全 文 ：拟南芥根皮层细胞质膜内向K+通道
电生理特性分析＊
于川江　武维华＊＊
(中国农业大学生物学院 ,北京 100094)
摘要　　利用膜片钳技术对模式植物拟南芥根皮层细胞原生质体的内向跨膜钾电流
进行了全细胞记录 ,并对内向 K+通道的特性进行了分析.结果表明 ,拟南芥根细胞
质膜上的内向 K+通道由超极化膜电位所激活;该通道具有较高的 K+/Na+选择性 ,
可被 TEA+和 Ba2+等K+通道阻断剂所抑制 ,而且对胞内自由 Ca2+浓度变化不敏感.
这为进一步利用模式植物拟南芥进行植物K+吸收机制以及植物抗盐机制的研究奠
定了基础.
关键词　　拟南芥　根细胞　K+通道　钾钠选择性
钾是高等植物生长发育所必需及唯一的 1价阳离子.植物吸收 K+的主要机制之一是通
过其根细胞质膜上的内向 K+通道进行的.80年代中期以前 ,对植物K+吸收机制的研究多在
整体 、组织或器官水平上进行.虽然后来有人利用膜片钳技术对一些植物根细胞质膜上的内
向K+通道特性进行了一些研究[ 1～ 4] ,但由于多数供试植物的遗传背景较为复杂 ,使这些研究
的深入开展难度较大.而利用遗传背景较简单的模式植物(如拟南芥)开展相关研究 ,则非常
有利于研究工作的进一步深入.1992年 ,Anderson 等人[ 5]和 Sentenac 等人[ 6]分别克隆了拟南
芥的 K+通道基因(KAT1和 AKT1),并分别将 KAT1和AKT1在酵母的 K+吸收缺失突变株中表
达 ,结果使该酵母突变株恢复了对K+的吸收能力.Ichida等人[ 7]成功地将对铯不敏感的 K+
通道突变基因转入拟南芥 ,使后者的气孔保卫细胞获得了对铯不敏感的 K+吸收性状.由于
模式植物拟南芥具有个体小 、生育周期短 、种子数量多 、基因组小并且重复序列少等优点 ,利用
模式植物拟南芥进行植物 K+吸收机制及 K+营养性状改良等方面的工作 ,无疑是利用基因工
程技术改良植物(作物)K+营养性状和抗盐性状的较好途径.然而 ,这些研究工作的进一步开
展有赖于对根细胞质膜上 K+通道的特性以及 K+通道调控机制的研究.虽然有人曾报道对
拟南芥根细胞内向K+通道的电生理特性进行过初步分析[ 8] ,但在完整根细胞水平对拟南芥
根细胞内向K+通道的特性及调控机制的系统研究工作亟待开展.
本工作利用膜片钳技术 ,对拟南芥根皮层细胞质膜上的内向K+通道进行了全细胞记录 ,
　　　1998-05-05收稿 , 1998-09-29收修改稿
　　＊国家杰出青年科学基金资助项目(批准号:39525003)和国家自然科学基金资助项目(批准号:39470359)
　 ＊＊联系人
中　国　科　学　　　(C 辑)　　　　　　 　
第 29 卷　第 3期 SCIENCE IN CHINA(Series C)　 1999 年 6月
对通道的K+吸收特性 、K+/Na+选择性 、胞质 Ca2+等因子对通道的调控作用等进行了研究 ,旨
在为利用模式植物深入开展植物 K+吸收分子机理以及作物 K+营养性状改良的研究工作奠
定基础.此外 ,对根细胞 K+通道的 K+/Na+选择性与植物抗盐性间的关系也进行了讨论.
1　材料与方法
1.1　材料培养及原生质体分离
拟南芥(Arabidopsis thaliana (L.)Heynh.cv.Landsberg)种子经 0.5 %(体积比 ,有效氯含
量)次氯酸钠加 0.01%(体积比),Triton X-100表面消毒 5 min ,用无菌水冲洗后 ,播种于 MS固
体培养基上 ,在 4℃下春化 3 d ,在 22℃连续光照(光强 30 μmol·m-2·s-1)条件下培养 3周.
取拟南芥幼根 ,切成 2 mm左右根段 ,置于 100 μm 孔径的尼龙网袋内 ,将网袋放入离心管
内 ,加入 1 mL含 1.5%纤维素酶(CEL , Worthington Biochemical Corporation , USA)、0.1%果胶酶
(Y-23 , Kikkoman Corporation , Japan)、0.1%BSA(Boehringer Mannheim , Germany)的原生质体分
离酶液(溶于基本溶液内 ,见表 1),在(25±2)℃条件下静置 20 min后 ,在 300×g 条件下离心 5
min ,去掉尼龙网和酶液 ,用基本溶液悬浮管内沉淀物 ,再将沉淀物在 250×g 条件下离心 5
min ,去掉上清液 ,用基本溶液再次将沉淀物悬浮 ,最后在 250×g 条件下离心 5 min ,去掉上清
液 ,用 200μL基本溶液将沉淀的根细胞原生质体悬浮 ,4℃下保存备用.
1.2　膜片钳记录过程
样品池内加入 1 mL 胞外溶液(见表 1),吸取 10 μL 拟南芥根细胞原生质体悬浮液加入样
品池后静置 10 min ,使原生质体稳固地沉于样品池底部.选择直径大于 15μm 、细胞质清晰的
原生质体(根皮层细胞)用于记录.
本实验使用的电流放大器为Axopatch 200B ,前置放大器为 CV203BU ,信号接口为 Digidata
1200 Series ,软件为 pCLAMP 6.0.3(均为美国 Axon Instrument产品).电极使用有芯毛细管 ,采
用两步法拉制 ,热抛光后灌注电极溶液(胞内溶液 ,见表 1).选择电阻为 20MΨ的电极用于全
细胞记录.全细胞的高阻封接(约为1 ～ 3 GΨ)一般在 1 min内形成 ,利用电流放大器的电阻和
电容补偿系统进行串联电阻补偿和电极与细胞的电容补偿.阶跃指令电位从-180 mV开始 ,
以每阶20 mV递升 ,记录时间为 4 s ,间隔为 12 s.
1.3　溶液
本实验对照处理的各种溶液成分见表 1.
表 1　对照溶液成分
Glu-K a) KCl CaCl2 MgCl2 Hepes/
mmol·L-1 Mes ATP-Mg EGTA pH
渗透浓度/
mOsmol·kg-1
基本溶液 10 1 2 5 6.0 300
胞外溶液 10 1 4 5 6.0 345
胞内溶液 98 2 2 10 2 2 7.2 385
　　a)谷氨酸钾
含不同浓度 K+的胞外溶液是通过改变对照胞外溶液的 Glu-K 浓度而配制;含 TEA+或
Ba2+的胞外溶液是分别在对照的胞外溶液中加入 10 mmol/L TEA-Cl或 1 mmol/L BaCl2.含不
同浓度自由Ca2+的溶液是在胞内溶液中分别加入不同浓度的 CaCl2 ,加入量用 Ca2+浓度计算
第 3 期 于川江等:拟南芥根皮层细胞质膜内向K+通道电生理特性分析 317　
软件(MAXChelator V5.60)计算 ,使自由Ca2+的浓度分别为 1.5 ,10和 500μmol/L.以上各种溶
液的渗透浓度用山梨糖醇调节 ,pH 用KOH调节.各种溶液使用前经微孔直径为 0.2μm 的滤
膜过滤.
2　结果
2.1　全细胞内向通道电流的记录及通道性质鉴定
拟南芥根细胞原生质体在胞外溶液含 10 mmol/L K+ 、电极溶液含 100 mmol/L K+时 ,保持
电位设在-58 mV ,当膜电位超过-100 mV 时 ,可记录到明显的内向电流;膜电位越负则内向
图 1　拟南芥根皮层细胞内向K+电流全细胞记录
(a)全细胞记录 、阶跃指令电位模式图及电流与时间标尺;(b)全细胞跨膜电流密度与跨
膜电压关系曲线;(c)尾电流记录及阶跃指令电位模式图 ,其中箭头所指为跨膜K +电流
的逆转电位
电流越大(图 1(a)、(b)).其电流密度/电压关系如图 1(b).通过尾电流记录分析跨膜电流变
化(图 1(c)),内向电流的逆转电位(Erev)为-37 mV ,据能斯特方程对细胞内外主要离子平衡
电位的计算(表 2)表明 ,拟南芥根细胞质膜的逆转电位接近 K+的平衡电位(-58 mV),证明拟
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南芥根细胞原生质体的全细胞内向电流主要是K+电流.
　　　表 2　原生质体内外主要离子平衡电位
K+ Mg2+ Ca2+
胞内溶液/mmol·L-1 106.0 4.5 0.000 1
胞外溶液/mmol·L-1 10.2 4.0 1.0
平衡电位/mV -58.0 -1.5 0
　　在胞外溶液中加入 10 mmol/L TEA+ ,当
膜电位为 -180 mV 时 , 内向电流被抑制
72.2%(图 2(a)、(b)、(d)),而在胞外溶液中加
入1 mmol/L Ba2+则完全抑制内向K+电流(图
2(c)、(d)).由于 TEA+和 Ba2+均是 K+离子通道的抑制剂 ,所以实验结果进一步证明了所记
录的拟南芥根皮层细胞质膜上的内向离子通道主要是内向 K+通道.
图 2　TEA+和 Ba2+对拟南芥根皮层细胞内向K+电流的影响
(a)对照;(b)胞外加入 10 mmol/ L TEA +对全细胞内向 K +电流的影响;(c)胞外加入 1
mmol/ L Ba2+对全细胞内向K +电流的影响 ,跨膜电流与时间的比例尺(见图 1(a);(d)各种
处理条件下全细胞记录的跨膜电流密度与跨膜电压关系曲线
在相同的膜电位条件下 ,全细胞内向电流密度随胞外K+浓度的降低而逐渐减小(图 3),
而其逆转电位随胞外溶液 K+浓度的降低向负值更大的方向移动(图 3(g)),说明拟南芥根皮
层细胞质膜上的内向 K+通道活性具有依赖于胞外 K+浓度的特性 ,其电流密度/电压关系如
图3(g)所示.根据Woolf-Augustinsson-Hofstee 作图法 ,以电流密度值为纵坐标 、以电流密度与
相应的K+浓度的比值为横坐标作图(图 3(g)),胞外 K+浓度在 1 ～ 10 mmol/L范围内 ,拟南芥
根细胞内向 K+通道的 K+吸收的平衡解离常数(Km)为 12.6 mmol/L ,表明拟南芥根皮层细胞
质膜上的内向 K+通道主要是介导植物低亲和性K+吸收.
2.2　内向 K+通道的 K+/Na+选择性
在对照的胞外溶液内加入 10 mmol/L 的谷氨酸钠(Glu-Na)时 ,其内向跨膜电流密度与对照
的跨膜电流密度(图 4(a)、(e))相比约减少 62.0%(图 4(b)、(e)).以 Glu-Na替换对照胞外溶
液中的Glu-K时(同时含 0.1 mmol/L Glu-K),由于胞外 Na+的浓度远高于胞内Na+浓度 ,根据
能斯特方程推算 ,Na+的平衡电位远大于零.在膜电位小于零时 ,Na+的电化学势是质膜外侧
高于质膜内侧 ,但在全细胞电流记录中 ,当膜电位达到-180 mV时也未记录到明显的内向电
流(图 4(d)、(e)),内向电流密度只有(0.04±0.02)pA/pF ,这与胞外溶液只含有 0.1 mmol/L
第 3 期 于川江等:拟南芥根皮层细胞质膜内向K+通道电生理特性分析 319　
K
+的全细胞记录结果相似((0.06±0.02)pA/pF)(图 4(c)、(e)).实验结果说明拟南芥根细
胞质膜上的内向离子通道具有极强的K+/Na+选择性.
图 3　胞外不同浓度K+对全细胞内向 K+电流的影响
(a)、(b)、(c)、(d)、(e)和(f)分别为胞外溶液含 10 , 5 , 2 , 1, 0.5和 0.1 mmol/ L K+时的全细
胞记录 、跨膜电流与时间的比例尺(见图 1(a));(g)各种K +浓度条件下全细胞记录的跨
膜电流密度与跨膜电压关系曲线及K +浓度在 1～ 10 mmol/ L范围内的 Woolf-Augustin-son-
Hofstee(WAH)图
2.3　胞内 Ca2+对内向 K+通道的影响
当胞内自由 Ca2+浓度约为 0.1μmol/L(对照)时 ,在膜电位为-180 mV条件下细胞的内向
跨膜 K+电流密度为(71.1±8.9)pA/pF(图 5(a)、(e)).在保持胞外 Ca2+浓度(1 mmol/L)不变
的条件下 ,当胞内自由Ca2+浓度分别为 1.5和 10 μmol/L时 ,在膜电位为-180 mV 的条件下 ,
拟南芥根细胞质膜上内向 K+电流密度分别为(68.0±6.8)pA/pF 和(65.6±8.9)pA/pF(图 5
(b)、(c)、(e)).经 t测验 ,2种较高浓度 Ca2+处理的内向电流密度与对照的内向电流密度差
异均不显著.在电极溶液加入2.5 mmol/L CaCl2和 2mmol/L EGTA ,使胞内自由 Ca2+浓度约为
500 μmol/L 时 ,内向电流密度仍有(57.5±5.8)pA/pF(图 5(d)、(e)),与对照的内向跨膜电流
密度相比 ,差异也不显著(t测验).
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图 4　Na+对拟南芥根细胞内向 K+电流的影响
(a)、(b)、(c)和(d)分别为胞外溶液含 10 mmol/ L K+ ,10 mmol/ L K +和 10 mmol/ L Na +, 100
μmol/ L K+ ,100μmol/L K+和 10 mmol/ L Na+等处理的拟南芥根皮层细胞内向 K+电流全
细胞记录;(e)为以上各种处理的跨膜电流密度与跨膜电压关系曲线图.跨膜电流与时
间的比例尺见图 1(a)
3　讨论
3.1　拟南芥根细胞质膜内向 K+通道的 K+/Na+选择性
不同种类植物其细胞膜上的K+通道的 K+/Na+选择性之间存在差别.如小麦根毛细胞
原生质体质膜上 K+通道对Na+和K+的电导比为 0.013[ 4] ;但玉米根皮层细胞膜上的一种 K+
通道对Na+和 K+的电导比却为 0.023[ 3] .同种植物的不同生态型间也存在着离子通道的
K+/Na+选择性差别 ,如拟南芥 Columbia生态型的根细胞质膜上存在的内向 K+通道 ,其 K+/
Na+选择性不高 ,在单通道记录方式下 Na+透过率相对于 K+透过率的比值为 0.17[ 8] ,而本工
作以拟南芥 Landsberg生态型为试材 ,其根细胞质膜上 K+通道具有极高的K+/Na+选择性 ,在
-120 ～ -180 mV的范围内 ,其Na+和 K+的电导比约为 0.000 9.较高的 K+/Na+选择性可能
有利于植物在同时含有K+和 Na+的环境中有效地吸收 K+.
3.2　离子通道的 K+/Na+选择性与抗盐性
抗盐植物适应高盐环境的机理有多种 ,如通过根对离子的选择性吸收 、在地上部排出盐
分 、在植物特定的组织中隔离盐分等.在细胞水平 ,离子跨质膜和/或液泡膜运输的机制及其
调控与植物的抗盐性状密切相关.植物细胞在高盐环境中保持其胞内Na+浓度较低的机制可
能有二 ,一是在确保其他离子吸收的条件下 ,选择性地排斥 Na+ ,不让其透过质膜;另一是从细
胞内向胞外或液泡内耗能性的转运 Na+.由于植株在 Na+吸收 、运转和最终的毒害过程中 ,最
初开始于根细胞的质膜 ,而且在液泡中隔离盐分只能短时间解决盐分过高的问题 ,因此对于单
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图 5　胞内自由 Ca2+浓度对内向 K+电流的影响
(a)、(b)、(c)和(d)分别为胞内含自由Ca2+浓度为 0.1(对照), 1.5 , 10和约 500μmol/ L 时
的拟南芥根皮层细胞内向 K+电流记录;(e)为不同浓度自由 Ca2+处理条件下的全细胞跨
膜电流密度与跨膜电压关系曲线.跨膜电流与时间的比例尺见图 1(a)
个细胞来说 ,拒 Na+于质膜之外无疑是植物抗盐的最重要的机制之一.由于在盐胁迫环境下 ,
胞外Na+浓度一般远高于胞内的 Na+浓度 ,Na+可以沿其电化学势梯度被动进入胞内.应用
膜片钳技术以全细胞或单通道方式研究植物细胞离子通道的特性发现 ,至少在小麦 、黑麦 、大
麦 、玉米和豌豆等植物的不同类型根细胞上的确存在可以部分透过Na+的内向 K+通道 ,所以
在盐胁迫条件下 ,Na+可能是通过内向 K+通道进入植物体内 ,而使植株遭受盐害.虽然现在
还不能明确是否不同抗盐性植物在高盐环境下其根细胞质膜上内向K+通道的 K+/Na+选择
性与其抗盐性间存在必然联系(即根细胞质膜内向离子通道 K+/Na+选择性高的植株是否也
表现出较高的抗盐性 ,反之亦然),但有研究表明可能在植物的 K+/Na+选择性与抗盐性间存
在一定的关系.如具有较高K+/Na+选择性的普通小麦(Triticum aestivum)的抗盐性强于 K+/
Na+选择性较低的硬粒小麦(Triticum turgidum)[ 9] .而我们实验室最近的研究表明 ,拟南芥至
少可以在含150 mmol/L NaCl的MS 培养基上萌发生长(尚未发表),同时本实验结果证明了拟
南芥根细胞质膜上存在 K+/Na+选择性极高的内向 K+通道 ,但拟南芥的高抗盐性与其高的
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K
+/Na+选择性间的这种联系是否具有普遍性还有待于进一步证实.
3.3　Ca2+对拟南芥根细胞质膜内向 K+通道的影响
Ca2+对一些植物细胞离子通道的调控是 Ca2+调节植物生理生化活动的重要机制之一.
如植物叶片气孔保卫细胞质膜上的内向 K+通道的活性受 Ca2+的显著抑制[ 10] ,而保卫细胞质
膜上的氯通道则被 Ca2+所激活[ 11] .但有些植物细胞的离子通道却对胞质内 Ca2+浓度的变化
并不敏感[ 1 ,2] .本工作的实验结果表明 ,拟南芥根细胞质膜上的内向 K+通道对胞内自由Ca2+
浓度变化不敏感 ,即使是在胞内 Ca2+浓度为 500 μmol/L 时 ,其内向 K+电流仍未受到明显影
响.对黑麦[ 1] 、大麦[ 2]等植物根皮层细胞膜上 K+通道的研究表明 ,不同植物根皮层细胞膜上
的K+通道对胞质 Ca2+的变化均不敏感.植物根细胞质膜上的内向K+通道对胞内自由Ca2+
浓度变化的不敏感性有可能是此类 K+通道的一种共同特性.许多研究业已证明 ,较高的
Ca
2+浓度环境有助于植物对盐胁迫的适应 ,其作用机理可能是由于 Ca2+抑制了 Na+通过内向
K+通道的跨膜内流.如前所述 ,植物根细胞 K+通道的 K+/Na+选择性与植物的抗盐性密切
相关.如果在盐胁迫(即环境中Na+浓度较高的)条件下 ,Ca2+一方面抑制 Na+的跨膜内流 ,而
另一方面又不影响根细胞对 K+的吸收 ,则显然较高的 Ca2+浓度可能增强植物的抗盐性.在
我们正在进行的有关不同生态型拟南芥抗盐性与K+/Na+选择性的关系的研究中 ,将对 Ca2+
调节根细胞K+通道 K+/Na+选择性的机制及其与植物抗盐性的关系等问题继续进行探讨.
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