全 文 ：520 植物生理与分子生物学学报, Journal of Plant Physiology and Molecular Biology 2005, 31 (5): 520-526
2004-11-11收到，2005-08-03接受。
*通讯作者(E-mail:docpwu@zju.edu.cn; Tel: 0571-86971130)。
拟南芥中一个类似钙调素蛋白的基因结构及其缺磷、缺钾诱导表达
段瑞君 1,2，易可可 1，吴平 1*
(1浙江大学生命科学学院植物生理学与生物化学国家重点实验室，杭州 310029；2青海大学生物系，西宁 810016)
摘要：通过拟南芥芯片杂交分析发现推测的钙调素基
因(GenBank accession No.At1g76650)与低磷胁迫有关。
对该基因的结构研究确认了该基因编码一个含有三个
EF-hand结构域的类似钙调素的蛋白，Northern检测表
明该基因在缺钾、缺磷条件下诱导表达，但在缺氮、高
盐等胁迫条件下不受影响。经 RT-PCR和启动子融合
GUS转基因植株的组织化学染色分析，表明该基因在
拟南芥中为全株表达，但各器官中表达丰度不尽相同。
关键词：拟南芥；类似钙调素蛋白的基因；磷或钾缺乏
中图分类号：Q7 4
植物适应环境必须有一系列的信号传导机制
来 感 受 生 物 和 非 生 物 胁 迫 (Reddy等 2001)。许多胞
外刺激如光、温度、盐、触摸、重力、辐射、
激素等都会引起植物细胞胞内游离钙离子浓度
([Ca2+]cyt)的变化(Braam和Davis 1990; Trewavas 和
Mahlo 1997, 1998; Sanders等 1999, 2002)，这种
变化能被多种钙离子感受器所感受，并且通过传
导而刺激传导途径下游的元件，引发植物的应激
反应。
钙调素(calmodulin, CaM)是植物中主要的钙离
子感受器，它是一个广泛存在、高度保守的钙离
子结合蛋白。钙调素原型是由 148个氨基酸组成
的小分子酸性蛋白(17 kD)，具有专一性结合钙离
子的 EF-hand 结构域(Reddy等 2001)。钙调素本
身并不具有催化活性，但可以作为一个信号传导
元件通过调控处于其下游的靶蛋白(如NAD激酶、
一氧化氮合成酶、谷氨酸脱羧酶等)从而影响植物
的生长发育 (Trewavas和Mahlo 1997, 1998; Snedden
和 Fromm 1998; Zielinski 1998; Yang和 Poovaiah
2003)。
我们在拟南芥芯片杂交分析中发现了一个推
测的钙调素基因(GenBank accession No. At1g76650)
与低磷胁迫有关(Wu等 2003)，命名为 AtPsiCaM
(Arabidopsis Pi-starvation induced CaM)。本文对
该基因的结构进行了研究，探讨了各种胁迫条件
对该基因表达的影响，并且通过构建该基因的启
动子融合GUS的转基因植株，探明了该基因在拟
南芥中的表达情况。
1　材料与方法
1.1　植物材料及处理
哥伦比亚型拟南芥(Arabidopsis thaliana)正常
培养基采用 1/2MS培养基。将拟南芥种子消毒，
移入培养基，冷处理 2 d后放进生长箱培养(温度
22~24℃，湿度 70%，光照长度 14~16 h/d)。拟
南芥培养基培养 7 d后转入各种处理培养基。缺
氮处理时用CaCl2和K2SO4替代Ca(NO3)2和KNO3；
缺磷处理时 K C l 2 替代 K H 2 P O 4；缺钾处理时
NaH2PO4和NaNO3替代KH2PO4和KNO3；高盐处
理是在 1/2MS培养基中加入 200 mmol/L的NaCl。
处理和对照株系全株收集，立即在液氮中或于
- 70℃下冷冻保存，以备提取 RNA。
1.2　DNA的序列对比分析以及聚类树分析
基因组和 cDNA 序列的对比分析在 NCBI
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)上进行。基
因结构预测分析在 http://genes.mit.edu/GENSCAN.
h t m l 上进行。氨基酸序列的同源性比较采用
clustalx软件进行，聚类树分析在 http://www.ebi.
ac.uk/clustalw/上进行。
1.3　基因克隆
在 NCBI上通过 GenBank access ion No.
At1g76650查询得到 AtPsiCaM基因序列，设计
PCR引物 CAME-Up、CAME-Low，以拟南芥基
因组DNA为模板，扩增得到 800 bp大小的片段，
然后克隆到 pUC-T载体上后测序，并将此片段作
为探针用于 Southern、Northern杂交和 RT-PCR。
引物序列为，CAME -Up：5 -AACATAAAA-
521段瑞君等: 拟南芥中一个类似钙调素蛋白的基因结构及其缺磷、缺钾诱导表达5期
GCCCTTTCCCCTATTTC-3；CAME-Low：5-
TGACTATGAGCAAATCATGGTCAAAC-3。
1.4　Northern杂交
取各种胁迫处理的拟南芥材料的RNA样品10
µg经含甲醛的琼脂糖凝胶电泳后转膜，用 32P放
射性同位素标记的基因全长序列进行Northern杂
交。
1.5　RT-PCR
从拟南芥各种组织(根、茎、茎叶、座叶、
花)中提取 RNA，采用 20 µL体系，按 Invitrogen
公司操作手册进行反转录。以拟南芥 actin基因
(Genbank accession No. At5g09810)作为对照，逆
转录得到的拟南芥 cDNA为模板，用引物CAME-
Up和 CAME-Low进行 PCR。扩增条件为：94℃
4 min；94℃ 30 s, 57℃ 45 s, 72℃ 1.5 min，39个
循环；72℃ 10 min。对扩增得到的 PCR产物进
行电泳检测。
1.6　启动子融合GUS转基因植株的构建
以拟南芥基因组DNA为模板，以Calmodulin-
U和 Calmodulin-L为引物进行 PCR扩增得到 3 kb
片段，用它为模板，用引物 Ca lmodul in-U 和
CaMP-Low进行 PCR扩增得到 2 kb启动子片段，
T 4 聚合酶平滑化，然后将启动子片段与
pCAMBIA1391Z SmaI酶切的载体相连接得到
Promotor::GUS载体，酶切检测并测序。检测正
确的质粒，经2 500 V电击转入农杆菌菌株EHA105，
加入16%的甘油后于– 70℃下保存，备用。引物序
列为，Calmodulin-U: 5-ATCAGAAGCCGAT-
CTTGA-3；Calmodulin-L: 5-TTAGAAATCC-
T A C A A C C G A A A G - 3 ；C a M P - L o w : 5 -
GTTTTATATATAGGCGTGTGGTC-3。
1.7　拟南芥转化和GUS组织化学染色分析
采用拟南芥浸润法进行转化。转化后的植株
通过抗性筛选，得到纯合体。将<2 cm的叶片、
根或花放入装有GUS染色液的 1.5 mL离心管中，
放入 37℃恒温箱中反应 0.5~8 h。样品用 FAA固
定 24 h，取出在 LEICA MZ95体视镜下观察，以
LEICA DC300为摄像头拍照。
2　结果
2.1 　AtPsiCaM基因的结构
在 N C B I 上对 G enB a nk a cces s i on N o.
At1g76650查询得到 AtPsiCaM基因的序列，用
DNAstar软件分析与克隆得到的 AtPsiCaM基因序
列进行对比，结果表明测序结果与GenBank上序
列一致。AtPsiCaM基因的核苷酸序列和推导的氨
基酸序列如图 1所示，基因全长为 768 bp，编码
区由 531 bp核苷酸组成，编码一个 177个氨基酸
组成的蛋白。在 http://genes.mit.edu/GENSCAN.
图 1　AtPsiCaM (At1g76650)基因序列及其推测的氨基酸序列
Fig.1　The sequence of AtPsiCaM (At1g76650) and the deduced amino acids
522 31卷 植物生理与分子生物学学报
h t m l 上进行基因结构预测分析，结果表明
AtPsiCaM基因是一个不含内含子的、中间区域为
编码区的基因。
采用 AtPsiCaM基因的氨基酸序列在NCBI上
用blastn (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)进行
对比，选取 6个同源性较高的序列：AtPsiCaM同
源蛋白(At1g76640) (79%)、拟南芥触摸诱导钙调
素相关蛋白(Arabidopsis touch-induced calmodulin-
related protein, TCH2) (35%)、钙调素 4 (calmodulin
4) (Mus musculus) (36%)、拟南芥钙调素类蛋白
(calmodulin-like protein, MSS3) (Arabidopsis thaliana)
(34 %)、钙调素同源蛋白MD H9. 7 ( unnamed
protein product contains similarity to calmodulin
MDH9.7) (48%)和烟草基因沉默调控子(regulator of
gene silencing) (Nicotiana tabacum) (54%)。同时
采用DNAstar中的MegAlign软件对比相关拟南芥
典型 CaM序列，发现 AtPsiCaM基因的氨基酸序
列与拟南芥典型钙调素基因AtCaM2的氨基酸序列
同源性在 36.2%左右。然后对AtPsiCaM基因及上
述基因采用 clustalx序列对比软件进行结构分析，
发现该基因含有同源性很高的 3个与CaM2、TCH
等基因相似的 EF-hand结构域。3个 EF-hand结构
域位置分别为：52~64、88~100和 160~172 (图
2)。AtPsiCaM基因与典型的钙调素序列全长虽然
同源性较低，但保守的 EF-hand结构域部分的高
同源性的表明 AtPsiCaM基因是一个含有 3个 EF-
hand结构域的 EF-hand结构域家族成员。
通常EF-hand结构域的钙离子受体在植物中主
要分为三类：钙调素(CaM)、钙调磷酸酶 B类蛋
白(CBL)、依赖于钙离子的蛋白质激酶(CDPK)，
并且和 CBL相比，CaM与 CDPK的联系更密切。
在拟南芥中，三类钙离子受体的每一个都被多基
因家族注释：11 CaM、9 CBL、34 CDPK (Yang
和 Poovaiah 2003)。用 Clustalw软件(http://www.
图 2　AtPsiCaM (At1g76650)、AtPsiCaM同源蛋白(At1g76640)、拟南芥钙调素 2、拟南芥触摸诱导钙调素相关蛋白
(TCH2)、钙调素 4、拟南芥钙调素类蛋白(MSS3)、钙调素同源蛋白MDH9.7和烟草基因沉默调控子的氨基酸序列的同源
性比较
Fig.2　Alignment of the amino acid sequences of AtPsiCaM (At1g76650), At1g76640, Arabidopsis CaM2, Arabidopsis touch-
induced calmodulin-related protein (TCH2), calmodulin 4 (Mus musculus), calmodulin-like protein (MSS3) (Arabidopsis thaliana),
unnamed protein product containing similarity to calmodulin MDH9.7 and regulator of gene silencing (Nicotiana tabacum)
Identical amino acids are dashed. Asterisks indicate the Ca2+ binding domains of calmodulin.
523段瑞君等: 拟南芥中一个类似钙调素蛋白的基因结构及其缺磷、缺钾诱导表达5期
ebi.ac.uk/clustalw/)分析 AtPsiCaM基因的进化聚类
树，由图 3可知 AtPsiCaM (图中为At1g76650)基
因分类在分子进化上属于钙调素类，而与 CDPK
和 CBL在亲缘关系较远。
2.2　AtPsiCaM基因的缺磷、缺钾诱导表达
为了研究AtPsiCaM基因在各种胁迫下的表达
情况，我们对拟南芥(Col)分别进行缺氮、缺磷、
缺钾、高盐胁迫处理。N o r t h e r n 结果表明：
AtPsiCaM在缺钾处理时被强烈诱导，在缺磷处理
时诱导稍弱，而在其它处理(缺氮、高盐)下基本
不诱导，与正常情况下相同(图 4)。这个结果清
楚地表明AtPsiCaM基因被缺磷、缺钾条件诱导表
达。
2.3　AtPsiCaM基因的表达模式
用RT-PCR检测AtPsiCaM基因在植株中的表
达情况，从图 5中可以得出该基因在花、茎、茎
叶中表达强度强，在座叶中表达强度较强，而在
根中表达最弱。
将所构 Promotor::GUS载体进行拟南芥的转
图 3　EF-hand结构域家族的聚类树
Fig.3　The phylogenetic tree of the calcium-binding EF-hand family
图 4　AtPsiCaM基因的Northern杂交
Fig.4　Expression of AtPsiCaM gene induced by a variety of
stimuli in Northern blots
Northern blots of RNA purified from untreated plants harvested
3 d after the indicated treatments. CK: Control; –N: Nitrogen
deficiency; – P: Phosphorus deficiency; –K: Potassium
deficiency; HS: High salinity.
524 31卷 植物生理与分子生物学学报
图 6　AtPsiCaM基因启动子融合GUS转基因植株的组织化学染色
Fig.6　Histochemical staining assays of the AtPsiCaM promoter::GUS transgenic plants
Blue color indicates the presence of GUS activity. GUS expression was observed in the vegetative parts, stem, leaves and roots (A).
In roots, GUS expression was mostly observed in tip parts (B), the cells are vascular ones (C). A small developing rosette leaf with
deep staining in the bottom part of trichomes (D) and cotyledon with high staining in vascular tissue (E); Flower with GUS staining
in anther and the stigma (6-week-old plant) (F,G).
束，根毛部位也表达，根尖顶部染色较深，后
部较弱。在花方面，主要染色位置是雄蕊的花药
和雌蕊的柱头(图 6)。
3　讨论
文献中报告了在拟南芥中发现了 14 种钙调
素，分别属于典型的钙调素、钙调素类似蛋白、
钙调素相关蛋白(Luan等 2002)。本工作中研究的
AtPsiCaM基因与典型的钙调素如 CaM2基因相比
较，编码的氨基酸序列同源性较低，而在 3个EF-
hand结构域(第 1、2和 4个)处具有高度的同源性，
表明 AtPsiCaM基因具有钙调素的特点，第 3个结
构域的变化很可能是该基因功能特殊性的原因(图
2)。另外从分子进化上，AtPsiCaM基因属于钙调
素家族基因(图 3)。因此我们可以确认 AtPsiCaM
基因是一个含有三个EF-hand结构域的钙调素类似
蛋白基因。
在基因结构分析中，我们发现AtPsiCaM基因
类似 TCH2基因，都含有 3个 EF-hand结构域(图
2)，而 TCH2基因为触摸诱导基因，属于钙调素
类基因，可被高渗透等胁迫条件所诱导(Braam等
1997)，因此推测AtPsiCaM基因也可能与TCH2基
因类似，在一些胁迫条件引起的信号传导中起作
用。
目前有关钙离子在磷饥饿诱导的信号传导过
程中的作用仍然缺乏直接证据，但已有在磷饥饿
胁迫下的西红柿根中Ca2+-ATPase的转录有增加的
报告(Muchhal 等 1995)。我们的实验结果表明
AtPsiCaM基因是一个与缺磷、缺钾胁迫相关的基
因(图 4)。另一方面，钙离子支持钾离子的转运
图 5　由RT-PCR 检测的 AtPsiCaM基因的表达模式
Fig.5　Expression pattern of the AtPsiCaM gene by RT-PCR
化，获得 Promotor::GUS转基因植株，取不同组
织进行GUS染色。染色结果表明 AtPsiCaM基因
在植株各组织都表达，但其表达强度各不相同。
在叶组织方面，子叶主要染色位置在维管束，幼
叶主要染色位置为毛刺基部，老叶染色很弱，很
难观察到。在根方面，主要染色位置也在维管
525段瑞君等: 拟南芥中一个类似钙调素蛋白的基因结构及其缺磷、缺钾诱导表达5期
并且影响植株对 K+-Na +的选择性。例如拟南芥
SOS3基因编码带有3个EF-hand结构域的钙结合蛋
白，属于钙调磷酸酶 B类蛋白(CBL)，SOS3的钙
结合特性在决定植物在盐胁迫下钙信号的特殊性方
面可能起重要作用(Liu和 Zhu1998)，表明钙离子
与钾离子在植物胁迫反应中是密切相关的。因此
AtPsiCaM这个钙调素类似蛋白基因参与缺磷、缺
钾胁迫信号传导也是很正常的。根据以上结论，
可以推测在缺磷、缺钾胁迫信号刺激后，可能会
引发细胞内游离钙离子浓度变化，而细胞内游离
钙离子浓度变化被AtPsiCaM基因这种特殊的钙调
素类似蛋白感受，从而激活钙调素下游靶蛋白，
进而诱发植株的应激相关反应。
很多报告表明钙调素在不同阶段和不同组
织、细胞类型中差异表达，表达部位多种多样。
通过 Promotor::GUS转基因拟南芥植株的建立和
RT-PCR检测研究该基因的表达情况，结果表明
AtPsiCaM基因是全株表达，表达丰度因部位而异
(图 5、6)，可以推测该基因是作用于特定部位，
而不是组成型表达的。
综上所述，AtPsiCaM基因属于钙调素类似蛋
白基因，受缺磷、缺钾诱导表达，但是 AtPsiCaM
基因在缺钾、缺磷胁迫中的生理功能仍然只是处
于推测阶段，进一步通过拟南芥转基因植株研究
其具体的生理功能，阐述该基因在缺磷、缺钾条
件下的信号传导途径中的作用将可能对植物营养胁
迫中信号传导途径的了解起到推进作用。
参 考 文 献
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526 31卷 植物生理与分子生物学学报
The Structure and Phosphorus or Potassium Deficiency Induced Ex-
pression of a Calmodulin-like Protein Gene in Arabidopsis
DUAN Rui-Jun1,2 , YI Ke-Ke1, WU Ping1*
(1The State Key Laboratory of Plant Physiology and Biochemistry, College of Life Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310029, China;
2Department of Biology, Qinghai University, Qinghai 810016, China)
Abstract: According to our previous microarray
analysis, we found a putative calmodulin gene
related to Pi deficiency and designated AtPsiCaM
(Arabidopsis Pi-starvation-induced CaM). Re-
sults of st ructural analysis indicate that
AtPsiCaM has three conserved EF-hands motif
and belongs to calmodulin-like proteins family
(Figs.1–3). Northern blot analysis revealed that
this gene could be induced by potassium and
phosphate deficiency and not by potassium de-
ficiency or high salinity (Fig.4). The results of
RT-PCR and GUS histochemical staining assays
of the AtPsiCaM promoter::GUS transgenic
plants showed that this gene can be expressed in
all tissues to different expression levels (Figs.5,
6).
Key word: Arabidopsis thaliana; calmodulin-like gene;
phosphorus or potassium deficiency
*Corresponding author (E-mail: docpwu@zju.edu.cn).