全 文 ：植物生理学通讯 第42卷 第3期，2006年 月 493
改良提取水稻胚乳和拟南芥花柱中DNA和RNA的SDS法
张志刚1,2,* 李栒1 官春云1 白德朗1,2 武小金2
1湖南农业大学油料作物研究所，长沙410128；2国家杂交水稻工程技术研究中心，长沙410125
Improvement of SDS Method for Isolating Genomic DNA and Total RNA from
Rice Endosperm and Arabidopsis Style
ZHANG Zhi-Gang1,2,*, LI Xun1, GUAN Chun-Yun1, BAI De-Lang1,2, WU Xiao-Jin2
1Oil Crops Institute, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2National Hybrid Rice Research and Development
Center, Changsha 410125, China
提要 在冷酚法的基础上，经多次实践改进，得出一种简单、快速的SDS法，可以从富含多糖的水稻胚乳和富含多酚的
拟南芥花柱中同时提取总DNA和总RNA，所得DNA和RNA样品经紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳分析证明具有较
高的纯度和完整性，并可进一步满足PCR和RT-PCR的实验需要。
关键词 冷酚法；水稻胚乳；拟南芥花柱；总DNA；总RNA
收稿 2005-09-26修定 　2006-03-20
资助 国家“948”项目(2003-Q04)。
*E-mail: zhangzhiganglh@163.com, Tel: 0731-2872941
某些植物组织富含多糖、脂质及酚类物质，
不利于RNA和DNA的分离和纯化，因此，能否
有效地去除多糖、脂质及酚类物质是提取植物中
高质量RNA和DNA成败的关键(Bekesiova等
1999；Chang等1993；Chomczynski和Sacchi
1987；李宏和王新力1999；沈文飚等2003)。水
稻胚乳细胞是种子储藏营养物质的主要部位，富
含淀粉、糊精和一些低分子糖类(郑霏琴等1993);
拟南芥花柱中含有较多的色素、酚类、醌等次生
代谢物质及蛋白质和多糖等有机大分子，这些物
质不仅影响总RNA和总DNA的提取效率，还干
扰以后的反转录、酶切和体外扩增(Vicient和
Delseny 1999；李宏和王新力1999；傅荣昭等
1994)。本文在综合比较各种方法的基础上，采
用改良的SDS法从水稻胚乳和拟南芥花柱中提取
总DNA和总RNA，取得了较好的效果。该方法
简单易行，经济方便，提取到的总DNA和总RNA
可以应用于水稻胚乳和拟南芥花柱PCR检测、
Southern杂交、Northern杂交和cDNA的合成及文
库的构建等。
材料与方法
1 材料
取授粉后10~15 d的两系杂交水稻组合(Oryza
sativa indica cultivar-group)‘准两优527’稻穗和
拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)花柱，放在-70℃
冰箱中保存备用。
2 方法
取水稻穗或拟南芥花柱各0.5 g，放入碾钵
中，加少量石英沙，加入3 mL冰冷的抽提缓冲
液(pH 8.0的5 mmol·L-1 Tris-HCl、20 mmo1·L-1
LiCl、2 mmo1·L-1 EDTA、1% SDS，高压灭菌)
和3 mL冰冷的Tris-饱和酚，研磨成浆状，将浆
状液转入10 mL离心管中，于4℃下以8 000×g离
心l0 min，吸取上层水相，用等体积的酚∶氯
仿∶异戊醇(体积比为25∶24∶1)抽提1~2次，
加入2倍体积无水乙醇，混匀后静置30 min。离
心后倒去液体，沉淀的核酸溶解于1 mL冰冷的水
中，转入1.5 mL离心管中，加入0.33 mL 8 mol·L-1
LiCl和2 mL DEPC，摇匀后放置4℃下过夜或
-20℃ 2 h。4℃下以15 000×g下离心10 min，将
上层的DNA清液转入另一离心管中，加入2/3体
积的异丙醇沉淀，沉淀的DNA用70%乙醇悬浮
洗2次，溶解于0.1 mL TE溶液中；下层的RNA
沉淀用70%乙醇悬浮洗2次，倒置离心管，放在
室温下干燥，用0.1 mL水溶解。取少量样品进
DOI:10.13592/j.cnki.ppj.2006.03.039
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行浓度测定和电泳分析。
实验结果
1 RNA和DNA的纯度和完整性
以上述方法从水稻胚乳和拟南芥花柱中提取
的总RNA和DNA样品，用紫外分光光度计测定，
RNA的OD260/OD280值在1.873~2.194之间，OD260/
OD230值大于2.0；DNA的OD260/OD280值在1.735~
1.978之间，OD260/OD230也大于2.0。说明提取的
RNA和DNA纯度较高，没有蛋白质、多糖等杂
质的污染(李宏等1999)。用1.0%琼脂糖凝胶电泳
检测，RNA的图谱中可见到28S和18S两条完整
的条带，28S RNA条带的亮度几乎是18S的2倍，
无明显的拖尾现象，表明RNA样品比较完整(图
1)。DNA分子量大小约为22 kb，点样孔清晰，
无拖尾现象和RNA污染，符合PCR技术的要求
(图2)。
2.2 kb包含全长编码序列的vp1基因cDNA目的条
带(图3)。另据拟南芥dgat基因序列(序列号
AJ238008)设计的1对引物，以拟南芥花柱总DNA
和RNA为模板，进行的PCR和RT-PCR，分别
扩增得到了3.0 kb的dgat基因DNA和1.6 kb包含
全长编码序列的dgat基因cDNA目的条带(图4)。
由此说明，用此法提取总RNA和DNA可以满足
植物分子生物学实验的需要。
图3 水稻胚乳vp1的扩增
1：水稻胚乳总DNA扩增的vp1基因DNA；3：水稻胚
乳总RNA扩增的vp1基因cDNA；2、4：1 kb DNA marker。
讨 论
从水稻胚乳和拟南芥花柱中提取高质量的
DNA和RNA，除需要防止核糖核酸酶对RNA的
破坏之外，还要提防组织多糖、多酚和醌类等物
质对RNA和DNA的干扰。由于多糖的许多理化
性质与RNA相似，在沉淀RNA时，多糖也随RNA
一同沉淀下来，很容易产生难溶于水的胶状沉
淀；多酚、醌类物质在酸性条件下极易氧化成红
褐色物质，然后和核酸不可逆地结合，从而为
图2 水稻和拟南芥的DNA电泳图谱
图1 水稻和拟南芥的RNA电泳图谱
图4 拟南芥花柱dgat基因的扩增
1：拟南芥花柱总DNA扩增的dgat基因DNA；3：拟南
芥花柱总RNA扩增的dgat基因cDNA；2、4：1 kb DNA
marker。
2 水稻胚乳vp1基因和拟南芥dgat基因的扩增
根据GenBank中报道的水稻vp1基因序列(序
列号AK073805)，设计1对引物，以上述方法提
取的水稻总DNA和RNA为模板，进行PCR和RT-
PCR，分别扩增得到了3.5 kb的vp1基因DNA和
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RNA样品的进一步研究带来困难(李宏和王新力
1999；傅荣昭等1994；何振艳等2005)。我们
曾用Trizol试剂盒提取幼嫩的水稻胚乳和拟南芥花
柱中RNA，效果很好，所提取的RNA能见到2
条清晰的条带，且28S的亮度是18S的2倍；但
提取较老的组织时，得到的RNA为难溶于水的冻
胶状物质，电泳结果只能见到5S的条带。因此，
根据在比较综合分析的基础上采用SDS同时提取
植物中RNA和DNA的结果，我们认为，从水稻
胚乳及拟南芥花柱中提取高质量的DNA和RNA
时，应注意以下几点：(1)将研磨缓冲液的pH值
提高到8.0，且在低温条件下进行研磨破碎细胞可
有效地防止多酚氧化物的氧化及多糖物质糊化；
(2)利用乙醇沉淀核酸，去除色素和大部分多糖，
然后用LiCl进一步沉淀核酸去除多糖；(3)破碎细
胞时，应加入研磨缓冲液和Tris-饱和酚，这样，
细胞破碎后释放的内源RNase在研磨缓冲液中的
EDTA、SDS和酚作用下即刻失活，从而缩短了
内源RNase与RNA共存时间，降低内源RNase降
解RNA的可能性。同时，在乙醇沉淀核酸前，
用氯仿抽提1~2次，用含DEPC的LiCl沉淀核酸，
这样，可使核酸液中残余RNase变性和失活。
与传统的冷酚法(顾红雅等1995)相比，本文
方法主要作了以下改进：(1)抽提缓冲液用常规药
品配制，可以降低药品使用成本；(2)利用乙醇沉
淀核酸，去除色素和大部分多糖，然后用LiCl进
一步沉淀核酸去除多糖，得到的RNA更纯；(3)
用含DEPC的LiCl沉淀核酸，可使核酸液中残余
RNase变性和失活，得到的RNA可以保存更长的
时间；(4) LiCl沉淀RNA后的上清液，用异丙醇
沉淀可以得到植物总DNA，即用本文方法可同时
提取植物组织中的DNA和RNA，这样可节约实验
材料，简化提取DNA的实验步骤。
参考文献
傅荣昭, 孙勇如, 贾士荣主编(1994). 植物遗传转化技术手册. 北
京: 中国科学技术出版社, 141~144
顾红雅, 瞿礼嘉, 明小天, 潘乃穟, 陈章良(1995). 植物基因与分子
操作. 北京: 北京大学出版社, 77~83
何振艳, 徐文忠, 杨学习, 麻密(2005). 提取蕨类植物蜈蚣草总
RNA的一种有效方法. 植物学通报, 22 (2): 198~202
李宏, 王新力(1999). 植物组织RNA提取的难点及对策. 生物技
术通报, 15 (1): 36~39
李宏, 王新力, 彭学贤(1999). 香蕉不同组织中总RNA的有效分
离. 植物生理学通讯, 35 (5): 384~388
沈文飚, 汪仁, 王益华, 郑天清, 万建民(2003). 从水稻种胚中提取
RNA的新方法. 遗传, 25 (2): 208~210
郑霏琴, 王宗阳, 高继平(1993). 水稻胚乳中核糖核酸的分离. 植
物生理学通讯, 29 (6): 438~440
Bekesiova I, Nap JP, Mlynarova L (1999). Isolation of high quality
DNA and RNA from leaves of the carnivorous plantDrosera
rotundifolia. Plant Mol Biol Rep, 17: 269~277
Chang S, Puryear L, Cairney J (1993). A simple and efficient
method for isolating RNA from pine trees. Plant Mol Biol
Rep, 11: 113~l16
Chomczynski P, Sacchi N (1987). Single-step method of RNA
isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloro-
form extraction. Anal B chem, 162: 156~159
Vicient CM, Delseny M (1999). Isolation of total RNA from
Arabidopsis thaliana seed. Anal Biochem, 268: 412~413