全 文 ：华北农学报·2013，28(6) :93 -97
收稿日期:2013 － 06 － 08
基金项目:内蒙古自治区科技厅自然科学基金面上项目(2010MS0312)
作者简介:王 欣(1984 －) ，女，内蒙古包头人，硕士，主要从事生化与分子生物学研究。
通讯作者:张彦桃(1975 －) ，女，内蒙古呼和浩特人，助理研究员，在读博士，主要从事生化与分子生物学研究。
拟南芥 AtHAK5 基因启动子顺式作用
元件功能域的鉴定
王 欣，杨 菊，祁 智，张彦桃
(内蒙古大学 生命科学学院，内蒙古 呼和浩特 010021)
摘要:为鉴定 AtHAK5 启动子中的功能域，并进一步确定对应的转录因子。将 AtHAK5 编码拟南芥高亲和性钾转
运体 6 个不同长度的启动子片段克隆到双元表达载体 pOＲE Ｒ1 中 β-葡萄糖醛酸酶(GUS)报告基因的上游，构成 pro-
moter AtHAK5∶ ∶ GUS融合基因。通过农杆菌侵染野生型拟南芥花序，得到稳定表达该融合基因的 T3 转基因种子。通
过基于 GUS活性的组织化学染色法，对这些来自 T3 转基因种子、经过低钾处理的幼苗进行分析，确定 AtHAK5 启动子
中感应低钾环境的顺式作用元件位于起始转录上游 － 471 ～ － 267 范围内。
关键词:拟南芥;AtHAK5 基因;启动子;顺式作用元件
中图分类号:S634 文献标识码:A 文章编号:1000 － 7091(2013)06 － 0093 － 05
Identification of Cis-element Location in AtHAK5 Promoter
WANG Xin，YANG Ju，QI Zhi，ZHANG Yan-tao
(College of Life Sciences，Inner Mongolia University，Huhhot 010021，China)
Abstract:AtHAK5 encodes a high affinity K + transporter． Six AtHAK5 promoter fragments with different length
were cloned into the upstream of β-Glucuronidase reporter gene(GUS)in pOＲE Ｒ1 binary expression vector，which
forms promoter AtHAK5∶ ∶ GUS fusion gene． The T3 generation transformed seeds stably expressing the fusion gene
were gotten through Agrobacterium-mediated Arabidopsis transformation with floral dip method． The cis-elements of
the AtHAK5 promoter was located at the transcription region of 471 － 267 thought GUS activity based histochemical
staining of the transformed seedlings grown on low potassium condition． This study identified the functional domain
within the AtHAK5 promoter，which sets the foundation for further finding of the corresponding transcript factor．
Key words:Arabidopsis;AtHAK5 gene;Promoter;Cis-element
钾是植物生长和发育所必须的大量营养元素之
一，占植物干质量的 0． 8% ～ 8． 0%。钾在植物细胞
基质中的含量 80 ～ 200 mmol /L［1］，在酶活性功能、
渗透调节、气孔运动和维持细胞膜电势平衡方面发
挥重要作用［2］。我国是钾资源严重缺乏的国家之
一，目前为了解决这一问题，除了在矿产技术方面加
大对钾盐资源的开发以外，培育高效吸收利用钾肥
的新型植物是植物育种的任务之一。
植物根系对 K +吸收是通过 2 个不同的系统进
行的，分别称为高亲和性 K +运输系统和低亲和性
K +运输系统。高亲和性 K +运输系统在外界 K +浓
度低(0． 001 ～ 0． 200 mmol /L)的条件下起作用，低
亲和性 K + 运输系统在外界 K + 浓度高(1 ～ 10
mmol /L)的条件下起作用［3］。Santa-Maria 等［4］鉴定
出了植物 K +转运体的 KUP /HAK /KT 家族，并证实
KUP /HAK /KT转运体家族是高亲和性钾吸收转运
体。Gierth等［5］利用基因芯片技术研究低钾条件下基
因的表达情况，发现 AtHAK5 mＲNA 表达量相对于其他
基因有显著升高。对含有 promoter AtHAK5∶ ∶ GUS 及
promoter AtHAK5∶ ∶ GFP融合基因的拟南芥转基因植
株进行组织化学染色及共聚焦分析证实 AtHAK5 基
因在拟南芥根中表达，主要定位于主根的表皮和中
柱细胞及侧根的表皮细胞中。同时他们对 T-DNA
插入突变体 athak5 分析表明，AtHAK5 是介导高亲
94 华 北 农 学 报 28 卷
和性钾吸收系统的主要组成成分。本研究通过确定
AtHAK5 启动子中感应低钾环境的顺式作用元件的
功能区域，为下一步利用酵母单杂交技术鉴定在低
钾条件下调节 AtHAK5 基因表达的转录因子奠定了
基础。
1 材料和方法
1． 1 植物材料
拟南芥哥伦比亚野生型种子(Col-0) ，内蒙古大
学植物信号转导实验室保存。
1． 2 菌种和质粒
大肠杆菌 (Escherichia coli)DH5α、农杆菌
(Agrobacterium tumefacient)GV3101 为本实验室保
存;T /A克隆载体 pEASY-T1 simple vector 购自北京
全式金公司;表达载体 pOＲE Ｒ1(STOCK:CD3-929)
菌株购自拟南芥资源中心 ABＲC(Arabidopsis Biolog-
ical Ｒesource Center)。
1． 3 主要酶及试剂
TranSTAＲ DNA 聚合酶、TransZol UP 购自北京
全式金生物技术有限公司;ExTaq 聚合酶、DNaseⅠ、
感受态细胞提取试剂盒、限制性内切酶、反转录试剂
盒购自大连宝生物工程有限公司;T4 DNA 连接酶
为 Promega公司产品;质粒提取试剂盒、胶回收试剂
盒购自天根生化有限公司;其余试剂均为国产分析
纯试剂。
1． 4 CK培养基
大量元素:0． 50 mmol /L H3 PO4，2． 00 mmol /L
Ca(NO3)2，1． 00 mmol /L KCl，0． 75 mmol /L MgSO4;
微量元素:5． 0 μmol /L H3 BO3，1． 0 μmol /L MnCl2，
2. 0 μmol /L ZnSO4，0． 1 μmol /L CuSO4，0． 5 μmol /L
Na2MoO4;铁盐:74 μmol /L FeSO4·7H2O，74 μmol /L
Na2·EDTA·2H2O，5 mmol /L MES(MES hydrate) ，1%
蔗糖，BTP(BIS-TＲIS propane)调 pH值至 5． 8，1. 0%
琼脂糖。
1． 5 方法
1． 5． 1 含有 promoter AtHAK5 ∶ ∶ pOＲE Ｒ1 双元表达
载体的构建 避开了所有 AtHAK5 启动子区域内潜
在的转录因子结合位点，以相同的下游引物(pＲ)及
各自的上游引物(表 1) ，扩增了 6 个不同长度的
AtHAK5 promoter产物片段，每个片段长度差为 200
碱基左右。分别克隆于 pEASY-T1 simple vector，测
序正确的质粒酶切后连接表达载体 pOＲE Ｒ1，获得
含有 promoter AtHAK5∶ ∶ GUS融合基因的双元表达载
体 promoter AtHAK5∶ ∶ pOＲE Ｒ1。
表 1 本试验所使用的引物
Tab． 1 Primers used for this study
引物名称
Name of primers
序列(5→3)
Sequences(5→3)
用途
Purpose
p267 ACCGGATCCATTCGGAAGATGTTCTACGTAC 267 promoter
p471 ACCGGATCCTACCATCATTAGTTTACTTTGC 471 promoter
p611 GGATCCTTGTCCAGATATCTTAAATAG 611 promoter
p821 ACCGGATCCACATGTAGCCGTTCACAGAC 821 promoter
p982 ACCGGATCCTGGATATGTATGAACCCTCT 982 promoter
p1172 ACCGGATCCAGATTAGCTAATTGGTACAAAATCG 1172 promoter
pＲ ACAGCGGCCGCGTTTTTAACTCTTCTTTTGCC 启动子下游引物
1． 5． 2 含有 promoter AtHAK5∶ ∶ GUS融合基因的转基
因 T3纯合体的获得 含有 promoter AtHAK5∶ ∶ GUS融
合基因的农杆菌菌株侵染野生型拟南芥，将获得的
T1 杂合种子在含有卡那霉素的抗性培养基上进行
筛选，长出 4 片真叶的植株为杂合体(Aa) ，单株收
种得到 T2 种子。利用卡那霉素的抗性培养基筛选
会发生活(AA∶ Aa)∶ 死(aa)= 3∶ 1 的分离。收获的
T3 种子在含有卡那霉素抗性培养基上筛选单基因
纯合突变体(AA)。
1． 5． 3 转化植株的组织化学染色检测 将收获后
的 T3 种子播种于 CK培养基(1 mmol /L KCl)上，竖
直光照培养 8 d(根长 2 ～ 3 cm)。将竖直培养的苗
子从 CK 培养基转至低钾诱导培养基(50 μmol /L
KCl) ，48 h后进行组织化学染色。
2 结果与分析
2． 1 AtHAK5 promoter 潜在转录因子结合位点预测
选取 AtHAK5 基因上游 1 249 碱基的启动子区
域，通过 PlantCAＲE(植物启动子数据库)分析潜在
的转录因子结合位点(图 1)。
利用 plantCAＲE数据库得出该启动子区域内潜
在的转录因子结合位点(图 1 中方框序列)。表 2
为该启动子区域内可能存在的 13 个上游元件或应
答元件，除了真核生物常有的普通顺式作用元件
CAAT-box和 TATA-box外，还有 4 个参与光反应的
应答元件(ACE、Box4、GAG 和 BoxⅠ) ，1 个乙烯响
6 期 王 欣等:拟南芥 AtHAK5 基因启动子顺式作用元件功能域的鉴定 95
应元件(EＲE) ，1 个生长素响应元件(AuxＲＲ-core) ，
1 个茉莉酸响应元件(CGTCA)、1 个 ABA 响应元件
(ABＲE)、1 个分生组织表达元件(CAT-box)和 2 个
干旱诱导的应答元件(MBS和 ABＲE)。
大写字母序列． AtHAK5 的 5非翻译区序列;下划线序列．通过分析所设计的引物;方框序列．现已发现的元件。
Capital character． 5-Untranslated region;Underlined sequence． Primer sequences;Frame sequence． Motifs found．
图 1 潜在转录因子结合位点分析
Fig． 1 Binding sites of potential transcription factor
表 2 AtHAK5 promoter中潜在的元件
Tab． 2 Cis-element found in AtHAK5 promoter
序号
Sequence number
序列
Sequence
位点名称
Name of cis-element
功能
Function
1 CAAT CAAT-box 普通顺式作用元件
2 GCCACT CAT-box 分生组织表达
3 TACGTG ABＲE ABA响应
4 AAAACGTTTA ACE 光反应
5 ATTAAT Box 4 光反应
6 TATA TATA-box － 30 转录起始
7 AGAGAGT GAG 光反应
8 TTTCAAA BoxⅠ 光反应
9 CAANNNNATC circadian 生理控制
10 CGTCA CGTCA 茉莉酸响应
11 TAACTG MBS 干旱诱导
12 GGTCCAT AuxＲＲ-core 生长素应答
13 ATTTCAAA EＲE 乙烯应答
2． 2 含有 promoter AtHAK5∶ ∶ pOＲE Ｒ1 双元表达
载体的构建
将 AtHAK5 基因 6 个不同长度启动子片段克隆
到双元表达载体 pOＲE Ｒ1 中 β-葡萄糖醛酸酶
(GUS)报告基因的上游。在合适的诱导条件下，上
游的 AtHAK5 promoter可以启动下游 GUS 基因的表
达，通过组织化学染色法可以对启动子的活性进行
检测。构建结果如图 2 所示。
图 2 表达载体的构建
Fig． 2 Construction of expression vector
96 华 北 农 学 报 28 卷
2． 3 转基因植株的获得
将收获的种子以转基因片段长度命名，以字母
A ～ Z进行编号。转基因植株筛选结果如表 3 所示。
T2 分别筛选到 10，18，2，10，11 株阳性苗，分别单株
收种后播于卡那霉素抗性培养基，筛选得到 T3 单
基因纯合体，分别为 267H-7-(2、9)、471S-10-(8、10、
12)、611Q-12-8、821B-7-3、982G-10-(7、12)、1172 J-
10-(7、11)。
表 3 转基因植株筛选结果
Tab． 3 Screening results of transgenic plants
名称
Name
T1 种子
Seeds of T1
T2 种子
Seeds of T2
T3 种子
Seeds of T3
267pro∶ GUS 267A-T 267D-5、267G-9、267H-7、267M-3、267P-2 267H-7-(2、9)
471pro∶ GUS 471A-T 471B-(10、12)、471I-2、471S-(10、12) 471S-10-(8、10、12)
611pro∶ GUS 611A-T 611B-(5 、6 、9)、611D-(7 、10)、611F-7、611H-9、611P-12 611Q-12-8
611Q-(2、9、12 )、611S-(2、3、6、9)611S-(10 、11 、13)
821pro∶ GUS 821A-T 821B-7、821D-11 821B-7-3
982pro∶ GUS 982A-T 982 A-(10、12)、982D-7、982 E-(3、10)、982 G-(3、10)、982M-7 982G-10-(7、12)
982P-3、982T-2
1172pro∶ GUS 1172A-T 1172 B-(7、9)、1172 D-(3、7、12)、1172 F-3、1172 J-(9、10) 1172 J-10-(7、11)
1172 M-12、1172 P-(5、9)
2． 4 转基因植株的组织化学染色检测结果
将稳定表达 promoter AtHAK5 ∶ ∶ GUS 的拟南芥
T3 植株，低钾处理后进行组织化学染色，结果如图 3。
A ～ F分别为 267 pro∶ GUS、471 pro∶ GUS、611 pro∶ GUS、821 pro∶ GUS、982 pro∶ GUS、1172 pro∶ GUS
A － F． 267 pro∶ GUS，471 pro∶ GUS，611 pro∶ GUS，821 pro∶ GUS，982 pro∶ GUS，1172 pro∶ GUS．
图 3 拟南芥转基因植株根部的组织化学染色
Fig． 3 GUS staining in Arabidopsis transgenic plants root
在本试验中每个不同启动子的片段长度定义
为相应启动子的名称，启动子片段与 GUS形成的融
合基因名称则定义为相应转基因植株的名称。根据
T3 植株 GUS 组织化学染色结果，转基因植株 267
promoter∶ ∶ GUS 的根部没有蓝色(图 3-A) ，转基因植
株 471 promoter∶ ∶ GUS(图 3-B)、611 promoter∶ ∶ GUS
(图 3-C)、821 promoter∶ ∶ GUS(图 3-D)、982 promoter
∶ ∶ GUS(图 3-E)、1172 promoter∶ ∶ GUS(图 3-F)的根
部均有蓝色。由此看出 267 promoter 不足以启动下
游基因的表达，而 471 promoter 完全可以启动下游
GUS基因的表达而使拟南芥根部变蓝。所以可以判
定 AtHAK5 promoter 顺式作用元件位于转录起始位
点上游 － 471 ～ － 267 区域内。
3 讨论
钾和氮都是植物重要的大量元素，是植物生长
和基因表达变化的重要的信号分子。为了证实氮响
应的基因表达的顺式作用元件，Konishi等［6］分析了
6 期 王 欣等:拟南芥 AtHAK5 基因启动子顺式作用元件功能域的鉴定 97
拟南芥编码亚硝酸还原酶基因 NIＲ1 的启动子，确
定相对于起始位点 － 188 到 － 1 区域至少存在一个
与氮依赖活性相关的必需的顺式作用元件，氮转运
体 NＲT2． 1 和 /或 NＲT2． 2 起着重要作用。目前研究
已知 AtHAK5是受低钾调控诱导表达的基因，并且依
赖于过氧化物的产生［7］。Schachtman等研究发现，转
录因子 ＲAP2． 11 可以在低钾条件下与 AtHAK5 启动
子中的 EＲE 结构域和 GCC-box 相结合，从而启动
AtHAK5基因表达，使植物充分吸收外界环境中有限
的钾离子，以维持植物的正常生长和发育［8］。
植物响应低钾胁迫是一个复杂的生物学过程，
对 rap2． 11 突变体分析表明，AtHAK5 的表达量没有
显著降低，说明 ＲAP2． 11 可能和其他转录因子协同
作用影响 AtHAK5 的表达［9］。本试验通过构建不同
长度 AtHAK5 promoter和 GUS基因的融合表达载体，
获得转基因拟南芥 T3 稳定表达的纯合体植株，组
织化学染色方法鉴定了 AtHAK5 promoter 中响应低
钾信号的转录因子与其结合位点的区域，下一步可
以利用酵母单杂交方法鉴定在低钾条件下调节
AtHAK5 基因表达的转录因子奠定了基础。
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櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂
1483 － 1494．
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