全 文 ：华北农学报·2015，30(1) :73 -76
收稿日期:2014 － 11 － 26
基金项目:国家自然科学基金项目(31200203) ;河北省自然科学基金项目(C2012204032;C2014405010) ;高等学校博士学科点专项科研
基金项目(20121302120007)
作者简介:蒋琛茜(1988 －) ，男，河北石家庄人，在读硕士，主要从事植物抗病研究。蒋琛茜、瓮巧云为同等贡献作者。
通讯作者:邢继红(1977 －) ，女，河北东光人，教授，博士，主要从事植物与病原物互作研究。
董金皋(1963 －) ，男，河北邢台人，教授，博士，博士生导师，主要从事植物病理学研究。
拟南芥抗病相关基因 T1N6_22 的原核表达分析
蒋琛茜1，瓮巧云2，樊锦涛1，王冠宇1，董丽萍1，邢继红1，董金皋1
(1．河北农业大学，真菌毒素与植物分子病理学实验室，河北 保定 071001;2．河北北方学院 农林科技学院，河北 张家口 075000)
摘要:为构建拟南芥抗病相关 T1N6_22 基因的原核表达载体并进行高效表达，获得纯化的 T1N6_22 蛋白，以拟南
芥 Col-0 的 cDNA为模板，扩增获得了 T1N6_22 基因 CDS，对其进行克隆、测序后与含有 GST标签蛋白的 pGEX4T-1 载
体相连，构建 T1N6_22 的原核表达载体 pGEX4T-1-T1N6_22-GST。经酶切和测序鉴定正确后，将构建好的载体及空载
体转化大肠杆菌 BL21。结果表明，在大肠杆菌 BL21 菌株中成功表达了与标签蛋白融合的 T1N6_22 蛋白，大小约
57 kDa。SDS-PAGE分析表明，高效表达的诱导条件为 0． 1 mmol /L IPTG诱导培养 3 h。研究结果为进一步 T1N6_22
互作蛋白的筛选及其调控拟南芥抗病分子机制的研究奠定了基础。
关键词:拟南芥;T1N6_22;原核表达;纯化
中图分类号:S432． 1;Q78 文献标识码:A 文章编号:1000 － 7091(2015)01 － 0073 － 04
doi:10． 7668 /hbnxb． 2015． 01． 012
Prokaryotic Expression Analysis of Ｒesistance-related Gene
T1N6_22 from Arabidopsis thaliana
JIANG Chen-xi1，WENG Qiao-yun2，FAN Jin-tao1，WANG Guan-yu1，
DONG Li-ping1，XING Ji-hong1，DONG Jin-gao1
(1． Mycotoxin and Molecular Plant Pathology Laboratory，Agricultural University of Hebei，Baoding 071001，China;
2． College of Agriculture and Forestry Science and Technology，Hebei North University，Zhangjiakou 075000，China)
Abstract:This study was aimed to construct prokaryotic expression vector of resistance-related gene T1N6_22
from Arabidopsis thaliana and obtain the purified protein T1N6 _22 with high-efficiency expression． The CDS of
T1N6_22 was amplified by ＲT-PCＲ technology using the cDNA of the Arabidopsis Col-0 and was fused into a pro-
karyotic expression vector pGEX4T-1． Ｒestriction enzyme digestion and sequencing showed that the recombinant
vector pGEX4T-1-T1N6_22-GST was successfully constructed and transformed into E． coli BL21 cells． The results
indicated that the pGEX4T-1-T1N6_22-GST with the predicted molecular weight of about 57 kDa was successfully ex-
pressed in E． coli BL21 strain． SDS-PAGE indicated that the best expression quantity was induced with 0． 1 mmol /L
IPTG treatment for 3 h． These results would provide basis for screening interacting proteins of T1N6_22 and the reg-
ulation mechanism in Arabidopsis resistance．
Key words:Arabidopsis thaliana;T1N6_22;Prokaryotic expression;Purification
病原菌是影响植物正常生长，使作物减产的最
重要的因素之一，常给农业生产造成重大的经济损
失。分离植物抗病相关基因，研究其抗病分子机制，
为植物抗病信号通路的完善奠定基础，进而培育抗
病新品种是防治病害的有效途径。拟南芥(Arabi-
dopsis thaliana)是研究植物与病原菌互作的典型模
式植物，近年来，所获得的大部分植物抗病基因及抗
性相关基因均是从拟南芥中获得的，如 ＲPS2［1］、
ＲPS4［2］、ＲPP8［3］、ＲPP13［4］、ＲAC1［5］、ＲPW8［6］等。
Ｒ2Ｒ3MYB［7］家族中的转录因子 BOS1［8］，该基因功
能缺失使植物对灰霉病菌更加敏感，对丁香假单胞
杆菌抗性增强。MYB30［9 － 10］是植物过敏反应的正
74 华 北 农 学 报 30 卷
调控因子，过表达 MYB30 的烟草和拟南芥对丁香假
单胞杆菌的抗性增强，MYB30 引起的过敏反应需要
SA的积累但不依赖 NPＲ1［11 － 12］基因。乙烯响应因
子(EＲF)家族中 EＲF5、EＲF6［13］可以正调控拟南芥
对灰葡萄孢的抗性。河北农业大学真菌毒素与植物
分子病理学实验室前期获得了拟南芥抗病相关基因
T1N6_22，明确了该基因主要通过 SA 和 JA 信号途
径正调控拟南芥抗灰葡萄孢过程，负调控拟南芥抗
丁香假单胞杆菌过程［14］，但 T1N6_22 基因抗病的分
子机制尚不明确。本试验通过对 T1N6_22 基因进
行原核表达，获得纯化的 T1N6_22 蛋白，为进一步
T1N6_22 互作蛋白的筛选及其调控拟南芥抗病分子
机制的研究奠定基础。
1 材料和方法
1． 1 试验材料
拟南芥 Col-0 由美国 ABＲC 购得;大肠杆菌
DH5α、BL21 由本实验室保存;原核表达载体
pGEX4T-1 由 Pharmacia Biotech 公司购得;ＲNA 提
取试剂、反转录试剂盒由北京全式金公司购得;PCＲ
所用试剂、限制性内切酶、连接酶、相对分子量标准
由大连宝生物公司购得;引物合成、基因测序由上海
生工生物公司完成。
1． 2 试验方法
1． 2． 1 T1N6_22 基因 CDS 序列的克隆 从 4 周龄
拟南芥叶片中提取总 ＲNA，反转录获得其 cDNA。
根据拟南芥数据库 TAIＲ提供的 T1N6_22 序列设计
基因特异性引物，T1N6_22-F(5-CGGAATTCATGG
CAGACCCAAGAGTT-3)、T1N6 _ 22-Ｒ(5-CCGCTC
GAGTCAAAAGTTGGAGACATT-3) ，下划线部分为
酶切位点 EcoＲ Ⅰ和 Xho Ⅰ。将扩增产物连接克隆
载体 pMD19-T，对 T1N6_22 基因进行测序。
1． 2． 2 T1N6_22基因原核表达载体的构建与鉴定
测序正确的 pMD19-T-T1N6_22 和空载体 pGEX4T-1
分别用 EcoＲ Ⅰ和 XhoⅠ进行双酶切，回收其目的条
带，并用 T4 DNA连接酶进行连接，连接产物转化大
肠杆菌 DH5α，挑取克隆进行酶切鉴定，构建重组载
体 pGEX4T-1-T1N6_22-GST，将其与空载体 pGEX4T-1
分别转化大肠杆菌 BL21，对阳性克隆验证正确后进
行诱导表达。
1． 2． 3 IPTG不同诱导浓度对 T1N6_22 蛋白表达的
影响 将转入重组载体 pGEX4T-1-T1N6_22-GST和
空载体 pGEX4T-1 的 BL21 大肠杆菌在 LB液体培养
基中培养过夜，按 1 ∶ 50 比例转接到 30 mL LB 液体
培养基中，培养至 OD600约 0． 7 左右，分别加入不同
浓度的 IPTG至终浓度为 0． 1，0． 2，0． 4，0． 8 mmol /L，
37 ℃诱导 4 h，收集菌体，弃去上清，用 4 ×上样缓冲
液和水重悬菌体沉淀，沸水浴 15 min，离心后取上清
进行 SDS-PAGE(5%浓缩胶、12%分离胶)检测目的
蛋白表达情况，从而确定诱导表达的最适 IPTG
浓度。
1． 2． 4 不同诱导时间对 T1N6_22 蛋白表达的影响
按上述方法，以最适的 IPTG诱导浓度，37 ℃诱导重
组载体 pGEX4T-1-T1N6_22-GST 和空载体 pGEX4T-1
的表达，分别在 0． 5，1，2，3，4 h 收集菌体，提取总蛋
白，进行 SDS-PAGE检测目的蛋白表达情况，从而确
定诱导表达的最佳时间。
1． 2． 5 T1N6_22 蛋白的提取及纯化 以确定的最
适 IPTG浓度和最佳诱导表达时间，在 37 ℃进行诱
导表达，收集菌体，弃去上清，用 pH 值 8． 3 的 Tris-
HCl缓冲液重悬菌体，通过超声波细胞破碎仪破碎
菌体，超声波功率 100 W、工作 5 s、间隙 10 s、50 次
循环，至菌液变为澄清，离心收集上清液，以上操作
均在低温进行，上清于 4 ℃保存备用。
使用 GST 亲和的纯化基质对收集的上清液进
行目的蛋白的纯化，吸取 300 μL 纯化基质于 2 mL
离心管中，用冰上预冷的 Tris-HCl缓冲液洗涤 2 次。
在离心管中加入 1． 5 mL上清液，颠倒混匀，90 r /min
冰浴摇动 1 h，使上清液中带 GST标签的 pGEX4T-1-
T1N6 _ 22-GST 目的蛋白与纯化基质充分结合。
12 000 r /min 离心，弃去上清，保留基质，用 1 mL
Tris-HCl缓冲液洗涤 3 次，除去不能与基质结合的
杂蛋白。洗脱液使用 5 mL 0． 1 mol /L Tris、0． 061 4 g
谷胱甘肽还原型、0． 1 mol /L HCl调 pH值至 8． 3，加
水至 10 mL。Tris-HCl 洗涤后的纯化基质，用 1 mL
洗脱液、90 r /min冰浴摇动 1 h，使与基质结合的目
的蛋白脱离，收集洗脱液，进行 SDS-PAGE(5%浓缩
胶、12%分离胶)检测目的蛋白的纯化情况，洗脱液
4 ℃保存。
2 结果与分析
2． 1 T1N6_22 基因的扩增及原核表达载体的构建
T1N6_22 基因原核表达载体 pGEX4T-1-T1N6_
22-GST的构建如图所示(图 1-A)。使用基因特异
性引物扩增 T1N6 _22 基因的 CDS，得到大小约
888 bp的条带(图 1-B) ，与预期大小一致。回收目
的条带，连接克隆载体 pMD19-T 并转化大肠杆菌
DH5α，对阳性克隆测序鉴定，序列与 TAIＲ数据库提
供的序列一致。使用 EcoＲⅠ和 XhoⅠ对 pMD19-T-
T1N6_22 载体和空载体 pGEX4T-1 进行双酶切，回
1 期 蒋琛茜等:拟南芥抗病相关基因 T1N6_ 22 的原核表达分析 75
收相应条带并连接，连接产物转化大肠杆菌 DH5α，
挑取克隆进行酶切鉴定，获得了目的条带(图 1-C) ，
表明 T1N6_22 基因的原核表达载体构建成功。
A． pGEX4T-1-T1N6_22-GST载体图谱;B． T1N6_22 基因的扩增;C． pGEX4T-1-T1N6_22-GST载体的酶切鉴定。
A． Map of pGEX4T-1-T1N6_22-GST;B． PCＲ amplification of T1N6_22;C． Identification of pGEX4T-1-T1N6_22-GST by restriction enzyme digestion．
图 1 T1N6_22 基因原核表达载体的构建
Fig． 1 Construction of prokaryotic expression vector pGEX4T-1-T1N6_22-GST of T1N6_22 gene
2． 2 IPTG不同诱导浓度对 T1N6_22蛋白表达的影响
为确定诱导表达使用的最佳 IPTG 浓度，接种
后分别用 0． 1，0． 2，0． 4，0． 8 mmol /L IPTG，37 ℃诱
导表达 4 h，收集菌体，以未诱导的菌体作为对照，进
行 SDS-PAGE 检测。结果发现，带有 pGEX4T-1 空
载体的菌株可以诱导表达出大小约为 26 kDa 的
GST蛋白，带有 pGEX4T-1-T1N6_22-GST 载体的菌
株均可以诱导表达出大小约为 57 kDa的蛋白，与融
合蛋白的大小相符(GST 蛋白为 26 kDa、T1N6_22
蛋白为 31 kDa)。IPTG 浓度为 0． 1 ～ 0． 8 mmol /L
时，融合蛋白的表达水平没有明显的变化(图 2)，由
此确定 IPTG的工作浓度为 0． 1 mmol /L。
A． pGEX4T-1 空载体的诱导表达;M． 蛋白分子量标准;1． IPTG 未诱
导;2． IPTG诱导 GST蛋白;B． pGEX4T-1-T1N6_22-GST 的诱导表达;
M．蛋白分子量标准;1． IPTG 未诱导;2 ～ 5． IPTG 诱导浓度分别为
0. 1，0． 2，0． 4，0． 8 mmol /L。
A． Expression of pGEX4T-1 with IPTG induction;M． Protein Marker;1．
Expression without IPTG induction;2． Expression of GST with IPTG in-
duction;B． Expression of pGEX4T-1-T1N6_22-GST with IPTG induction;
M． Protein Marker;1． Expression without IPTG induction;2 － 5． Expres-
sion with 0． 1，0． 2，0． 4，0． 8 mmol /L IPTG．
图 2 不同 IPTG浓度与 pGEX4T-1-T1N6_22-GST
表达量的关系
Fig． 2 Ｒelationship between different concentration
of IPTG and pGEX4T-1-T1N6_22-GST
2． 3 不同诱导时间对 T1N6_22 蛋白表达的影响
将带有 pGEX4T-1-T1N6_22-GST载体的菌株接
种 LB液体培养基，使用 0． 1 mmol /L 的 IPTG 浓度，
37 ℃诱导表达，分别在诱导 0． 5，1，2，3，4 h 时收集
菌液，以未诱导的菌体作为对照，进行 SDS-PAGE 检
测。结果发现，在不同诱导时间下均可以诱导表达出
大小约为 57 kDa 的融合蛋白;在诱导时间 0． 5 ～ 3 h
内，随诱导时间的延长诱导表达的蛋白含量逐渐增
高;诱导 3，4 h，融合蛋白的表达量没有明显的变化
(图 3)。由此确定，融合蛋白的诱导时间为 3 h。
2． 4 T1N6_22 蛋白的纯化
以确定的诱导表达最适条件，对 pGEX4T-1-
T1N6_22-GST 蛋白进行诱导表达，超声波破碎菌
体，离心后取上清使用GST亲和的纯化基质进行
M．蛋白分子量标准;1． IPTG未诱导;2 ～ 6． IPTG
诱导时间分别为 4，3，2，1，0． 5 h。
M． Protein Marker;1． Expression without IPTG induction;2 －6． Expression
of pGEX4T-1-T1N6_22-GST with IPTG induction for 4，3，2，1，0． 5 h．
图 3 不同诱导时间与蛋白表达量的关系
Fig． 3 Ｒelationship between different time of
induction and pGEX4T-1-T1N6_22-GST
M．蛋白分子量标准;1． pGEX4T-1-T1N6_22-GST蛋白;
2．纯化前上清液。
M． Protein Marker;1． Purified protein pGEX4T-1-T1N6_22-GST;
2． Supernatant before purification．
图 4 pGEX4T-1-T1N6_22-GST蛋白的纯化
Fig． 4 Purification of protein pGEX4T-1-T1N6_22-GST
76 华 北 农 学 报 30 卷
pGEX4T-1-T1N6_22-GST 蛋白的纯化，SDS-PAGE 分
析纯化后的蛋白，获得了单一的融合蛋白条带(图 4)。
3 讨论
外源基因在大肠杆菌体内中能否高效表达受到
很多因素的影响和限制，如大肠杆菌菌株类别、原核
表达载体、诱导物浓度、诱导时间及诱导温度。一般
诱导蛋白表达的温度控制在 16 ～ 37 ℃，诱导可以用
温度诱导和药物诱导，一般利用药物(如 IPTG)诱导
较多［15 － 17］。李波等［18］将载体 pET-28a 质粒在大肠
杆菌 BL21(DE3)菌株中表达，IPTG 浓度为 0． 2
mmol /L，在 30，37 ℃诱导 3 h 和 16 ℃诱导 12 h 后
收集菌体检测发现，3 种条件下目的蛋白均可以表
达，但均以包涵体的形式存在。在诱导表达 pET-
32a-MYB61 蛋白时，随 IPTG 浓度的提高和诱导时
间的延长，目的蛋白的表达量均为上升趋势，并在
1 mmol /L IPTG诱导 2 h时达到最大值［19］。可见不
同条件、不同基因所表达的蛋白形式不同，因此，对
相应基因的表达条件的摸索十分必要。本研究使用
pGEX4T-1［20］载体进行原核表达，该载体具有 tac 启
动子，可以高效的表达目的蛋白。通过构建
pGEX4T-1-T1N6_22-GST 载体转入大肠杆菌 BL21
进行表达，在 IPTG浓度为 0． 1，0． 2，0． 4，0． 8 mmol /L
时蛋白表达量基本一致，说明 IPTG 浓度对目的蛋
白表达的影响不大，故试验选择了 0． 1 mmol /L作为
后续试验的最适浓度，以减少菌株的表达压力。超
声波破碎菌体后使用 GST 亲和的琼脂糖微球进行
目的蛋白的纯化，SDS-PAGE 检测发现纯化后的蛋
白含量比超声波裂解后上清中的蛋白含量明显降
低，这说明纯化得到了单一的融合蛋白，但纯化条件
仍需要进一步进行优化，以期获得更高含量的目的
蛋白，下一步试验将筛选 T1N6_22 的互作蛋白，为
明确 T1N6_22 基因调控拟南芥抗病的分子机制奠
定了基础。
参考文献:
［1］ Belkhadir Y，Nimchuk Z，Hubert D A，et al． Arabidopsis
ＲIN4 negatively regulates disease resistance mediated by
ＲPS2 and ＲPM1 downstream or independent of the NDＲ1
signal modulator and is not required for the virulence
functions of bacterial type Ⅲ effectors AvrＲpt2 or Avr-
Ｒpm1［J］． Plant Cell，2004，16(10):2822 － 2835．
［2］ Gassmann W，Hinsch M E，Staskawicz B J． The Arabidop-
sis ＲPS4 bacterial-resistance gene is a member of the
TIＲ-NBS-LＲＲ family of disease-resistance genes［J］．
Plant Journal，1999，20(3) :265 － 277．
［3］ Mohr T J，Mammarella N D，Hoff T，et al． The Arabidopsis
downy mildew resistance gene ＲPP8 is induced by patho-
gens and salicylic acid and is regulated by W box cis ele-
ments［J］． Molecular Plant-Microbe Interactions，2010，23
(10) :1303 － 1315．
［4］ Ｒose L E，Bittner-Eddy P D，Langley C H，et al． The ma-
intenance of extreme amino acid diversity at the disease
resistance gene，ＲPP13，in Arabidopsis thaliana［J］． Ge-
netics，2004，166(3) :1517 － 1527．
［5］ Borhan M H，Holub E B，Beynon J L，et al． The Arabidop-
sis TIＲ-NB-LＲＲ gene ＲAC1 confers resistance to albugo
candida(white rust)and is dependent on EDS1 but not
PAD4［J］． Molecular Plant-Microbe Interactions，2004，17
(7) :711 － 719．
［6］ Jorgensen T H，Emerson B C． ＲPW8 and resistance to pow-
dery mildew pathogens in natural populations of Arabidopsis
lyrata［J］． New Phytologist，2009，182(4) :984 －993．
［7］ Mengiste T，Chen X，Salmeron J，et al． The BOTＲYTIS
SUSCEPTIBLE1 gene encodes an Ｒ2Ｒ3MYB transcrip-
tion factor protein that is required for biotic and abiotic
stress responses in Arabidopsis［J］． Plant Cell，2003，15
(11) :2551 － 2565．
［8］ Veronese P，Chen X，Bluhm B，et al． The BOS loci of Ara-
bidopsis are required for resistance to Botrytis cinerea in-
fection［J］． Plant Journal，2004，40(4) :558 － 574．
［9］ Canonne J，Marino D，Jauneau A，et al． The xanthomonas
type Ⅲ effector XopD targets the Arabidopsis transcrip-
tion factor MYB30 to suppress plant defense［J］． Plant
Cell，2011，23(9) :3498 － 3511．
［10］ Li L，Yu X，Thompson A，et al． Arabidopsis MYB30 is a
direct target of BES1 and cooperates with BES1 to regu-
late brassinosteroid-induced gene expression［J］． Plant
Journal，2009，58(2) :275 － 286．
［11］ Canet J V，Dobon A，Ｒoig A，et al． Structure-function a-
nalysis of npr1 alleles in Arabidopsis reveals a role for
its paralogs in the perception of salicylic acid［J］． Plant
Cell and Environment，2010，33(11) :1911 － 1922．
［12］ 张红志，蔡新忠． 病程相关基因非表达子 1(NPＲ1) :
植物抗病信号网络中的关键节点［J］． 生物工程学
报，2005，21(4) :511 － 515．
［13］ Moffat C S，Ingle Ｒ A，Wathugala D L，et al． EＲF5 and
EＲF6 play redundant roles as positive regulators of JA /
Et-Mediated defense against Botrytis cinerea in Arabi-
dopsis［J］． PLOS One，2012，7(4) :e35995．
［14］ Xing J H，Weng Q Y，Hao C C，et al． T1N6_22 gene is
required for biotic and abiotic stress responses in arabi-
dopsis［J］． Ｒussian Journal of Genetics，2012，48(12) :
1191 － 1198．
［15］ Han X Q，Lin X M，Chen H J，et al． The prokaryotic ex-
pression and bioactivity of the recombinant red fire ant
venom allergen soli 4［J］． Agricultural Sciences in Chi-
na，2009，8(2) :182 － 187．
［16］ 邓毛子，石春薇，王 芳，等．结核分枝杆菌 Ag85A蛋
白的原核表达、纯化和免疫反应性［J］． 基础医学与
临床，2010，30(2):117 － 121．
［17］ Ｒao C N，Ｒeeder D J，Stack S M，et al． Prokaryotic ex-
pression，purification，and reconstitution of biological ac-
tivities(antiprotease，antitumor，and heparin-binding)for-
tissue factor pathway inhibitor-2［J］． Biochemical and
Biophysical Ｒesearch Communications，2000，3(276) :
1286 － 1293．
［18］ 李 波，倪志勇，范 玲．棉花 GhCOMT3 基因的原核
表达、纯化及鉴定［J］． 华北农学报，2010，25(z1) :
12 － 16．
［19］ 杜李继，顾 菊，陈光朗，等．拟南芥 AtMYB50 和 At-
MYB61 蛋白的原核表达研究［J］． 合肥工业大学学
报:自然科学版，2014，37(1):105 － 109．
［20］ Wu C，Wang Y Y，Zou M J，et al． Prokaryotic expres-
sion，purification，and production of polyclonal antibody
against human polypeptide N-acetylgalactosaminyl trans-
ferase 14［J］． Protein Expression and Purification，2007，
56(1) :1 － 7．