全 文 ：481 植物生理与分子生物学学报, Journal of Plant Physiology and Molecular Biology 2006, 32 (4): 481-489
2006-04-04收到，2006-06-09接受。
国家重大研究计划项目(No. 90208004)，国家自然科学基金面上项目
(No. 30470889)和河北省自然科学基金项目(No. C2004000152)资助。
*通讯作者(E-mail: cuisujuan@263.net; Tel: 0311-86269144)。
外源钙调素与拟南芥悬浮培养细胞结合位点的观测及其胞外效应
崔素娟*, 常芳, 高英杰, 王媛媛, 孙大业
河北师范大学分子细胞生物学实验室，石家庄 050016
摘要：以拟南芥悬浮培养细胞为实验体系，借助外源荧
光及同位素标记钙调素，研究结果表明外源钙调素不能
被主动内吞入细胞内，而是主要以完整分子形式结合在
细胞外表面；外源纯化钙调素可促进正向型质膜囊泡中
的鸟苷酸三磷酸水解酶活性升高，也可引起拟南芥悬浮
细胞质游离钙离子浓度的特异升高，表明外源钙调素可
能通过细胞表面位点跨膜信号转换为细胞内信号，从而
调节生物学活性。
关键词：细胞外钙调素；拟南芥；悬浮细胞；细胞质钙
信号；GTP酶活性
中图分类号：Q945
近20多年的研究结果表明，植物细胞与动物细
胞一样可以利用多肽信使(或多肽激素)。目前，已
得到广泛认可的植物细胞外多肽激素有Systemin、
CLV3、SCR、PSK等(马力耕和孙大业2000;
Yoshikatsu 2003)。细胞外多肽信使及其信号转导机
制的研究已成为当前植物生物学领域研究的重要方
向。除了上述的多肽信使，还有许多正在研究之
中、尚未完全确证的细胞外多肽信使，我们将其称
为多肽信号，细胞外钙调素(extracellular calmodulin,
Ecto CaM)(孙大业和马力耕2001)就是其中之一。
钙调素是真核生物中普遍存在的保守且具高度
特异性的钙结合蛋白。研究结果表明，钙调素不仅
存在于细胞内，还广泛存在于多种植物细胞外，具
有多种重要的生理学功能(Biro等1984; 孙大业和马力
耕2001)，如：促进白芷等悬浮细胞增殖(李红兵等
1992; Cui等2005)，启动百合等花粉萌发及促进花
粉管伸长(Ma和Sun 1997; 崔素娟等1998)，调节细
胞特异基因表达(Zhu等1998; Zhou等2001)，调节
气孔开闭(Chen等2003, 2004)等。以百合花粉为实
验体系，药理学实验研究表明细胞外钙调素可能通
过异三聚体G蛋白跨膜信号转导(Ma等1999); 可引起
百合花粉及花粉管细胞内[Ca2+]i的变化(Shang等
2005)。最近，我们又用放射性同位素35S标记重组
拟南芥钙调素亚型2 (35S-ACaM2)，结合特性分析及
化学交联实验表明拟南芥悬浮细胞质膜外侧可能存在
具有蛋白质性质的受体样结合位点(Cui等2005)。鉴
于钙调素所具有的细胞外存在的广谱性及多功能性，
并且可通过跨质膜信号转导机制起作用，推测它可
能是植物细胞又一重要的多肽信使(孙大业和马力耕
2001)。
本文进一步采用荧光及35S标记拟南芥钙调素亚
型2 (FITC-ACaM2, 35S-ACaM2)，研究结果直观地
表明外源钙调素可能主要以完整分子形式与拟南芥悬
浮细胞外位点结合，引起拟南芥悬浮细胞内鸟苷酸
三磷酸水解酶(GTPase)活性及细胞质钙信号([Ca2+]cyt)
的变化。
1　材料与方法
1.1　材料及试剂
野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana) Col的种子
与大肠杆菌E. coli BL21 (DE3)为本室保存；拟南芥
钙调素亚型2 (ACaM2)表达质粒pET5a-ACaM2由美
国Zielinski实验室惠赠；转水母发光蛋白基因
(aequorin, aeq)的拟南芥种子由英国Knight实验室惠
赠；离析酶、纤维素酶为日本Yakult. Co. 产品；
异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)和
FM1-43为Molecular Probes公司产品；其它试剂为
Sigma公司产品或国产分析纯。
1.2　拟南芥愈伤组织诱导、悬浮细胞培养及原生质
体的制备
野生型或经转aeq基因拟南芥种子消毒后，置
于MS固体培养基(含2，4-D 1 mg/mL，6-BA 0.1
mg/mL，3%蔗糖，0.65%琼脂)上25℃暗培养，3~4
周后愈伤组织形成，于新MS培养基上继代，以后
482 32卷 植物生理与分子生物学学报
每隔3周继代一次，约3次后愈伤组织疏松。取黄
豆粒大小的愈伤组织，用镊子轻轻捣碎后，置于20
mL相同成分的MS液体培养基中，25℃下120 r/min
暗振荡培养3~4 d后，先静置0.5 h，倒去上清后，
加新鲜培养基20 mL，如此重复3次后，扩培至3
倍体积，每隔7 d，继代一次，即建成稳定的悬浮
培养细胞。一般可继代培养5次。
选取生长旺盛的愈伤组织1~2 g轻轻压碎，加
入20 mL酶解液(5 mmol/L Mes，0.5 mol/L甘露醇，
1 mmol/L CaCl2，pH 5.6，0.3%离析酶，1%纤维
素酶)，25℃暗处酶解4 h左右，200目筛网过滤将
大块组织去除，所得滤液在20℃ 2 000×g离心10
min，去除上清，加入洗涤缓冲液20 mL，洗涤2次。
1.3　重组ACaM2、35S-ACaM2及FITC-ACaM2的
制备
大肠杆菌重组ACaM2及35S-ACaM2的诱导表达
及制备与检测参照崔素娟等(2002)的方法。
FITC标记ACaM2 (FITC-ACaM2)参照产品说明
改进如下：将终浓度为1 mg/mL ACaM2和1 mg/mL
FITC分别溶于pH 8.5的0.1 mol/L碳酸钠缓冲液中，
缓慢将50 mL FITC加至1 mL ACaM2溶液中，室温
下于暗处振荡孵育2 h。然后经G-25柱除去游离的
FITC。
FITC标记效率按Welsh (1983)方法进行检测；
按Laemmli (1970)方法，进行12% SDS-PAGE不连
续胶电泳，考马斯亮蓝R250 (CB R250)染色前后分
别用凝胶成像系统记录图像；用HITACHI紫外分光
光度计扫描ACaM2标记前后在240~400 nm范围的
吸收曲线。
1.4　FITC-ACaM2与细胞作用位点的共聚焦显微镜
观察
100 nmol/L FITC-ACaM2或亲细胞质膜荧光染
料FM1-43分别和拟南芥悬浮细胞、原生质体孵育，
不同时间取样，将细胞换至50 mmol/L Tris缓冲液
(pH 7.5)中，以增强FITC的荧光。在480 nm激发
波长，510 nm发射波长条件下，共聚焦显微镜下
观察荧光在细胞中的分布。
1.5　不同温度条件下 35S-ACaM2与拟南芥悬浮细胞
的结合
4℃与25℃条件下，总反应体积500 mL，不足
体积用反应缓冲液(5 mmol/L Mes，1 mmol/L CaCl2，
3%蔗糖，pH 5.8)补齐。做以下3组反应，每组3
个平行样。总反应：拟南芥悬浮细胞400 mL (106
个/mL)与10 nmol/L 35S-ACaM2，反应1 h；非特
异反应管：拟南芥悬浮细胞400 mL (106个/mL) 中
加5 mmol/L未标记CaM混匀后，再加35S-ACaM2至
10 nmol/L，反应1 h；可逆反应：拟南芥悬浮细
胞400 mL (106个/mL)中加10 nmol/L 35S-ACaM2，
先反应0.5 h，再加2 mmol/L未标记ACaM2反应0.
5 h。Millipore 12孔真空细胞收集器收集细胞于玻璃
纤维滤膜上，迅速用10 mL反应缓冲液淋洗。滤膜经
80℃烘干0.5 h后，用液闪仪测定cpm。
1.6　35S-ACaM2与拟南芥悬浮细胞结合进程的放射
自显影检测
于1.5 mL EP管中加继代培养5~7 d的拟南芥悬
浮细胞25 mL (密度在105个/mL)，35S-ACaM2终浓
度为10 nmol/L，室温120 r/min振荡培养，分别于
0、30 min、1 h、2 h、4 h、8 h、16 h、24 h
时，加5×SDS-PAGE样品缓冲液6 mL终止反应，
沸水浴3 min电泳制样，按Laemmli (1970)方法，
20% SDS-PAGE不连续胶电泳，制成干胶后，磷屏
曝光12 h，以Typhoon扫描图像。
1.7　正向型质膜囊泡的制备及GTPase活性的测定
正向型质膜囊泡的制备参照Larsson等(1987)方
法。将原生质体、GTP酶活荧光测定所需底物(GTP
100 mmol/L，NADH 10 mmol/L，PK/LDH 210 U，
PEP 1 mmol/L溶于缓冲液pH 7.6 Hepes 30 mmol/L，
EDTA 0.5 mmol/L，EGTA 1 mmol/L，MgCl2 8
mmol/L，KCl 40 mmol/L，0.5% BSA，8%甘油，
巯基乙醇0.7 mmol/L，DTT 2 mmol/L，蔗糖0.25
mol/L)一起超声波处理，30 s×3，间隔1 min，4℃
10 00×g离心30 min；上清于4℃ 100 0×g离心1
h，沉淀为微粒体部分。DT-500及PEG3350二相法
制备质膜囊泡，聚合物浓度为6.1%，KCl为3 mmol/
L，经3管分离的上相U3用样品稀释液(2 mmol/L
Hepes pH 7.6，蔗糖0 25 mol/L，1 mmol/L DTT，
0.2% BSA)稀释5倍体积，4℃ 100 000×g，离心1
h，沉淀即为包裹有GTPase荧光测定底物的正向型
质膜囊泡。
GTPase活性的荧光测定参照Gonzalo等(1995)
方法，将正向型质膜囊泡沉淀用含CaCl2 1 mmol/L
的上述样品稀释液悬浮，置于石英杯中，加处理试
483崔素娟等: 外源钙调素与拟南芥悬浮培养细胞结合位点的观测及其胞外效应4期
剂混匀后，立即用日立FL2500荧光分光光度计
ex340nm，em460nm时间扫描，以荧光猝灭曲线斜
率大小表示GTPase活性大小。
1.8　转基因水母发光蛋白法检测胞质Ca2+信号
150目滤网收集转基因拟南芥悬浮培养细胞，
用新鲜MS洗一次，调细胞密度至0.2 g FW/mL。
按Axel和Christian等(2002)方法进行水母发光蛋白
与其辅基coelenterazine h的体内重组，加辅基至终
浓度为2.5 mmol/L，于25℃、120 r/min暗孵育4 h；
将细胞用含EGTA的缓冲液(Mes 5 mmol/L pH 5.7，
EGTA 1 mmol/L，3%蔗糖)洗涤40 min，然后再用
含钙离子的缓冲液(Mes 5 mmol/L pH 5.7，CaCl2 1
mmol/L，3%蔗糖)洗2次，将细胞密度调至105~106
个/mL。取100 mL细胞于发光测定用玻璃杯中，外
加刺激物体积不超过细胞体积的10%。中科院生物
物理所研制的BPCL型微弱发光测量仪检测水母发光
蛋白发射的光信号。
2　结果
2.1　重组ACaM2、FITC-ACaM2及35S-ACaM2的
特性
首先用Phenyl-Sepharose CL-4B提取纯化了重组
ACaM2，SDS-PAGE显示纯化的ACaM2分子具有
依赖于Ca2+的电泳迁移率变化，且纯度较高(图
1A)。用FITC标记制备重组ACaM2后，经测定标
记效率约为0.7。由于ACaM2的表观分子量约为17
kD，FITC为389 D的小分子，ACaM2在标记前后
分子量变化在SDS-PAGE上很难判断，但FITC-
ACaM2在SDS-PAGE胶上，存在肉眼可分辨的绿
色荧光，此荧光带与考马斯亮蓝(CB R250)染色后的
FITC-ACaM2蛋白条带正好重合(图1A)。在1 mmol/
L Ca2＋或1 mmol/L EGTA存在条件下，FITC-CaM
与未标记的ACaM2的SDS-PAGE电泳迁移变化一
致，即在有钙条件下的泳动较快，而EGTA螯合钙
后电泳迁移率变慢(图1A)。
参照崔素娟等(2002)方法，制备了重组35S-
ACaM2，经SDS-PAGE及放射自显影分析，所制
备的重组35S-ACaM2纯度较高，1 mmol/L Ca2+存在
条件下比1 mmol/L EGTA存在下电泳泳动速率快(图
1A)。
对标记前后的3种ACaM2分别进行240~400 nm
紫外吸收扫描，其主要吸收峰型一致，但吸收强度
有所差异(图1B)，原因是用于扫描的样品浓度不
同。为进一步说明标记对ACaM2高级结构的影响，
分析了标记前后ACaM2激活PDE酶的能力，结果
标记前后的ACaM2激活能力无明显差异(结果未显
示)。上述结果说明标记对ACaM2的结构影响不明
显，可用于后续实验。
2.2　外源FITC-ACaM2与拟南芥悬浮细胞或原生质
体的结合
将FITC-ACaM2分别和拟南芥悬浮细胞和原生
484 32卷 植物生理与分子生物学学报
质体进行孵育，在共聚焦显微镜下进行荧光观察。
100 nmol/L的FITC-ACaM2与悬浮细胞孵育15 min
以上，最长达2 h，于激光共聚焦显微镜下，直接
观察孵育细胞，可见非常强的背景荧光，而形态正
常的细胞内不见荧光(图2I-A、B)。用50 mmol/L的
Tris缓冲液洗去多余的游离FITC-ACaM2后，只在
细胞周边(细胞膜及细胞壁所在区域)有微弱的荧光，
细胞质中仍然检测不到荧光(图2I-C、D)。进一步
将FITC-ACaM2与去除细胞壁的原生质体温育2 h
后，可见微弱荧光间断地存在于细胞质膜上，原生
质体内部则仍观察不到荧光(图2II-A~D)。
为了检测所观察的细胞是否具有正常的内吞活
性，我们还选用了与FITC-ACaM2相同摩尔浓度的
亲细胞质膜荧光染料FM1-43作为细胞内吞活性指示
剂，使其分别与拟南芥悬浮细胞和原生质体孵育，
激光共聚焦显微镜下选择形态特征正常的细胞进行观
察，结果表明细胞质中很快出现带有荧光的大小不
一的囊泡(图2I-E、F，II-E、F)，表明所观察到的
形态正常细胞和原生质体确实具有正常的内吞活性。
2.3　不同温度条件下35S-ACaM2与拟南芥悬浮细胞
的结合
为了进一步说明所观察到的FITC-ACaM2与拟
南芥悬浮培养细胞或原生质体结合现象，排除细胞
无活力的因素影响，一方面用FM1-43检测了室温条
件下，具有内吞活力的细胞占观察细胞总数的
70%~80%；另外，我们又检测了35S-ACaM2与拟
南芥悬浮培养细胞的结合，分别在悬浮细胞生长的
最适温度25 ℃和生长基本停滞的4℃条件下，将35S-
ACaM2与拟南芥悬浮细胞结合温育1 h，经快速洗
涤去除游离的35S-ACaM2后，液闪仪检测结合在细
胞上的35S-ACaM2放射性。结果(图3)表明25℃条
件下，细胞与35S-ACaM2的总结合量大于4℃条件
下的，但25℃条件下细胞与35S-ACaM2的非特异结
合较高，而与细胞特异结合的35S-ACaM2，两个温
度条件下结合值相近，且均可被再加入的200倍于
35S-ACaM2浓度的未标记ACaM2竞争下来，说明特
异结合值一致且具有可逆性，进一步证明结合位点
确实在细胞膜外侧，而非被内吞到细胞内。
2.4　35S-ACaM2与拟南芥悬浮细胞结合的时间进程
在将外源ACaM2添加到拟南芥悬浮培养细胞介
质中后，随时间的延长ACaM2自身是否被降解呢？
为检测ACaM2是否变化，将10 nmol/L 35S-ACaM2
与悬浮细胞温育不同时间后，SDS-PAGE电泳胶经
放射自显影显示，在检测的24 h内35S-ACaM2分子
量相对稳定，未见被明显降解的小分子蛋白条带的
产生(图4)。
2.5　外源纯化ACaM2对拟南芥正向型质膜囊泡内
GTPase活性的影响
以拟南芥愈伤组织为材料制备的原生质体经超
声破碎后，将GTPase活荧光法测定所需的酶联反应
底物包裹在囊泡内，二相法制备正向型质膜囊泡。
在正向型质膜囊泡外加不同的处理试剂，用荧光分
光光度计，以340 nm为激发波长，460 nm为发射
波长，进行时间扫描检测酶联反应底物NADH的荧
光猝灭速率，由于荧光猝灭速率与GTPase活性呈正
相关，荧光猝灭速率以荧光猝灭曲线的斜率代表，
图2　FITC-ACaM2与拟南芥悬浮细胞或原生质体结合的激光共聚焦显微观察
Fig.2　The binding of FITC-ACaM2 to suspension-cultured Arabidop iscell or protoplasts under confocal laser scanning microscope
Bars=5 mm.
485崔素娟等: 外源钙调素与拟南芥悬浮培养细胞结合位点的观测及其胞外效应4期
因此检测的荧光猝灭曲线斜率可表示GTPase活性的
高低(图5)。
将100 nmol/L ACaM2直接加入包被有酶联反应
底物的正向型质膜囊泡的外侧，结果表明反应体系
的荧光强度迅速下降(图5A为其中一次实验的结果，
其中直线斜率代表荧光下降速率)，而外加相同浓度
的牛血清白蛋白(BSA)时荧光强度值不变或反而缓慢
上升(图5B)。综合三次独立实验结果(图5C) 100 nmol/
L ACaM2促进荧光猝灭的速率比同样浓度的BSA要
快6倍，差异极显著。这说明存在于正向型质膜囊
泡外侧的外源纯化A C a M 2可激活囊泡内侧的
GTPase活性。
2.6　外源纯化ACaM2对拟南芥悬浮细胞[Ca2+]cyt的
影响
利用转恒定表达水母发光蛋白基因的拟南芥悬
浮细胞系，用冷光仪首先检测了外加纯化钙调素对
[Ca2+]cyt的影响。细胞质定位的重组水母发光蛋白在
和钙的反应中发射出的光子数和游离钙离子浓度呈正
相关，因此发光强度的变化可以直接地反映出细胞
质游离钙离子浓度的变化(Axel和Christian 2002)。
将100 nmol/L外源纯化重组ACaM2加入拟南芥
悬浮细胞后，延迟20 s，依赖于[Ca2+]cyt的荧光强
度开始缓慢升高，2.5 min升至原来的近2倍，然
后开始缓慢下降；到5 min左右降至最低，但此时
的钙离子水平要稍高于原初胞内的钙离子水平，而
相同浓度的BSA处理未见如此明显变化(图6A)。
图3　不同温度条件下35S-ACaM2与拟南芥悬浮细胞的结合
Fig.3　Binding of 35S-ACaM2 with suspension-cultured
Arabidopsis cell at different temperature
图4　20% SDS-PAGE及放射自显影示35S-ACaM2与拟南芥悬
浮细胞结合进程变化
Fig.4　Radiograph of 35S-ACaM2 during incubation with
suspension-cultured Arabidopsis cell by 20% SDS-PAGE
图5　外源纯化CaM对正向型质膜囊泡内GTPase活性的影响
Fig.5　Effect of exogenous purified CaM on the GTPase activity of
rightside-out plasma membrane vesicles
A and B: Time course of fluorescence with ex 340 nm and em 460
nm when treated with ACaM2/BSA 100 nmol/L; C: Effect of
ACaM2 100 nmol/L compared with BSA 100 nmol/L on GTPase
activity.
486 32卷 植物生理与分子生物学学报
用不同浓度的外源纯化ACaM2分别处理拟南芥
悬浮细胞，100 nmol/L ACaM2处理[Ca2+]cyt的增高
幅度最大，其次为10 nmol/L ACaM2，而1 000
nmol/L和1 nmol/L ACaM2处理反应不明显(图6B)。
可见，外源ACaM2引起拟南芥悬浮细胞[Ca2+]cyt升
高具有浓度依赖性。进一步检测了外源施加不同亚
型钙调素时，拟南芥悬浮细胞[Ca2+]cyt的变化，结
果表明作为保守性较强的钙调素ACaM2、4、6亚
型，同样浓度下，所引起的[Ca2+]cyt变化特征基本
一致(结果未显示)。
3　讨论
钙调素不仅存在于细胞内，还广泛的存在于细
胞外空间，而且研究表明植物细胞外钙调素可能是
比较保守的钙调素亚型(孙大业和马力耕2001; 周华林
等2001)。因此有学者怀疑外加的纯化钙调素是否被
细胞主动内吞入细胞内，通过提高胞内钙调素浓
度，进而发挥作用。为此我们首先制备了FITC荧
光标记拟南芥保守的ACaM2，使其分别与完整悬浮
细胞或原生质体结合，激光共聚焦显微镜观测表明
荧光主要分布于细胞表面或原生质体膜表面，细胞
内部看不出明显的荧光(图2I-B、D，II-B、D)。
同时我们还采用了商品化的荧光标记动物钙调素
(CaM-488，Sigma产品)进行了同样的实验，结果
与我们自己制备的FITC-ACaM2的结果一致(结果未
显示)。植物细胞像动物细胞一样也会有细胞的内吞
现象发生，而细胞的内吞、胞吐活力与温度高低存
在密切关系，正常生长温度下内吞活力较高，而低
温下内吞活力很低或无(Neil等2002)，内吞荧光指
示剂FM1-43实验结果表明拟南芥悬浮细胞及原生质
体具有活跃的内吞活力(图2I-F，II-F)，这说明外源
加入的钙调素没有被细胞主动内吞进入细胞内。
为排除由于内吞量很少，荧光信号检测不到所
造成的假阴性结果，我们进一步采用了高灵敏度放
射性35S同位素标记的ACaM2，液体闪烁计数法检
测了35S-ACaM2与细胞在不同温度条件下的结合。
细胞处于旺盛生长活动时期，内吞与外吐的活力较
强，温度降低时细胞的活动随着变慢，细胞的内吞
外吐活性也随之降低(Neil等2002)。而35S-ACaM2
在低温(4℃)与细胞最适生长温度(25℃)条件下与拟南
芥悬浮培养细胞特异及可逆性结合值基本相当(图
3)。这进一步说明外源ACaM2没有被细胞主动内吞
到细胞内，而可能主要是结合在细胞外位点，包括
细胞壁及细胞质膜外侧。
细胞外CaM研究中，我们还关心的一个问题就
是，加入到悬浮细胞培养介质中的外源钙调素，是
否会象Systemin和PSK等植物多肽信号一样被细胞
外的蛋白酶降解为小片段(Yoshikatsu 2003)再发挥作
用？为此将35S-ACaM2与拟南芥悬浮细胞温育不同
时间，电泳和放射自显影结果表明CaM在检测的24
h内基本保持完整，无明显可见的降解现象(图4)。
另外，我们对35S-ACaM2与拟南芥悬浮细胞和原生
质体的受体学结合特性分析及化学交联实验表明，
拟南芥细胞质膜表面存在细胞外钙调素的受体样结合
蛋白(Cui等2005)，因此我们推测细胞外钙调素可能
以完整分子形式，通过细胞外受体样蛋白将信号跨
膜转导到细胞内，再引起生物学效应。
前期花粉实验系统研究表明，细胞外钙调素可
引起细胞内信号分子GTPase和Ca2+的变化(Ma等
1999; 尚忠林等2001; Shang等2005)。本文进一步
检测了外源ACaM2对拟南芥正向型质膜囊泡内
图6　外源ACaM2对拟南芥悬浮细胞[Ca2+]cyt的影响
Fig.6　Effect of exogenous purified ACaM2 on [Ca2+]cyt o
suspension-cultured Arabidopsis cells
487崔素娟等: 外源钙调素与拟南芥悬浮培养细胞结合位点的观测及其胞外效应4期
GTPase活性的影响，与同样浓度的BSA对比，细
胞外ACaM2可明显促进GTPase活性(图5C); 借助转
水母发光蛋白基因的拟南芥悬浮培养细胞体系，研
究结果表明ACaM2可特异性引起细胞质钙离子的升
高(图6)，这些结果初步表明外源纯化ACaM2可以
在悬浮细胞外引起胞内信号的变化。但我们在将此
结果与花粉体系相应研究结果比较时，发现外源钙
调素在百合花粉和拟南芥悬浮细胞体系中，所引发
的钙信号在延迟时间以及持续时间上有所不同。钙
荧光探针及激光共聚焦显微镜研究表明，100 nmol/
L钙调素处理后延迟2 min左右，百合花粉内钙离子
[Ca2+]i浓度迅速升高，十几分钟内升高到最大值(可
达本底水平的2倍)，二十几分钟后逐渐趋于稳定
(Shang等2005); 而在拟南芥悬浮细胞体系中，采用
转基因水母发光蛋白发光计数测定，外源钙调素
ACaM2处理引起的钙信号的整体过程要比花粉体系
迅速。刺激后20 s，[Ca2+]cyt即开始缓慢升高，2~3
min升至最高，然后开始缓慢下降，到5 min左右
趋于稳定。分析原因可能有两个，一是由植物种属
及组织细胞不同；二是由于两种不同测钙系统带来
的不同。本实验选择了细胞质中恒定表达的水母发
光蛋白测定细胞质钙信号变化，水母发光蛋白分子
量较大，恒定表达于细胞质，不会渗透到亚细胞器
中，其检测的钙离子浓度变化是真正意义上的细胞
质钙离子浓度变化(Axel和Christian 2001); 而百合花
粉体系中使用的钙离子探针fluo-3为小分子，易于扩
散，因此所检测的钙离子可能不只是细胞质钙信号。
前期研究结果表明，细胞外钙调素广泛存在于
多种动植物细胞外(孙大业和马力耕2001)。我们在
双子叶模式植物拟南芥悬浮培养细胞外也证实了钙调
素的存在(Cui等2005)，本文进一步借助放射性同位
素及激光共聚焦显微镜技术，观测到外源加入的标
记钙调素以完整分子形式确实作用于细胞外位点，
并且可能像已报道的花粉体系细胞外钙调素(Ma等
1999)及Systemin多肽信使等(Yoshikatsu 2003)，通
过跨膜机制引起细胞内信号的变化，而细胞外钙调
素质膜外侧受体的研究将为植物细胞外钙调素多肽信
使假说提供有力的证据。
参 考 文 献
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lular Effect in Suspension-Cultured Arabidopsis Cell
CUI Su-Juan*, CHANG Fang, GAO Ying-Jie, WANG Yuan-Yuan, SUN Da-Ye
Laboratory of Molecular and Cell Biology, Hebei Normal University, Shijiazhuang 050016, China
This work was supported by National Natural Science Foundation of
China (No. 90208004 and No. 30470889) and Natural Science Foundation
of Hebei Province (No. C2004000152).
*Corresponding author (E-mail: cuisujuan@263.net; Tel: 86-311-
86269144).
Abstract: Peptide signals play very important roles
in the process of plant development, growth and
defense to various stresses. Apoplast calmodulin,
putative extracellular peptide signal, not only ex-
isted in extracellular space, but also had biologi-
cal functions. So it is important to provide evi-
dences for extracellular calmodulin binding sites
and mechanism of signaling. In this paper, exog-
enous FITC-ACaM2 was observed only in the
outside of cell using Laser scanning confocal mi-
croscope (Fig.2), and 35S-ACaM2 binding to sus-
pension-cultured Arabidopsis cells at 25°C was
equal to that at 4°C (Fig.3), provided direct evi-
dences that exogenous calmodulin was not
endocytosed into cytoplasm. SDS-PAGE and ra-
diography showed 35S-ACaM2 intactly existed in
extracellular space of suspension-cultured
Arabidopsis cells (Fig.4). Exogenous ACaM2
could specifically promote activity of GTPase (Fig.
5) and [Ca2+]cyt
(Fig.6). These results indicated ex-
ogenous calmodulin could bind to the surface sites
of the suspension-cultured Arabidopsis cells, and
then the extracellular signal was transferred into
cytoplasm signal by transmembrane signaling to
regulate the biological functions.
Key words: extracellular calmodulin; Arabidopsis; suspension-
cultured cells; [Ca2+]cyt; GTPase activity