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中国科学 C辑 生命科学 2004, 34 (2): 129~135 129




SCIENCE IN CHINA Ser. C Life Sciences
拟南芥保卫细胞微丝骨架的解聚
可能参与了细胞外钙调素诱导的气孔关闭*
肖玉梅① 陈玉玲①② 黄荣峰③ 陈 珈① 王学臣①**
(①中国农业大学生物学院, 植物生理生化国家重点实验室, 北京 100094; ②河北师范大学生物系, 石家庄 050016;
③中国农业科学院生物技术研究所, 北京 100081)
摘要 细胞外钙调素(CaM)在植物的许多生理活动中都执行着重要功能, 但它对气孔运动的作
用及其调控机制, 人们了解的很少. 以模式植物拟南芥为材料, 研究了细胞外CaM在保卫细胞壁
上的存在及其对气孔运动的调控机制. 结果表明, 拟南芥保卫细胞壁中存在有分子量为 17 kD的
CaM, 并应用W7-琼脂糖和 CaM抗血清初步证明了保卫细胞壁中存在的 CaM可能具有促进气孔
关闭和抑制气孔开放的作用. 在应用外源 CaM 诱导气孔关闭的实验中, 保卫细胞微丝骨架由长
而呈辐射状分布的聚合态逐步解聚, 气孔开度也随着降低. 药理学实验结果表明, 保卫细胞微丝
骨架的解聚能明显地促进外源 CaM 诱导的气孔关闭, 而微丝骨架的聚合则抑制这一过程. 研究
结果还表明, 外源 CaM能诱导保卫细胞[Ca2+]cyt升高; 当使用 Ca2+螯合剂EGTA时, 外源 CaM诱
导的[Ca2+]cyt 升高和气孔关闭运动均受到抑制. 为此推测细胞外 CaM 可能是通过诱导保卫细胞
[Ca2+]cyt升高, 导致微丝骨架的解聚, 进而促进气孔的关闭运动.
关键词 拟南芥 气孔运动 细胞外 CaM 微丝骨架 [Ca2+]cyt

2003-09-04收稿, 2003-12-30收修改稿
* 国家重点基础研究发展规划项目(批准号: G1999011700)和国家自然科学基金项目(批准号: 30370129)资助
** 联系人, E-mail: xcwang@public.bta.net.cn
CaM 普遍存在于真核细胞内, 其基因的表达和
蛋白的亚细胞定位受光、渗透胁迫、病原体及植物激
素等多种因子调控[1]. 细胞内 CaM 在植物的病原体
和伤害反应[2]及超敏感反应[3]中都执行着重要的生理
功能. CaM也普遍存在于高等植物细胞质外体中, 如
燕麦胚芽鞘的细胞壁[4]、小麦胚芽鞘的细胞壁[5]、玉
米的根尖细胞[6]以及胡萝卜和烟草悬浮细胞的介质
中[7,8]. 植物内源细胞外 CaM 具有促进细胞与原生质
体增殖[7,8]、启动花粉萌发和促进花粉管伸长[9]、诱导
基因的表达[10]等多种生物学功能. 花粉质膜上的异
三聚体 G 蛋白参与了细胞外 CaM跨膜信号转导, 胞
内钙信使系统和肌醇磷酯系统可能参与了其在胞内
的信号传递[11,12]. 最近我们实验室的工作表明存在于
蚕豆保卫细胞壁中的内源细胞外 CaM 能够调控气孔






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运动[13].
有报道指出在气孔开闭运动过程中, 保卫细胞
微丝骨架和微管骨架处于高度的聚合和解聚的动态
变化中, 并参与了如光照、黑暗、ABA等多种细胞外
信号在保卫细胞的信号转导 [14~17]. 其中微管骨架的
聚合和解聚分别促进了气孔的开放和关闭[18]; 而微
丝骨架的解聚对气孔的开放和关闭运动都具有促进
作用, 聚合态的微丝对气孔的开放和关闭运动都具
有抑制作用[14~17]. 但是, 细胞外 CaM 在对气孔运动
的调控中是否有微丝骨架的参与尚未见报道.
为了研究细胞外 CaM 调控气孔运动的机制, 本
文以模式植物拟南芥为材料 , 重点探讨了细胞外
CaM 诱导气孔关闭过程中保卫细胞微丝骨架和胞内
Ca2+的作用.
1 材料与方法
1.1 植物材料
将野生型拟南芥和表达标记微丝骨架融合蛋白
(为鼠的 talin 蛋白和绿色荧光蛋白的融合蛋白, 记为
GFP-mTn)的转基因拟南芥置于 MS 固体培养基上萌
发, 然后再将幼苗移植到温室营养土中继续生长, 光
周期为 12 h/12 h (光/暗), 温度为 22℃/18℃(光/暗),
光照强度为 200 mmol/(m2·s), 湿度为 75%. 以生长
4~5周、长势良好的拟南芥叶片为实验材料.
1.2 CaM在叶片表皮条中存在的免疫印迹鉴定
提取拟南芥叶片表皮条的细胞壁蛋白[5], 将得到
的壁蛋白用 Bio-Rad 公司微型电泳仪进行 15％的
SDS-PAGE电泳, 上样量为 60 mg蛋白, 经 100 V, 4
℃电泳 1 h后转移至硝酸纤维素(NC)膜上, 37℃, 3%
BSA封闭NC膜 1 h, 一抗(抗小麦CaM全蛋白的抗血
清, 工作浓度为 1︰50)37℃孵育 1 h, 二抗(碱性磷酸
酯酶交联的羊抗兔 IgG, 工作浓度为 1︰500, Sigma
产品)37℃孵育 1 h, 然后避光室温显色.
1.3 CaM在保卫细胞壁存在的免疫荧光鉴定
撕取拟南芥叶片的下表皮, 轻轻地刷去叶肉细
胞, 在 4%的多聚甲醛中固定 1 h, PBS漂洗 3次, 然后
置于 3%的 BSA 中封闭 10 min, 37℃一抗孵育 1 h,
PBS漂洗后用羊抗兔 FITC-IgG(0.1 mg/mL)孵育 1 h,
PBS 漂洗, 50%甘油封片, 用激光共聚焦扫描显微镜
(Bio-Rad MRC1024) 记录图片. 对照试验以正常兔
血清代替一抗.
1.4 气孔开度测定
撕取拟南芥叶片的下表皮, 轻轻刷去叶肉细胞,
然后将其置于 MES 缓冲液中(10 mmol/L pH 6.1 的
Mes-Tris, 50 mmol/L K+, 100 mmol/L Ca2+). 在进行气
孔关闭实验时, 先将表皮条经冷光源照射 2 h(光强度
为 300 mmol/(m2·s)), 使气孔充分张开后移至室内光
线下进行如下处理 : (ⅰ ) 加入纯化的 10-8~10-10
mol/L菜花 CaM; (ⅱ) 20 mmol/L CD和 0.1 mmol/L
Phalloidin预处理 30 min, 然后用 10-9 mol/L CaM处
理; (ⅲ) 2 mmol/L EGTA处理 30 min后, 用 10-9 mol/L
CaM 处理 1 h. 在进行光诱导气孔开放实验时, 先将
表皮条经黑暗处理 2 h, 使气孔开度最小后移至冷光
源下进行如下处理: (ⅰ) 10-9 mol/L CaM; (ⅱ) 1 mmol/L
W7-琼脂糖或 20 mg/mL CaM抗血清. 实验中所用的
各种药剂均由 MES 缓冲液稀释到所需浓度. 在光镜
下记录气孔孔径, 所有的试验结果和标准差均为 4次
实验的平均值(每次实验测定 30个气孔的孔径).
1.5 保卫细胞微丝骨架动态变化的观察
撕取表达 GFP-mTn 的转基因拟南芥叶片的下表
皮, 冷光源照射 2 h后, 将其置于 10-9 mol/L CaM溶
液中并于室内光线下处理, 然后在激光共聚焦显微
镜下观测外源 CaM 处理前及处理过程中保卫细胞微
丝骨架的状态, 记录具有代表性的图片. 每次观测的
细胞至少为 80个.
1.6 保卫细胞内游离 Ca2+浓度([Ca2+]cyt)的测定
Fluo-3 AM(Molecular Probe, 美国)溶于二甲基
亚砜, 使其达到 1 mmol/L. 撕取拟南芥叶片下表皮,
置于 20 mmol/L fluo-3 AM 的MES缓冲液中, 37℃避
光孵育 10 min后在室温条件下避光放置 1 h, 用缓冲
液多次冲洗表皮条, 再用激光共聚焦显微镜扫描, 并
记录荧光变化图像及数据 . 处理方法 : 预扫描 , 待
[Ca2+]cyt 荧光强度稳定时(约 100 s), 用 10-9 mol/L
CaM 处理表皮, 继续记录荧光变化图像及数据. 在






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LaserSharp Processing 软件下处理图像. 激发波长为
488 nm, 发射波长为 535 nm.
2 结果
2.1 CaM在保卫细胞壁存在的鉴定
免疫印迹结果表明叶片细胞壁上存在分子量为
17 kD 的 CaM(图 1); 免疫荧光定位结果表明内源细
胞外 CaM 主要存在于保卫细胞的背壁, 在腹壁有少
量分布. 而在同样条件下, 对照气孔保卫细胞腹壁只
有很弱的自发荧光(图 2). 以上结果表明, 拟南芥保
卫细胞壁中存在内源细胞外 CaM.

图 1 CaM在拟南芥叶片表皮条细胞壁上存在的
免疫印迹鉴定
1示叶片表皮条细胞壁蛋白的免疫印迹; 2示分子量标准蛋白
2.2 W7-琼脂糖和 CaM抗血清对气孔运动的影响
图 3(a)显示不能通过质膜的大分子 CaM 拮抗剂
W7-琼脂糖和 CaM 抗血清都能促进光照诱导的气孔
开放. 经W7-琼脂糖和 CaM抗血清处理 0.5 h时气孔

图 2 CaM在拟南芥保卫细胞壁存在的免疫荧光鉴定
(a) 绿色荧光主要分布在保卫细胞的背壁, 腹壁也有一定量的分布;
(b) 对照, 腹壁有微弱的自发荧光


图 3 W7-琼脂糖和 CaM抗血清对气孔运动的影响
(a) 1 mmol/L W7-琼脂糖或 20 mg/mL CaM抗血清对光照诱导气孔开放
的影响; (b) 1 mmol/L W7-琼脂糖或 20 mg/mL CaM抗血清对黑暗诱导
气孔关闭的影响
孔径分别是对照气孔的 1.4倍和 1.3倍. W7-琼脂糖和
CaM 抗血清也能明显的抑制黑暗诱导的气孔关闭.
处理 1 h时对照的气孔孔径已接近关闭, 而经 W7-琼
脂糖和 CaM 抗血清处理的气孔孔径分别是对照的
1.87倍和 2.15倍(图 3(b)). 这说明内源细胞外CaM具






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LaserSharp Processing 软件下处理图像. 激发波长为
488 nm, 发射波长为 535 nm.
2 结果
2.1 CaM在保卫细胞壁存在的鉴定
免疫印迹结果表明叶片细胞壁上存在分子量为
17 kD 的 CaM(图 1); 免疫荧光定位结果表明内源细
胞外 CaM 主要存在于保卫细胞的背壁, 在腹壁有少
量分布. 而在同样条件下, 对照气孔保卫细胞腹壁只
有很弱的自发荧光(图 2). 以上结果表明, 拟南芥保
卫细胞壁中存在内源细胞外 CaM.

图 1 CaM在拟南芥叶片表皮条细胞壁上存在的
免疫印迹鉴定
1示叶片表皮条细胞壁蛋白的免疫印迹; 2示分子量标准蛋白
2.2 W7-琼脂糖和 CaM抗血清对气孔运动的影响
图 3(a)显示不能通过质膜的大分子 CaM 拮抗剂
W7-琼脂糖和 CaM 抗血清都能促进光照诱导的气孔
开放. 经W7-琼脂糖和 CaM抗血清处理 0.5 h时气孔

图 2 CaM在拟南芥保卫细胞壁存在的免疫荧光鉴定
(a) 绿色荧光主要分布在保卫细胞的背壁, 腹壁也有一定量的分布;
(b) 对照, 腹壁有微弱的自发荧光


图 3 W7-琼脂糖和 CaM抗血清对气孔运动的影响
(a) 1 mmol/L W7-琼脂糖或 20 mg/mL CaM抗血清对光照诱导气孔开放
的影响; (b) 1 mmol/L W7-琼脂糖或 20 mg/mL CaM抗血清对黑暗诱导
气孔关闭的影响
孔径分别是对照气孔的 1.4倍和 1.3倍. W7-琼脂糖和
CaM 抗血清也能明显的抑制黑暗诱导的气孔关闭.
处理 1 h时对照的气孔孔径已接近关闭, 而经 W7-琼
脂糖和 CaM 抗血清处理的气孔孔径分别是对照的
1.87倍和 2.15倍(图 3(b)). 这说明内源细胞外CaM具






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照诱导的气孔开放(图 4(c)), 其有效浓度为 10-8~10-10
mol/L, 其中 10-9mol/L CaM 是处理的最适浓度(图
4(a)). Sun等人[8]的研究结果表明当外源 CaM的浓度
从 10 mg/mL增加到 15 mg/mL时, CaM对白芷悬浮培
养细胞增殖的促进作用已明显下降. 我们的研究表
明与 10-9 mol/L CaM 相比, 10-8 mol/LCaM对气孔关
闭的促进作用已经下降 . 推测其原因可能是外源
CaM 作为多肽信使, 其生理功能可能与其浓度有关,
浓度过高反而会抑制其作用[8,12].
外源 CaM 是如何诱导气孔关闭的呢? 保卫细胞
微丝骨架是否参与了这一过程? 我们利用激光共聚
焦显微技术观察了表达 GFP-mTn 的转基因拟南芥保
卫细胞的微丝骨架, 结果表明外源 CaM 诱导气孔关
闭的过程中, 保卫细胞微丝骨架逐步解聚(图 5), 推
测微丝骨架的解聚可能参与了外源 CaM 诱导的气孔
关闭. 进一步的实验表明微丝骨架解聚剂 CD和微丝
骨架稳定剂phalloidin都能影响外源CaM诱导的气孔
关闭: CD能明显地促进这一过程, 而 phalloidin明显
地抑制这一过程(图 6), 这说明微丝骨架的解聚可以
促进气孔的关闭运动, 外源 CaM 是通过诱导保卫细
胞微丝骨架的解聚而促进气孔关闭的.
有报道指出ABA是通过诱导保卫细胞 Ca2＋浓度
的升高来促进微丝骨架解聚的[22], 在体外 CaM 可以
以依赖 Ca2+的方式促进微丝骨架解聚[23]. Shang 等
人[24]发现细胞外 CaM 能诱导百合花粉细胞[Ca2+]cyt
的升高, 升高的[Ca2+]cyt是细胞外 CaM调控花粉萌发
所必需的. 我们的研究结果表明外源 CaM 能明显的
诱导保卫细胞[Ca2+]cyt 增高(图 7 的中图), 当用 Ca2+
螯合剂 EGTA 将游离 Ca2+螯合掉, 外源 CaM 则不能
引起保卫细胞[Ca2+]cyt 增高(图 7 的下图), 并且外源
CaM诱导的气孔关闭作用被抑制((图 8). 因此我们推
测保卫细胞内[Ca2+]cyt可能是细胞外CaM信号转导中
调控微丝骨架解聚的一个重要的上游组分.
本文的实验结果不仅提出了作为多肽信号的细
胞外 CaM 在诱导气孔关闭运动中的作用和可能的作
用机制, 而且为深入探讨气孔运动的机理以及微丝
骨架的动态变化机制提供了新的重要线索. 但关于
细胞外 CaM 的受体、胞外 CaM与胞内 CaM 以及胞
外 CaM 与其他细胞外信号如 ABA 等的关系、胞外
CaM 诱导微丝骨架解聚的信号转导机制还需进一步
研究.
致谢 感谢河北师范大学分子与细胞生物学系的白
娟教授赠予的小麦 CaM 全蛋白的抗血清和纯化的菜
花 CaM; 感谢中国农业大学生物学院袁明教授赠予
的转 GFP-mTn融合基因的拟南芥植株.
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