全 文 ：第４３卷　第１０期
２０１５年１０月
西北农林科技大学学报（自然科学版）
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ　Ａ＆Ｆ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔ．Ｓｃｉ．Ｅｄ．）
Ｖｏｌ．４３ Ｎｏ．１０
Ｏｃｔ．２０１５
网络出版时间：２０１５－０９－０９　１５：４１ ＤＯＩ：１０．１３２０７／ｊ．ｃｎｋｉ．ｊｎｗａｆｕ．２０１５．１０．０２１
网络出版地址：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／６１．１３９０．Ｓ．２０１５０９０９．１５４１．０４２．ｈｔｍｌ
ｏｌｅｏｓｉｎ－ＭＴ融合蛋白在拟南芥中的表达及鉴定
　［收稿日期］　２０１４－０３－１１
　［基金项目］　国家高技术研究发展计划（８６３）项目（２０１１ＡＡ１００６０６）；国家自然科学基金项目（３１２０１２３７，３１１０１１７２）；吉林省科技厅中
青年领军人才及优秀创新团队项目（２０１１１８１５）；教育部博士点基金青年教师基金项目（２０１２２２２３１２０００２）；吉林省科技
型中小企业创新基金项目（１３Ｃ２６２１２２０１２２３）
　［作者简介］　官丽莉（１９８２－），女，吉林梅河口人，实验师，主要从事药用植物与生物技术研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｇｕａｎｌ２００４＠１６３．ｃｏｍ
　［通信作者］　姜　潮 （１９５５－），男，加拿大人，博士，研究员，主要从事植物生物反应器研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｃｈａｏｊｉａｎｇ１０＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ
官丽莉ａ，ｂ，陈　昱ａ，ｂ，朱　栋ａ，ｂ，韩怡来ａ，ｂ，
崔　琪ａ，ｂ，李海燕ａ，ｂ，李校堃ａ，姜　潮ａ
（吉林农业大学ａ生物反应器与药物开发教育部工程研究中心，ｂ生命科学学院，吉林 长春１３０１１８）
［摘　要］　 【目的】获得转金属硫蛋白（ＭＴ）基因的拟南芥植株，为利用植物生物反应器规模化生产 ＭＴ奠定基
础。【方法】利用融合ＰＣＲ方法，扩增拟南芥ＭＴ基因与油体蛋白ｏｌｅｏｓｉｎ基因的融合基因，将融合基因克隆至表达
载体ｐＯＰ上，构建重组质粒ｐＯＰ－ｏｌｅｏｓｉｎ－ＭＴ。采用冻融法将质粒ｐＯＰ－ｏｌｅｏｓｉｎ－ＭＴ转入根癌农杆菌ＥＨＡ１０５中，通
过农杆菌介导法转化拟南芥，用ＰＣＲ检测并筛选转基因拟南芥阳性植株，采用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法检测ｏｌｅｏｓｉｎ－ＭＴ融合蛋
白的表达，用邻苯三酚自氧化法和结晶紫法测定融合蛋白的体外抗氧化活性。【结果】成功构建了植物油体特异表达
载体ｐＯＰ－ｏｌｅｏｓｉｎ－ＭＴ，融合蛋白ｏｌｅｏｓｉｎ－ＭＴ在拟南芥种子中成功表达，其分子质量为２６ｋｕ；总蛋白质量浓度达到５０
μｇ／μＬ时，超氧阴离子的清除率最高，为５８．５％；总蛋白质量浓度为１０μｇ／μＬ时，羟自由基清除率可达６９．７％。【结
论】成功获得转ＭＴ基因的拟南芥株系，并证明融合蛋白ｏｌｅｏｓｉｎ－ＭＴ在拟南芥中具有良好的体外抗氧化活性。
［关键词］　金属硫蛋白；拟南芥；油体蛋白；基因表达
［中图分类号］　Ｑ９４３．２ ［文献标志码］　Ａ ［文章编号］　１６７１－９３８７（２０１５）１０－０１５５－０７
Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｏｌｅｏｓｉｎ－ＭＴ
ｆｕｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
ＧＵＡＮ　Ｌｉ－ｌｉ　ａ，ｂ，ＣＨＥＮ　Ｙｕａ，ｂ，ＺＨＵ　Ｄｏｎｇａ，ｂ，ＨＡＮ　Ｙｉ－ｌａｉ　ａ，ｂ，
ＣＵＩ　Ｑｉ　ａ，ｂ，ＬＩ　Ｈａｉ－ｙａｎａ，ｂ，ＬＩ　Ｘｉａｏ－ｋｕｎａ，ＪＩＡＮＧ　Ｃｈａｏａ
（ａＭｉｎｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ　Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ　ａｎｄ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　Ｒｅｓｅａｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ；
ｂ　Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏ　ｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｉｌｉｎ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ，Ｊｉｌｉｎ１３０１１８，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：【Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ】Ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ＭＴｇｅｎｅ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ　ｐｌａｎｔｓ　ｔｏ　ｉｍｐｒｏｖｅ
ｔｈｅ　ｐｌａｎｔ　ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　ｒｅｄｕｃｅ　ｔｈｅ　ｃｏｓｔ　ｏｆ　ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ．
【Ｍｅｔｈｏｄ】Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂｉｏｌｏｇｙ　ｍｅｔｈｏｄ（ＰＣＲ）ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ａｍｐｌｉｆｙ　ＭＴａｎｄ　ｏｌｅｏｓｉｎｆｕｓｉｏｎ　ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｎ，ｏｌｅｏ－
ｓｉｎ－ＭＴｇｅｎｅ　ｗａｓ　ｃｌｏｎｅｄ　ｉｎｔｏ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ｐＯＰ　ｔｏ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｐＯＰ－ｏｌｅｏｓｉｎ－ＭＴ
ａｎｄ　ｔｈｅ　ｆｒｅｅｚｅ－ｔｈａｗ　ｍｅｔｈｏｄ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｐＯＰ－ｏｌｅｏｓｉｎ－ＭＴ　ｉｎｔｏ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ
ＥＨＡ１０５．Ｉｔ　ｗａｓ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　ｉｎｔｏ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｂｙ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ．Ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｐｌａｎｔｓ　ｗｅｒｅ
ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｂｙ　ＰＣＲ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ａｎｄ　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ．Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ＭＴ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｗａｓ　ａｌｓｏ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ
ｂｙ　ｐｙｒｏｇａｌｏｌ　ａｕｔｏｘｉｄａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　ａｎｄ　ｃｒｙｓｔａｌ　ｖｉｏｌｅｔ　ｍｅｔｈｏｄ．【Ｒｅｓｕｌｔ】Ｐｌａｎｔ　ｂｉｎａｒｙ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ｐＯＰ－
Ｏｌｅｏｓｉｎ－ＭＴ　ｗａｓ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｙ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ．ＳＤＳ－ＰＡＧＥ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｆｕｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　Ａｒａｂｉ－
ｄｏｐｓｉｓ　ｓｅｅｄｓ　ｗｉｔｈ　ａ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｗｅｉｇｈｔ　ｏｆ　２６ｋｕ．Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ａｓｓａｙ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｓｕｐｅｒｏｘ－
ｉｄｅ　ａｎｉｏｎ　ｆｒｅｅ　ｒａｄｉｃａｌ　ｃｌｅａｒａｎｃｅ　ｒａｔｅ　ｗａｓ　ｔｈｅ　ｈｉｇｈｅｓｔ　ｏｆ　５８．５％ ｗｈｅｎ　ＭＴ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｗａｓ　５０
μｇ／μＬ．Ｔｏｔａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｗａｓ　１０μｇ／μＬ　ａｎｄ　ｈｙｄｒｏｘｙｌ　ｒａｄｉｃａｌ　ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ　ｒａｔｅ　ｗａｓ　６９．７％，ｉｎｄｉｃａ－
ｔｉｎｇ　ｔｈａｔ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｈａｄ　ｈｉｇｈ　ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ　ａｃｔｉｖｉｔｙ．【Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ】Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｌｉｎｅｓ　ｗｉｔｈ　ＭＴ
ｇｅｎｅ　ｗｅｒｅ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｙ　ｏｂｔａｉｎｅｄ，ａｎｄ　ｉｔ　ｗａｓ　ｐｒｏｖｅｄ　ｔｈａｔ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｈａｄ　ｇｏｏｄ　ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ　ａｃｔｉｖｉｔｙ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ＭＴ　ｐｒｏｔｅｉｎ；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ；ｏｌｅｏｓｉｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ；ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
　　金属硫蛋白（Ｍｅｔａｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ，ＭＴ）是一类低分
子质量（６～７ｋｕ）、富含半胱氨酸、可与大量金属离
子（如Ｚｎ２＋、Ｃｄ２＋和 Ｃｕ２＋）相结合的独特蛋白质或
活性肽，是机体内惟一一种在金属代谢中起重要调
节作用的小分子蛋白［１］。１９５７年，富含Ｃｄ的金属
蛋白首次在马肾脏细胞中被发现［２］。对金属硫蛋白
进行提纯，发现其含有大量的半胱氨酸残基和金属，
并因此将其命名为“Ｍｅｔａｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ”［３］。研究证
实，植物 ＭＴ的高巯基含量使其在空气中极不稳
定，导致分离困难，目前仅在小麦Ｅｃ蛋白［４］和拟南
芥 ＭＴ１、ＭＴ２和 ＭＴ３［５］中分离纯化获得，ＭＴ基因
的表达可增强植物在重金属胁迫过程中的抗逆作
用，对组织细胞损伤修复具有显著功效［６－１０］。同时
研究还发现，ＭＴ２可与金属结合，具有清除自由基、
防辐射、加速皮肤炎症修复和延缓衰老等功效［１１－１２］。
近年来，随着植物基因工程技术的不断发展，植
物表达系统日益受到重视，其中植物油体表达系统
已成为现阶段植物生物反应器研究的热点之一，已
有多种蛋白或多肽在植物中成功表达，但有关 ＭＴ
在植物油体中的表达研究尚未见报道。本研究通过
构建 ＭＴ油体特异性表达载体，转化拟南芥获得转
基因阳性植株，并对 ＭＴ蛋白的体外抗氧化活性进
行测定，旨在为研究 ＭＴ蛋白功能及其在化妆品、
药物开发中的应用提供理论参考。
１　材料与方法
１．１　材　料
１．１．１　植物材料　哥伦比亚生态型拟南芥（Ａｒａｂｉ－
ｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ　ｅｃｏｔｙｐｅ　Ｃｏｌｕｍｂｉａ）种子，由吉林农
业大学生物反应器与教育部工程研究中心保存。
１．１．２　质粒与菌株　农杆菌菌株ＥＨＡ１０５、植物表
达载体ｐＯＰ（以ｐＣＡＭＢＩＡ１３９０载体骨架为蓝图进
行改造后获得）、ｐＵＣ１９－ｏｌｅｏｓｉｎ、大肠杆菌菌株
ＤＨ５α，均由吉林农业大学生物反应器与药物开发教
育部工程研究中心构建及保存；ｐＥＡＳＹ－Ｂｌｕｎｔ　Ｃｌｏ－
ｎｉｎｇ　Ｋｉｔ，购自北京全式金生物技术有限公司。
１．１．３　试　剂　限制性内切酶、Ｐｆｕ　ＤＮＡ 聚合
酶、ＤＮＡ 分子质量标准 Ｍａｒｋｅｒ（ＤＬ２０００）、ＤＮＡ
Ｆｒａｇｍｅｎｔ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　Ｖｅｒ．２．０试剂盒、ＤＮＡ小
量提取试剂盒、Ａｇａｒｏｓｅ　Ｇｅｌ　ＤＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ
试剂盒、Ｍｉｎｉ　ＢＥＳＴ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　Ｖｅｒ．
２．０试剂盒及ＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　Ｖｅｒ．２等，均购自
大连宝生物工程有限公司。其他常规试剂均为国产
或进口分析纯试剂。
１．２　方　法
１．２．１　引物设计　根据 ＧｅｎＢａｎｋ上的拟南芥
ＭＴ２基因和ｏｌｅｏｓｉｎ基因碱基序列，利用 Ｐｒｉｍｅｒ
Ｐｒｉｍｉｅｒ　５．０引物设计软件，分别设计ＭＴ（Ｍ１／Ｍ２）
和ｏｌｅｏｓｉｎ（Ｙ１／Ｙ２）特异性引物，引物合成及测序均
由金唯智生物科技（北京）有限公司完成。所设计的
引物及序列如下。
Ｍ１：５′－ＡＴＧＴＣＴＴＧＣＴＧＴＧＧＴＧＧＡＡＧＣＴＧ－
３′；
Ｍ２：５′－Ｃ　ＡＡＧＣＴＴＡＴＴＴＧＣＡＧＧＴＧＣＡＧＧＴ－
ＧＣＡＡＧＧＧＴＴ－３′。下划线部分为 ＨｉｎｄⅢ的酶切
位点和保护碱基。
Ｙ１：５′－ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＣＧＧＡＴＡＣＡＧＣＴＡＧ－
ＡＧＧＡＡＣＣＣＡＴ－３′，下划线部分为ＮｃｏⅠ的酶切位
点和保护碱基；
Ｙ２：５′－ＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＴＧＧＣＡＡＡＧＣＴＧＧＣ－
ＡＴＡＧＴＡＧＴＧＴＧＣＴＧＧＣＣＡＣＣＡＣＧ－３′。
１．２．２　ＭＴ 及ｏｌｅｏｓｉｎ基因的ＰＣＲ扩增　从拟南
芥叶片中提取ＲＮＡ，反转录为ｃＤＮＡ，以此为模板，
利用ＭＴ 基因特异性引物进行 ＰＣＲ扩增，５０μＬ
ＰＣＲ反应体系如下：１０×Ｐｆｕ　Ｂｕｆｆｅｒ（含 ＭｇＳＯ４）５
μＬ，５′端引物 Ｍ１（１０μｍｏｌ／Ｌ）１μＬ，３′端引物 Ｍ２
（１０μｍｏｌ／Ｌ）１μＬ，模板１μＬ（５００ｎｇ／μＬ），Ｐｆｕ
ＤＮＡ聚合酶１μＬ，ｄＮＴＰ（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）４μＬ，去离
子水３７μＬ。ＰＣＲ反应程序为：９５℃变性４ｍｉｎ；９５
℃变性３０ｓ，５６℃退火１ｍｉｎ，７２℃延伸２ｍｉｎ，３１
个循环；７２ ℃ 延伸 １０ ｍｉｎ，４ ℃ 终止反应。以
ｐＵＣ１９－ｏｌｅｏｓｉｎ质粒为模板，Ｙ１、Ｙ２ 为引物，利用
ＰＣＲ扩增得到目的基因ｏｌｅｏｓｉｎ，体系及反应程序同
上。ＰＣＲ产物在１％琼脂糖凝胶中电泳，检测并回
收目的片段，于－２０℃保存。
１．２．３　ｏｌｅｏｓｉｎ－ＭＴ 基因的ＰＣＲ扩增　以ＰＣＲ扩
６５１ 西北农林科技大学学报（自然科学版） 第４３卷
增得到的ｏｌｅｏｓｉｎ片段和ＭＴ 片段为模板，Ｙ１和Ｍ２
分别为上、下游引物，扩增得到ｏｌｅｏｓｉｎ－ＭＴ 融合基
因片段，反应体系及程序同１．２．２节。ＰＣＲ产物在
１％琼脂糖凝胶中电泳，检测并回收目的片段，于
－２０℃保存。
将融合目的基因片段ｏｌｅｏｓｉｎ－ＭＴ 与ｐＥＡＳＹ－
Ｂｌｕｎｔ克隆载体连接、转化大肠杆菌ＤＨ５α，阳性克
隆经ＰＣＲ鉴定和酶切鉴定后，将阳性克隆摇菌保种
命名为ｐＥＡＳＹ－ｏｌｅｏｓｉｎ－ＭＴ，送测序公司进行分析。
１．２．４　含ｏｌｅｏｓｉｎ－ＭＴ 植物表达载体的构建　Ｎｃｏ
Ⅰ和 ＨｉｎｄⅢ双酶切测序正确的ｐＥＡＳＹ－ｏｌｅｏｓｉｎ－
ＭＴ重组子经１％琼脂糖凝胶电泳后，割胶回收目
的片段。利用ＳｏｌｕｔｉｏｎⅠ连接酶将目的基因与酶切
回收的ｐＯＰ 植物表达载体连接，转化大肠杆菌
ＤＨ５α，阳性克隆经ＰＣＲ鉴定和酶切鉴定后获得重
组ｐＯＰ－ｏｌｅｏｓｉｎ－ＭＴ质粒，利用冻融法将测序正确
的ｐＯＰ－ｏｌｅｏｓｉｎ－ＭＴ转化农杆菌 ＥＨＡ１０５，获得用
于侵染用的工程菌株。
１．２．５　ｏｌｅｏｓｉｎ－ＭＴ 基因转化拟南芥　侵染前１ｄ
给予待侵染拟南芥充足的水分，转化前剪掉种荚、开
花和露白的花芽。将农杆菌工程菌株接种于 ＹＥＰ
液体培养基（５０μｇ／ｍＬ　Ｋａｎ、１００μｇ／ｍＬ　Ｒｉｆ）中，２８
℃、１８０ｒ／ｍｉｎ进行过夜培养。将菌液转移至离心管
中，４℃、４　０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ收集菌体，用Ｆｌｏ－
ｒａｌ－Ｄｉｐ　Ｂｕｆｆｅｒ重悬菌体。将拟南芥全部浸入重悬
的农杆菌菌液中，静置７ｍｉｎ，放平转化后的营养钵，
用保鲜膜包裹保湿过夜，第２天可稍露一小缝，第３
天正常放置。待种子成熟后收获种子，即为Ｔ０ 代。
１．２．６　拟南芥阳性植株的筛选　将收获得到的拟
南芥Ｔ０ 代种子进行播种，待拟南芥幼苗长出４～６
片叶时，用体积分数１％ Ｂａｓｔａ喷洒幼苗，每隔１ｄ
１次，共３次。此时依然能够生长的幼苗即为阳性
苗。将生长状况良好的阳性拟南芥幼苗进行移栽，
每盆５株，２个月后可收获 Ｔ１ 代种子。对收获的
Ｔ１ 代种子进行播种和筛选，方法同Ｔ０ 代；２个月后
可收获Ｔ２ 代种子，对Ｔ２ 代种子进行后续的外源蛋
白检测。
１．２．７　转基因拟南芥外源蛋白表达的检测　取４０
粒Ｔ２ 代拟南芥种子，放到特制的拟南芥研磨专用
ＥＰ管中，将３０μＬ　５０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ＝８．０）
加入ＥＰ管内，用小研棒充分研磨，研磨后用４℃、
１２　０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，离心后液体分３层：表层
白色油膜层、中间层油液体和底层沉淀。弃沉淀，将
上２层液体混匀后即为油体蛋白提取液。取３０μＬ
油体蛋白样品和６μＬ　５×Ｌｏａｄｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ，混合均匀
后，沸水中煮１０ｍｉｎ，取１０μＬ进行上样，用１２％
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ鉴定。
１．２．８　ＭＴ蛋白抗氧化活性的测定　（１）超氧阴离
子（Ｏ－·２ ）清除能力［１３－１６］。按照１．２．７节方法提取野
生型及转ＭＴ基因拟南芥种子油体蛋白，采用邻苯
三酚自氧化法，向试管中滴加浓度为５０ｍｍｏｌ／Ｌ的
三羟基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液（ｐＨ　８．２）４．５
ｍＬ，加去离子水４．２ｍＬ，混合均匀后在２５℃水浴
锅中水浴２０ｍｉｎ，然后添加０．３ｍＬ邻苯三酚溶液，
立即摇匀，反应４ｍｉｎ后滴加０．３ｍＬ　６ｍｏｌ／Ｌ的盐
酸终止反应，３２５ｎｍ 处测定吸光度 ＯＤ３２５，记为
ΔＯＤ０，并以邻苯三酚溶液作为空白对照；再滴加不
同浓度的野生型及转 ＭＴ 基因拟南芥种子油体蛋
白溶 液，使 待 测 液 终 质 量 浓 度 分 别 为１０～５０
μｇ／μＬ，在３２５ｎｍ波长处测定转基因拟南芥中的
ＭＴ蛋白吸收值，４ｍｉｎ内每隔３０ｓ读数１次，记为
ΔＯＤ。按下式计算不同质量浓度待测物对超氧阴
离子（Ｏ－·２ ）的清除率：
清除率＝（ΔＯＤ０－ΔＯＤ）／ΔＯＤ０×１００％。
（２）羟自由基（·ＯＨ）清除能力。用结晶紫
法［１７］，将野生型及转ＭＴ基因拟南芥油体蛋白溶液
定容为总蛋白质量浓度为０．２ｍｇ／ｍＬ。在１０ｍＬ
比色皿中分别加入０．３ｍＬ结晶紫（０．４ｍｍｏｌ／Ｌ）溶
液、１．２ｍＬ　ＦｅＳＯ４（１ｍｍｏｌ／Ｌ）溶液、０．６ｍＬ　Ｈ２Ｏ２
（２．０ｍｍｏｌ／Ｌ）溶液，用磷酸氢二钠－柠檬酸溶液（ｐＨ
４．０）定容至１０ｍＬ，摇匀，放置３０ｍｉｎ，测５８０ｎｍ处
的吸光值ＯＤｂ，将不加Ｈ２Ｏ２ 时５８０ｎｍ处的吸光值
计为 ＯＤ０，则羟自由基的产生量可以用 ΔＯＤ＝
ＯＤ０－ＯＤｂ 来表征。
上述体系在加入 Ｈ２Ｏ２ 之前，加入０．０５，０．１０，
０．１５，０．２０，０．２５，０．３０，０．３５，０．４０，０．４５，０．５０ｍＬ
的转ＭＴ基因及野生型拟南芥种子油体蛋白溶液，
测定吸光度ＯＤａ，计算表观抗羟自由基氧化率（Ｓ），
即：
Ｓ＝（ＯＤａ－ＯＤｂ）／（ＯＤ０－ＯＤｂ）×１００％。
２　结果与分析
２．１　ＭＴ基因的克隆
以拟南芥叶片ＲＮＡ反转录的ｃＤＮＡ为模板，
利用 Ｍ１和 Ｍ２特异性引物进行ＰＣＲ扩增，结果
（图１）显示，在２３８ｂｐ左右位置扩增出目的片段，经
ＤＮＡ测序分析，同源性为１００％，说明成功从拟南
芥中克隆出ＭＴ基因。
７５１第１０期 官丽莉，等：ｏｌｅｏｓｉｎ－ＭＴ融合蛋白在拟南芥中的表达及鉴定
图１　ＭＴ基因的ＰＣＲ扩增
Ｍ．ＤＬ２０００ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ；１．阴性对照；２．ＭＴ基因
Ｆｉｇ．１　ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＭＴｇｅｎｅ
Ｍ．ＤＬ２０００ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ；１．Ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ；２．ＭＴｇｅｎｅ
２．２　ｏｌｅｏｓｉｎ－ＭＴ 融合基因的克隆及验证
以ｐＵＣ１９－ｏｌｅｏｓｉｎ质粒为模板，Ｙ１、Ｙ２为引物，
通过ＰＣＲ扩增目的基因ｏｌｅｏｓｉｎ，ＰＣＲ扩增结果（图
２）显示，在约７６２ｂｐ处扩增出目的片段；以ＭＴ 和
ｏｌｅｏｓｉｎ２个目的基因为模板，Ｙ１、Ｍ２为引物，通过
ＰＣＲ扩增得取融合基因ｏｌｅｏｓｉｎ－ＭＴ，结果（图３）显
示，在１　０００ｂｐ左右位置扩增出目的片段。将融合
目的基因片段ｏｌｅｏｓｉｎ－ＭＴ 与ｐＥＡＳＹ－Ｂｌｕｎｔ克隆载
体连接、转化后，构建ｐＥＡＳＹ－ｏｌｅｏｓｉｎ－ＭＴ。对含有
融合基因的大肠杆菌菌液进行摇菌及ＰＣＲ验证，然
后用试剂盒提取ｐＥＡＳＹ－ｏｌｅｏｓｉｎ－ＭＴ质粒，进行质
粒的ＮｃｏⅠ和 ＨｉｎｄⅢ双酶切鉴定，结果如图４，５
所示。由图４，５可知，ＰＣＲ和酶切鉴定均释放出
１　０００ｂｐ左右的目的条带。送至测序公司进行分
析，结果正确，表明融合基因已融合成功。
２．３　植物表达载体ｐＯＰ－ｏｌｅｏｓｉｎ－ＭＴ的构建
将融合后的ｏｌｅｏｓｉｎ－ＭＴ 基因与植物表达载体
过夜连接，转入到农杆菌ＥＨＡ１０５感受态细胞中。
将含有ｐＯＰ－ｏｌｅｏｓｉｎ－ＭＴ重组质粒的菌液过夜摇床
培养，对培养好的农杆菌菌液进行ＰＣＲ鉴定，结果
（图６）显示，在１　０００ｂｐ处出现目的条带，表明融合
基因已成功插入到ｐＯＰ载体中，植物表达载体构建
成功。
图２　ｏｌｅｏｓｉｎ基因的ＰＣＲ扩增
Ｍ．ＤＬ２０００ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ；１．阴性对照；２．ｏｌｅｏｓｉｎ基因
Ｆｉｇ．２　ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｏｌｅｏｓｉｎｇｅｎｅ
Ｍ．ＤＬ２０００ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ；１．Ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ；２．ｏｌｅｏｓｉｎｇｅｎｅ
图３　ｏｌｅｏｓｉｎ－ＭＴ 基因的ＰＣＲ扩增
Ｍ．ＤＬ２０００ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ；１．阴性对照；２．ｏｌｅｏｓｉｎ－ＭＴ 基因
Ｆｉｇ．３　ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｏｌｅｏｓｉｎ－ＭＴｇｅｎｅ
Ｍ．ＤＬ２０００ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ；１．Ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ；
２．ｏｌｅｏｓｉｎ－ＭＴｇｅｎｅ
图４　ｐＥＡＳＹ－ｏｌｅｏｓｉｎ－ＭＴ菌液的ＰＣＲ鉴定
Ｍ．ＤＬ２０００ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ；１．ｏｌｅｏｓｉｎ－ＭＴ 基因；２．阳性对照
Ｆｉｇ．４　ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐＥＡＳＹ－ｏｌｅｏｓｉｎ－ＭＴ
Ｍ．ＤＬ２０００ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ；１．ｏｌｅｏｓｉｎ－ＭＴｇｅｎｅ；
２．Ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ
图５　ｐＥＡＳＹ－ｏｌｅｏｓｉｎ－ＭＴ的双酶切鉴定
Ｍ．ＤＬ２０００ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ；１～３．质粒酶切
Ｆｉｇ．５　Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ
ｐＥＡＳＹ－ｏｌｅｏｓｉｎ－ＭＴ
Ｍ．ＤＬ２０００ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ；１－３．Ｐｌａｓｍｉｄ　ｄｉｇｅｓｔ
８５１ 西北农林科技大学学报（自然科学版） 第４３卷
图６　ｐＯＰ－ｏｌｅｏｓｉｎ－ＭＴ菌液的ＰＣＲ鉴定
Ｍ．ＤＬ２０００ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ；１．阴性对照２．ｏｌｅｏｓｉｎ－ＭＴ 基因
Ｆｉｇ．６　ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｌａｓｍｉｄｓ　ｐＯＰ－ｏｌｅｏｓｉｎ－ＭＴ
Ｍ．ＤＬ２０００ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ；１．Ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ；２．ｏｌｅｏｓｉｎ－ＭＴｇｅｎｅ
图７　转基因拟南芥植株种子目标
蛋白的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳
Ｍ．蛋白 Ｍａｒｋｅｒ；１．非转基因植株；２～５．转基因植株
Ｆｉｇ．７　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｐｌａｎｔ　ｓｅｅｄｓ
Ｍ．Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｍａｒｋｅｒ；１．Ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ　ｐｌａｎｔ；２－５．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｐｌａｎｔｓ
２．４　转基因拟南芥目标蛋白的表达
经过Ｂａｓｔａ抗性筛选，初步筛选出１７株拟南芥
抗性植株。分别提取４株阳性拟南芥Ｔ２ 代种子的
油体蛋白，以野生型拟南芥种子的油体蛋白作阴性
对照，进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。由图７可见，转基因
植株ｏｌｅｏｓｉｎ－ＭＴ　２～５号在２６ｋｕ处都有条带，初步
证明ｏｌｅｏｓｉｎ－ＭＴ 基因已在拟南芥Ｔ２ 代种子中得到
表达。
２．５　ＭＴ蛋白的抗氧化活性检测
２．５．１　超氧阴离子清除能力　邻苯三酚吸光度值
的测定结果见表１。
表１　邻苯三酚自氧化速率及其吸光值的变化
Ｔａｂｌｅ　１　Ｃｈａｎｇｅｓ　ｏｆ　ａｕｔｏｘｉｄａｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ａｎｄ　ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ　ｖａｌｕｅ　ｏｆ　ｐｙｒｏｇａｌｏｌ
项目
Ｉｔｅｍ
时间／ｓ　Ｔｉｍｅ
０　 ３０　 ６０　 ９０　 １２０　 １５０　 １８０　 ２１０　 ２４０
ΔＯＤ　 ０．１２１　 ０．２１９　 ０．２８６　 ０．３５６　 ０．４２２　 ０．４８６　 ０．５４６　 ０．６０４　 ０．６５８
　　经计算可以得出邻苯三酚自氧化速率ΔＡ１＝
２．８８×１０－４，计算金属硫蛋白对超氧阴离子（Ｏ－·２ ）清
除率，结果如图８所示。由图８可知，转基因拟南芥
中金属硫蛋白对超氧阴离子（Ｏ－·２ ）自由基的清除率
较高，当转ＭＴ基因拟南芥的总蛋白质量浓度为５０
μｇ／μＬ时，超氧阴离子的清除率达到最高，为
５８．５％；而野生型拟南芥中，虽然自身含有少量的金
属硫蛋白，但是对超氧阴离子自由基的清除效果较
差，这可能是野生型拟南芥中金属硫蛋白基因并未
表达所致。随着质量浓度的升高，野生型拟南芥对
超氧阴离子的的清除率变化不明显，且均不足
２０％。而在拟南芥外源表达的金属硫蛋白具有较强
的超氧阴离子清除活性，随着质量浓度的增加，其对
超氧阴离子的清除率也随之升高。
图８　转基因拟南芥植株中 ＭＴ蛋白的
超氧阴离子清除活性
Ｆｉｇ．８　Ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ＭＴ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｆｒｏｍ　ｔｒａｎｓｇｅｎｅｔｉｃ
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｏｎ　ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ　ａｎｉｏｎ　ｆｒｅｅ　ｒａｄｉｃａｌ
图９　转基因拟南芥植株中 ＭＴ蛋白
对羟自由基的清除能力
Ｆｉｇ．９　Ｈｙｄｒｏｘｙｌ　ｒａｄｉｃａｌ　ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ＭＴ
ｐｒｏｔｅｉｎ　ｆｒｏｍ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
９５１第１０期 官丽莉，等：ｏｌｅｏｓｉｎ－ＭＴ融合蛋白在拟南芥中的表达及鉴定
２．５．２　羟自由基清除能力　以野生型拟南芥作为
对照，考察金属硫蛋白清除羟自由基（·ＯＨ）的能
力。由图９可以看出，随金属硫蛋白质量浓度的升
高，转ＭＴ基因拟南芥的油体蛋白对·ＯＨ 的清除
能力亦逐渐增强。当金属硫蛋白的质量浓度增加至
１０μｇ／μＬ时，清除率可达到６９．７％。而在野生型拟
南芥中，金属硫蛋白对羟自由基仅有微弱的清除能
力，且随着金属硫蛋白质量浓度的升高，清除率变化
并不明显。
３　结论与讨论
金属硫蛋白含有丰富的半胱氨酸残基，能通过
半胱氨酸 （Ｃｙｓ）上的巯基 （－ＳＨ）与金属离子结
合，具有解除金属离子毒害以及调节体内金属离子
平衡的作用［１７－１８］。目前，对植物金属硫蛋白功能的
研究正在逐步深入。金属硫蛋白基因中丰富的巯基
及其与重金属的结合能力，决定了其功能的多样
性［１９］。Ｘｕｅ等［２０］在筛选棉花（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ　ｈｉｒｓｕ－
ｔｕｍ）ｃＤＮＡ文库时发现，ＭＴ基因ＧｈＭＴ３ａ能在氧
化胁迫的逆境条件下上调表达；但当有外源抗氧化
物质存在时，ＧｈＭＴ３ａ在逆境条件下的上调表达会
受到抑制，暗示ＧｈＭＴ３ａ可能具有抗氧化功能。植
物金属硫蛋白所具有的抗氧化活性受到广泛关注，
预示在植物中可能存在另一种新型高效的抗氧化系
统，且其在植物中发挥着重要作用。
吉林农业大学生物反应器与药物开发教育部工
程研究中心保存的ｐＯＰ质粒（含有Ｂａｓｔａ筛选标记
基因）是植物油体蛋白特异性表达载体，该载体加入
了特异性的菜豆启动子和终止子、３５Ｓ启动子、ｏｌｅｏ－
ｓｉｎ基因、Ｂａｒ基因等作用原件。首先，利用此载体
将ｏｌｅｏｓｉｎ基因编码的终止子 ＴＡＡ密码子修饰去
除，使得油体蛋白与目的蛋白更易于融合表达；然
后，选用菜豆特异性启动子和终止子（ｐｈａＰ、ｐｈａＴ），
使转基因种子中的目的基因可以更好地特异性表
达；最后，添加Ｂａｒ基因的３５Ｓ启动子和ＮＯＳ　ｐｏｌｙ
Ａ终止子，以Ｂａｒ基因作为抗性筛选标记，便于转
基因植株的筛选，为后续转基因植株的培育提供了
便利条件。
　　目前，商品化的 ＭＴｓ大多从兔肝中诱导提取，
其生产成本高、价格昂贵，寻找廉价且含有丰富
ＭＴｓ的新资源是降低生产成本及扩大其应用领域
的重要途径。本研究对转 ＭＴ 基因拟南芥种子与
野生型拟南芥种子的总蛋白进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，
初步证实融合蛋白ｏｌｅｏｓｉｎ－ＭＴ在拟南芥种子中有
表达。野生型拟南芥中金属硫蛋白对超氧自由基虽
然有微弱的清除能力，但是随着蛋白质量浓度的升
高，清除率变化不明显，且均小于２０％，而转ＭＴ基
因拟南芥总蛋白质量浓度达到５０μｇ／μＬ时，超氧阴
离子的清除率达到最高，为５８．５％。转ＭＴ基因拟
南芥总蛋白质量浓度增加至１０μｇ／μＬ时，羟自由基
清除率可达６９．７％，表明转ＭＴ基因拟南芥具有较
高的抗氧化活性。研究拟南芥种子中表达的金属硫
蛋白的生物学活性，为下一步将融合基因导入红花
油体系统表达奠定了理论基础。
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
３３９－３４９．
（上接第１５４页）
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