29),预测与叶片衰老有关[ 12] ;
At5G62850曾被命名为 VEX1(VegetativeCelExpresed1),被认为是一个花粉营养细胞特异表达的基
因 [ 13] .然而 ,这两个基因的功能也没有具体的研究.
利用 TAIR的染色体绘图工具(ChromosomeMapTool)将 17个 MtN3 /saliva家族基因定位到 5条染
色体上(图 1).由图 1可以看到 ,拟南芥中这一家族 7个基因分布在第五条染色体上 , 4个基因分布在第
三条染色体上 , 3个基因分布在第四条染色体上 ,而第一条和第二条染色体上分布较少 ,分别只有 2个
和 1个基因.第二条和第四条染色体的短臂上没有此家族的基因.
2.2　MtN3/saliva家族的基因结构
这 17个 MtN3 /saliva家族基因中 , At4G10850含有 5个外显子 , At1G66770只有 1个外显子 ,该家族
其他基因均含有 6个外显子(图 2).
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表 2　拟南芥 MtN3 /saliva家族成员 　
AGI名称 别名 外显子数目 氨基酸数目 MtN3/saliva 结构域位置
At1G21460 6 247 6-95 128-214
At1G66770 1 261 11-100 135-221
At2G39060 6 258 10-97 131-217
At3G14770 6 236 15-104 137-223
At3G16690 6 230 6-93 128-214
At3G28007 6 251 9-98 132-218
At3G48740 6 289 12-99 133-219
At4G10850 5 258 11-100 135-221
At4G15920 6 241 6-93 128-214
At4G25010 6 281 10-98 132-218
At5G13170 SAG29 6 292 12-99 134-220
At5G23660 6 285 12-99 133-219
At5G40260 RPG1 6 239 9-98 134-221
At5G50790 6 289 10-97 131-217
At5G50800 6 294 10-98 132-218
At5G53190 6 263 7-98 132-218
At5G62850 VEX1 6 240 9-98 132-218
图 1　MtN3/saliva家族基因在拟南芥 5条染色体的分布情况
图 2　MtN3 /saliva家族的基因结构图
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　　 上海师范大学学报(自然科学版) 2010年　
　　基因的结构由在线软件 GeneStructureDisplayServer(htp:∥gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php)
获得.
2.3　MtN3/saliva家族蛋白结构域分析
根据 Pfam数据库信息 ,分析出这 17个 MtN3/saliva家族蛋白均具有的 2个拷贝 MtN3 /saliva跨膜
结构域(图 4).这 2个 MtN3 /saliva家族结构域所含氨基酸个数都约在 90个左右 ,位置基本一致 ,具体
如表 2所示.将这 17个 MtN3 /saliva家族成员的氨基酸序列以 FASTA格式输入 TMHMMServerv.2.0
主页(htp:∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)参数设置为默认 ,预测出这 17个基因均编码膜整合
蛋白 ,除 At1G66770含 6个跨膜结构域 ,其余均含 7个跨膜结构域 ,而且这些蛋白的膜外区域一般都非
常短.具体见蛋白结构示意图(图 3).
图 3　拟南芥 MtN3saliva家族基因蛋白结构图
　　每个蛋白由跨膜区 、胞内区和胞外区 3部分组成.位置偏下的横线表示细胞内 ,位置偏上的横线表
示细胞外.
图 4　拟南芥 MtN3saliva家族基因蛋白结构域分析图
两个黑色方框内显示出的是 MtN3/saliva结构域;黑色粗线处表示跨膜区域;灰色粗线处表示两段保
守的胞内区;其中可能被磷酸化 Ser用黑色粗点标出.序列比对使用 ClustalW(htp:∥align.genome.jp/),
并利用 BOXSHADE输出(htp:∥www.ch.embnet.org/software/BOX form.html).
2.4　家族成员序列分析及进化分析
将 17个 MtN3 /saliva家族基因氨基酸序列整合
为 FASTA格式.利用 ClustalW进行同源序列比对.
以序列比对的结果为基础 , 用 Mega软件 (版本
4.1)进行进化树校验生成拟南芥 MtN3/saliva家族
成员的无根进化树(图 5).进化树生成采用 neigh-
bor-joining方法 ,由 1000次自举值重复抽样组成.
序列比对和进化分析表明 , At1G66770 /At4G10850
等 6对蛋白相互间序列相似性较高而在进化树上
处于较近的分支上 ,表明它们之间可能有功能冗余
现象;另外 5个蛋白如 RPG1(At5G40260)和其他该
家族成员相比同源性相对较低 ,因而在进化树上处
于相对独立的分支上 ,有可能各自独立作用于一定
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的生理过程 ,如 RPG1参与花粉壁发育过程中.
图 5　拟南芥 MtN3/saliva家族蛋白的 NJ系统进化树
由序列比对还可以发现 MtN3/saliva结构域
中的膜内区高度保守 , 而跨膜区相对保守
(图 4),并且两段高度保守的膜内区中各有一个
可能的丝氨酸磷酸化位点 ,第一个 MtN3/saliva
结构域中尽管还有 3 个蛋白 (At3G28007、
At3G48740、At5G23660)在此位置不是丝氨酸 ,而
是苏氨酸和赖氨酸 ,但均为可被磷酸化 ,这表明 ,
这些 MtN3/saliva家族蛋白的膜内区很可能是它
们重要的功能区域或者是蛋白质结构或活性调
节区域 ,而其调控方式很可能是可逆的磷酸化 /
去磷酸化 ,受控于某一些蛋白激酶 /磷酸酶.这一
点可以成为拟南芥 MtN3/saliva家族基因功能分
析的一个重要切入点.
图 5为用 Mega软件(版本 4.1)构建的拟南
芥 MtN3 /saliva家族蛋白的 NJ系统进化树 ,概括了拟南芥 MtN3 /saliva家族 17个蛋白间的进化关系.蛋
白按基因号命名.进化树分支旁的数字代表基于 1000次重复的自举值.
2.5　拟南芥 MtN3 /saliva家族基因表达分析
根据 TAIR提供的 e-FPBrowser的链接 ,综合 Genevestigater上的数据 ,对预测的 MtN3/saliva家族的
表达谱进行了分析整理(图 6a、6b),主要采用 e-FPBrowser提供的数据 ,当然 ,这 17个基因的表达谱不
尽相同.有些在根部表达量相对较高 ,如 At3G16690等;At4G15920等在茎部有较高的表达;At5G23660
等在叶中能检测出较强的表达信号;而在花和花药中 At5G40260、At3G28007、 At5G62850、At4G25010及
At5G50800的 mRNA丰度相对很高.总的来说 ,在不同时期的各组织器官中均有 MtN3 /saliva家族基因
的表达 ,表明对于拟南芥发育的不同阶段以及不同组织器官 ,该家族基因的时空表达可能对其内膜系统
的结构和功能起着重要的作用.
对上述 4个(RPG1除外)在花中高表达的基因 ,采用 e-FPBrowser提供的数据 ,对其在花和花药各
个时期中的表达数据进行了分析 ,结果表明 ,这几个基因表达谱相似 ,主要在花和花药发育的晚期表达.
它们的表达起始于花发育的第九期 ,表达高峰主要在花发育的第 12 ～ 15期 ,相对而言 ,在成熟花粉中 , 4
个基因中主要是 At5G62850有很强的表达信号 ,这和以前的研究结果是相一致的 [ 13] (图 6c、6d).而且
在拟南芥 MtN3/saliva家族成员的无根进化树(图 5)中 ,可以看到这 4个基因是 2对在进化上同源性较
高的基因:At3G28007和 At5G62850, At4G25010和 At5G50800,相近的表达谱 ,相似的蛋白序列 ,表明它
们相互之间可能存在一定的功能冗余现象.
各基因的表达数据主要来源于 e-FPBrowser网站提供的数据.A, B:各基因在拟南芥不同组织及
不同发育阶段的表达情况.C, D:花器官相对高表达的 At3G28007、At5G62850、At4G25010和
At5G50800在花和花药发育不同阶段的表达分析.图 6中的叶 6、花 12、花药 12等表示不同组织器官
发育的不同时期.
为了验证这 4个基因的表达情况 ,首先利用定量 RT-PCR技术分析了这 4个基因在拟南芥各组织
中的表达.分析结果表明 ,这 4个基因除了 At5G50800在叶中表达量很高外其他均主要在花组织中高效
表达 ,在根 、茎 、叶片 、幼苗等组织中有微弱表达或不表达(图 7a、b、c、d),这与 e-FPBrowser提供的数据
基本符合.另外 ,定量 RT-PCR结果表明 At5G62850在花中表达的特异性非常高 ,符合此前的研究结果.
这两对基因的表达谱表明它们可能均主要参与花药和花粉的发育过程 ,进一步表明它们很可能存在功
能冗余.这为今后的双突变实验甚至四突变实验提供了依据.
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图 6　MtN3/saliva家族基因在各个组织中的表达分析
　　表达数据用定量 RT-PCR方法获取.各纵座标为基因在野生型 Col-0各组织器官中的相对表达值 ,
以在花序中的表达量为 1.(a):At3G28007的表达谱;(b):At5G62850的表达分析;(c):At4G25010的定
量 PCR结果;(d):At5G50800的表达分析.图 6a、b、c、d中:R:根;S:茎;L:叶;F:花;SD:幼苗.
3　结　论
对拟南芥中 MtN3/saliva家族的 17个基因做了较全面的研究 ,包括对蛋白全序列的比对及系统进
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图 7　基因 At3G28007;At5G62850;At4G25010和
At5G50800在各组织器官中的表达分析
化树的构建 ,蛋白结构域和基因结构及表达情况
的分析等.MtN3 /saliva家族蛋白均具有的 2个拷
贝 MtN3 /saliva跨膜结构域.这 17个基因均编码
膜整合蛋白 ,每个蛋白由跨膜区 、胞内区和胞外
区 3部分组成 ,除 At1G66770含 6个跨膜结构域 ,
其余均含 7个跨膜结构域 ,并且这些蛋白的膜外
区域一般都非常短.但其膜内区高度保守 ,而跨
膜区相对保守 ,并且两段高度保守的膜内区中各
有一个可能的氨基酸磷酸化位点.根据拟南芥
MtN3 /saliva家族蛋白进化树的结果 ,选出进化关
系较近的 2对基因 ,进行了实时定量 RT-PCR实
验 ,实验结果表明这 4个基因除了 At5G50800在
叶中表达量很高外其他均主要在花组织中高效表达 ,在根 、茎 、叶片 、幼苗等组织中有微弱表达或不表
达 ,验证了这 4个基因的表达谱.这些工作为深入研究 MtN3 /saliva家族蛋白在拟南芥乃至植物中的功
能研究提供了参考.
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HEJia, HUANGXue-yong, GUANYue-feng, SUNMing-xi, ZHUJun, YANGZhong-nan＊
(ColegeofLifeandEnvironmentSciences, ShanghaiNormalUniversity, Shanghai200234, China)
Abstract:MtN3/salivaproteinfamilygenesarefounduniversalyineukaryotes, andthemajorityoftheseproteinsusuallycontain
twocopiesofMtN3/salivadomain.VeryfewoftheMtN3/salivaproteinshavebeencharacterized.AndthetwocopiesofMtN3/sa-
livadomain sfunctionareunclear.Inthisstudy, eighteengenesoftheMtN3/salivafamilywereidentifiedinArabidopsisthali-
ana, whilemostofthemwerefunctionalyunknown, exceptRPG1 clonedrecently.TheMtN3/salivafamilyinArabidopsiswasex-
tensivelyanalyzed, includinggenestructure, genelocalizationingenome, proteinmotiforganization, phylogeneticrelationshipof
familymembersandgeneexpressionpatern.Accordingtotheexpressiondatafromthee-FPBrowserandGenevestigaterwebsite,
fourMtN3/salivafamilygeneswerehighlyexpressedinantherand/ormaturepollengrains, andtheirexpressionhavebeenfurther
verifiedbyReal-timeRT-PCRinourresearch.TheseresultsfacilitateustofurtherunderstandthefunctionofMtN3/salivafamily
inplant.
Keywords:MtN3/salivagenefamily;Arabidopsisthaliana;expressionpattern
(责任编辑:郁　慧)
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