全 文 ：中国科学: 生命科学 2010年 第 40卷 第 5期: 408 ~ 417

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英文版见: Li J Q, Zhang J, Wang X C, et al. A membrane-tethered transcription factor ANAC089 negatively regulates floral initiation in Arabidopsis thaliana. Sci
China Life Sci, 2010, 53, in press
《中国科学》杂志社
SCIENCE CHINA PRESS
论 文
膜系留转录因子 ANAC089 在拟南芥开花诱导过程
中起负调控作用
李建琴①②, 张娟①, 王学臣①, 陈珈 *①
① 中国农业大学生物学院, 植物生理学与生物化学国家重点实验室, 北京 100193;
② 广西大学生命科学与技术学院, 南宁 530004
* 联系人, E-mail: chenja@public.bta.net.cn
收稿日期: 2009-12-28; 接受日期: 2010-01-27
国家重点基础研究发展计划(批准号: 2006CB100100)和农业部转基因重大专项(批准号: 2009ZX08009-025B)资助项目

摘要 NAC(NAM, ATAF1/2 和 CUC2)转录因子家族为植物所特有, 该家族成员在植物生
长发育及对环境胁迫的应答中有重要的调控作用. 近年来 , NAC 家族中一类被命名为
NTLs(NTM1-Like)的膜系留转录因子受到了研究人员的重视. 拟南芥中 ANAC089 编码具有
340个氨基酸的 NAC蛋白, 在它的 C-末端有一个预测的跨膜结构域. 亚细胞定位表明, 全长
的 ANAC089蛋白定位在内质网, 而截去跨膜结构域的截短蛋白 ANAC089ΔC定位在细胞核
内. 长日照条件下, 35S::ANAC089ΔC转基因植株株型矮小、叶片小而浓绿, 最为明显的是开
花延迟. 与此表型相应, 转基因植株中CO, SOC1, FT和LFY的表达水平受到了不同程度地抑
制, 而 FLC的表达水平被增强. 本研究表明, ANAC089是一个膜系留转录因子, 以截短蛋白
ANAC089ΔC的形式进入细胞核内执行转录因子的功能, ANAC089在拟南芥的开花诱导过程
中起负调控作用.
关键词
拟南芥
ANAC089
开花诱导
膜系留转录因子



转录因子调控着下游一系列基因的表达, 因而
在细胞生理生化活动中起着重要的作用. 在拟南芥
基因组中, NAC 转录因子家族是一个庞大的家族, 其
成员超过 110 个[1]. 从蛋白序列上看, NAC 蛋白的 N
端区域具有一个高度保守的 DNA 结合结构域(NAC
DNA-binding domain), C 端区域具有转录激活功能,
但各成员间同源性不高. 已经报道的 NAC 转录因子
功能多样, 参与植物生长发育的诸多过程, 如顶端分
生组织的形成[2,3]、细胞周期的调控[4]、花发育[5]、次
生根的形成[6,7]、次生壁加厚[8,9]、叶片衰老等[10,11]; 此
外, 一些 NAC 转录因子还参与了对环境胁迫的应
答[12~14].
近年来, NAC家族中一类被命名为NTLs(NTM1-
Like)的膜系留转录因子(membrane-tethered transcrip-
tion factors, MTTFs)受到了研究人员的重视, NTLs 在
植物生长发育及对环境胁迫的应答中起重要的调控
作用[15~17]. 滞留在细胞质中的转录因子大多通过与
其他蛋白的相互作用来实现, 而 MTTFs 则是通过自
身的一段疏水的跨膜序列将其锚定在细胞内膜上 ,
因而不能进入细胞核内, 它的激活需要通过细胞内蛋
白质的选择性水解机制除去跨膜结构域(a transmem-
brane domain, TMD), 仅切割下来的胞质部分进入细
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胞核中发挥转录因子的转录激活功能, 从而调控下
游基因的表达[18]. 迄今为止, 拟南芥中已有功能报道
的 MTTFs 极少 , 包括 bZIP 转录因子家族中的
AtbZIP17, AtbZIP18, AtbZIP28 和 AtbZIP60[19~21], 以
及 NAC 家族中的 NTM1, NTL6, NTL8, NTL9[4,11,15].
MTTFs 在结构上有很大的相似性, 由具有转录因子
活性的胞质部分及一个跨膜结构域组成, 通过对拟
南芥基因组全序列进行分析, 预测 NAC 家族中 10%
以上的成员是膜系留转录因子[15]. 由于 MTTFs 不仅
参与了植物生长发育及胁迫响应的调控过程, 还可
为研究蛋白的选择性降解及活性蛋白的入核等生物
学问题提供一个良好的模式, 因此对此类转录因子
进行研究具有重要的意义.
在恰当的时期开花结果对于植物的生长繁衍很
重要. 研究表明, 植物的开花诱导受外因和内因的共
同影响. 在模式植物拟南芥中已知有 4 条开花途径:
光周期途径、自主途径、春化途径和赤霉素(GA)途径,
4 条途径形成一个调控网络, 相互影响, 共同调控植
物由营养生长向生殖生长的转变. 现已发现了一些
重要的调控因子, 它们位于上述几条开花途径的整
合点上, 使植物能应对外部条件及内部环境的变化,
适时诱导开花[22~24]. 光周期途径中的一个重要调节基
因 CO(constans)[25]是一个具有锌指结构的转录因子,
正向调控 FT(flowering locus t)和 SOC1(suppressor of
overexpression of co 1)[26,27], FT 在叶片中表达后被转运
至茎尖分生组织, 进一步调控下游 LFY 等花分生组织
基因的表达[27~29]. FLC(flowering locus c)是自主开花途
径和春化途径的抑制因子, 负调控 FT 和 SOC1[30,31].
在赤霉素途径中, DELLA 蛋白是一类主要的调节因子,
参与赤霉素的各种反应, 如RGA(repressor of ga1-3)和
GAI(gibberellin insensitive)抑制植物的营养生长, 延
迟开花[32]. 此外, 近期研究还发现, 开花诱导与染色
质修饰如组蛋白的甲基化等相关[33~36].
本文报道了一个膜系留转录因子 ANAC089 在拟
南芥的开花诱导过程中起负调控作用.
1 材料与方法
1.1 植物材料、生长条件及拟南芥转化方法
拟南芥(生态型为 Col-0)种子经无菌消毒后播种
于 MS(Sigma, St. Louis, MO, USA)固体培养基上, 播
有种子的平板在 4℃黑暗下放置 3 天, 然后置于光照
培养箱中发芽生长, 7 天后将幼苗移栽到塑料小盆中
(土壤/蛭石=1/1), 置于植物生长室中生长. 植物生长
室的条件为: 温度 23℃左右, 相对湿度 65%, 光周期
为 16 h 光照/8 h 黑暗, 光强为 100 μmol·m−2·s−1.
拟南芥转化方法详见文献 [37], 构建过表达
ANAC089F 及 ANAC089ΔC 所用的植物表达载体为
改造后的 pCAMBIA1300(本实验室保存). 获得 T3 代
纯合的单拷贝插入转基因植株用于功能研究.
1.2 蛋白序列分析
应用生物学软件 BLASTP(http://www.ncbi.nlm.nih.
gov/BLAST/)及 ClustalW server(http://www.ebi.ac.uk/
clustalw/)对 ANAC089(At5g22290)和 NTL8(At2g27300)
的蛋白序列进行比对分析; 通过 ARAMEMNON 膜
蛋白数据库对跨膜结构域进行预测 (http://www.
aramemnon.botanik.uni-koeln.de/).
1.3 ANAC089 的亚细胞定位分析
利用拟南芥原生质体瞬时转化系统及烟草叶片
瞬时转化系统对 ANAC089 进行了亚细胞定位分析.
分别构建含有ANAC089全长氨基酸序列(ANAC089F,
1~340 aa)和ANAC089截短蛋白(ANAC089ΔC, 1~310
aa)的瞬时表达载体; 用于拟南芥原生质体瞬时转化
系统和烟草叶片瞬时转化系统的瞬时表达载体分别
为 pUC-EGFP 和 pGPTVⅡ-GFP(本实验室保存). 拟
南芥原生质体瞬时转化方法详见文献[38]. 在烟草叶
片瞬时转化实验中, 直接将带有相应融合基因质粒
的农杆菌和带有内质网标记基因质粒(ER-mCherry:
Arabidopsis Information Resource stock No. CD3-
959)[39]的农杆菌混合注射入烟草叶片, 在转化后 48~
72 h 内取叶片在激光共聚焦显微镜(LSM 510 CLSM;
Zeiss)下观察. 用 488 nm 激发光激发, 515~530 nm 检
测 GFP 绿色荧光蛋白信号; 用 543 nm 激发光激发,
586~615 nm 检测 mCherry 红色荧光蛋白信号. 图像
先经 LSM5 Image Browser(Zeiss)处理, 后用 Adobe
Photoshop 8.0.1 软件处理.
1.4 ANAC089 的转录激活特性分析
在酵母转录激活实验中所用的酵母菌株为
YRG-2, 它的基因组中带有两个报告基因 LacZ 和
HIS3. 通过 PCR 扩增以下片段: ANAC089-N(1~167 aa),
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ANAC089-C(168~340 aa)及 ANAC089ΔC-C(168~310
aa), 将它们分别与具有编码 GAL4 DNA 结合结构域
的酵母表达载体 pBD 连接获得相应的重组质粒 pBD-
ANAC089-N, pBD-ANAC089-C 及 pBD-ANAC089ΔC-
C; 将上述重组质粒、阳性对照质粒 pGAL4、阴性对
照质粒 pBD 分别转化酵母 YRG-2, 在缺少色氨酸的
SD 培养基上筛选阳性转化子(pGAL4 转化子用缺少
组氨酸的 SD 培养基筛选), 并用 PCR 加以进一步验
证; 通过观察各转化子在缺少组氨酸的 SD 培养基上
的生长状态来评价转录激活活性.
1.5 ANAC089 启动子融合 GUS 报告基因的转基因
植株分析
在拟南芥网站 (http://www.arabidopsis.org)中查
询到 ANAC089 的基因组序列, 从起始密码子 ATG 上
游开始设计引物扩增 1778 bp长度的启动子序列, 扩增
产物与表达载体 pCAMBIA1391(CAMBIA, Canberra,
ACT, Australia)连接, 转化拟南芥. 获得 T3 代纯合的
单拷贝插入转基因植株用于 GUS 染色分析, 染色方
法详见文献[40].
1.6 开花时间的确定
植物生长条件为长日照(16 h 光照/8 h 黑暗), 当
花茎抽出达 1.0 cm 时所需的天数计为开花时间, 统
计此时的莲座叶数. 每种材料至少统计 30 株.
1.7 实时定量 PCR 分析开花相关基因的表达情况
取在长日照下生长 20 天的幼苗的地上部分 100
mg 用于提取总 RNA, 总 RNA 的提取采用 Trizol 法
(Invitrogen Crop., Carlsbad, California, USA). 使用反
转录酶 M-MLV 及 oligo-d(T)引物合成 cDNAs, 具体
操作按试剂盒说明书进行 (Promega, Madison, WI,
USA). 实时定量 PCR 所用的荧光染料 SYBR-Green I
购自美国伯乐生物公司 (Bio-Rad, Hercules, USA),
PCR 仪型号为 MyiQ Single Color Real time PCR
Detection System(Bio-Rad). 实时定量 PCR 反应按以
下程序进行: 95℃变性 5 min; 95℃变性 15 s, 60℃退
火 15 s, 72℃延伸 20 s, 共 40 个循环. ACTIN2 作为内
参. 实验重复 3 次.
1.8 引物
本实验所用引物序列见表 1.
2 结果
2.1 蛋白序列比对分析
通过对ANAC089(At5g22290)和NTL8(At2g27300)
的蛋白序列进行比对发现, 与其他 NAC 转录因子相
似, 在 ANAC089 的 N 端有一个保守的 NAC DNA 结
合结构域; 应用 ARAMEMNON 膜蛋白数据库预测
的跨膜结构域 (TMD)位于 ANAC089 的 C 末端
(321~339 aa), 与 NTL8 相似, 预测的 TMD 由较多的
疏水性氨基酸组成; 尽管 ANAC089 和 NTL8 都属于
OsNAC8 亚家族, 但两者 C端的氨基酸序列同源性并
不高(图 1).
2.2 ANAC089 是一个膜系留转录因子
通过预测发现, 在 ANAC089 的 C 末端有一个跨
膜结构域, 因此推测 ANAC089 可能是一个膜系留转
录因子. 在拟南芥原生质体瞬时转化实验中, 带有全
长氨基酸序列的 ANAC089F 定位在胞质里, 而截掉
跨膜结构域的 ANAC089ΔC 则定位在细胞核内(图
2(A)). 为了进一步明确 ANAC089F 在胞质中的定位,
进行了烟草叶片共转化实验, 图 2(B)显示带有绿色
荧光标记的 ANAC089F 与带有红色荧光标记的内质
网标记蛋白 ER-mCherry 能重叠, 表明 ANAC089F 定
位在内质网.
2.3 ANAC089 的 C 端区域具有转录激活活性
为验证 ANAC089 是否具有转录因子的转录激活
功能, 利用酵母转录激活实验检测了 ANAC089 的转
录激活特性. 所有转化子在 YAPD 培养基上均能正
常生长(图 3(A)); 在缺少组氨酸的 SD 培养基上, 只
有转化了 pBD-ANAC089-C, pBD-ANAC089ΔC-C 重
组质粒和阳性对照质粒 pGAL4 的酵母能正常生长,
而转化 pBD-ANAC089-N 重组质粒和阴性对照质粒
pBD 的酵母不能正常生长(图 3(C)). 上述结果表明,
ANAC089 具有转录激活功能, 它的转录激活结构域
位于 C 端, 即使去掉了跨膜结构域的 C 端, 仍然具有
转录激活活性.
2.4 ANAC089 的组织表达特性
利用 p A N A C 0 8 9 - G U S 转基因植株检测了
ANAC089 在不同组织中的表达情况. 组织化学染色
结果显示 , 在萌发种子刚伸出的子叶维管组织中
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表 1 所用引物序列
引物名称 序列(5′→3′) 用途
ANAC089ΔC F TTCTGCAGATGGACACGAAGGCGGTTG 用于过表达载体构建 ANAC089ΔC 的克隆
ANAC089ΔC R TCGGTACCTTACACGAAGCAGCTCGACAAT 用于过表达载体构建 ANAC089ΔC 的克隆
ANAC089gfp F AAGGATCCATGGACACGAAGGCGGTTG 用于亚细胞定位瞬时表达载体构建 ANAC089 的克隆
ANAC089gfp R GCGGTACCTTCTAGATAAAACAACATTG 用于亚细胞定位瞬时表达载体构建 ANAC089 的克隆
ANAC089ΔCgfp F AAGGATCCATGGACACGAAGGCGGTTG 用于亚细胞定位瞬时表达载体构建 ANAC089ΔC 的克隆
ANAC089ΔCgfp R GCGGTACCCACGAAGCAGCTCGACAATG 用于亚细胞定位瞬时表达载体构建 ANAC089ΔC 的克隆
ANAC089-N F CTGAATTCATGGACACGAAGGCGGTTG 用于转录激活实验载体构建 ANAC089-N 的克隆
ANAC089-N R AACTGCAGTTAGTTCCTCCTAACCCGGCAA 用于转录激活实验载体构建 ANAC089-N 的克隆
ANAC089-C F GGGAATTCAAAGAATACAATAGTGGTA 用于转录激活实验载体构建 ANAC089-C 的克隆
ANAC089-C R CCTGCAGTTATTCTAGATAAAACAACATTG 用于转录激活实验载体构建 ANAC089-C 的克隆
ANAC089ΔC-C F GGGAATTCAAAGAATACAATAGTGGTA 用于转录激活实验载体构建 ANAC089ΔC-C 的克隆
ANAC089ΔC-C R AACTGCAGTTACACGAAGCAGCTCGACAAT 用于转录激活实验载体构建 ANAC089ΔC-C 的克隆
ANAC089promoter F TGGATCCTTTGATGGCCGTTGGTCTG 用于 ANAC089 启动子区序列的克隆
ANAC089promoter R TGAATTCAAACTCCAACCGCCTTCGT 用于 ANAC089 启动子区序列的克隆
Actin real F GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG 用于荧光实时定量 PCR 反应
Actin real R AACGACCTTAATCTTCATGCTGC 用于荧光实时定量 PCR 反应
ANAC089 real F GGAACACACCAAACGAAGTGCCAA 用于荧光实时定量 PCR 反应
ANAC089 real R TAAACCCACGAAGCAGCTCGACAA 用于荧光实时定量 PCR 反应
CO real F GCCATCAGCGAGTTCCAATTCTAC 用于荧光实时定量 PCR 反应
CO real R CCTTCCTCTTGATCCACCACCAG 用于荧光实时定量 PCR 反应
SOC1 real F TAAGGATCGAGTCAGCACCAAACC 用于荧光实时定量 PCR 反应
SOC1 real R AGCTCCTCGATTGAGCATGTTCCT 用于荧光实时定量 PCR 反应
FT real F TCCCTGCTACAACTGGAACAACCT 用于荧光实时定量 PCR 反应
FT real R GCCTGCCAAGCTGTCGAAACAATA 用于荧光实时定量 PCR 反应
FLC real F CGTCGCTCTTCTCGTCGTCTC 用于荧光实时定量 PCR 反应
FLC real R TTCGGTCTTCTTGGCTCTAGTCAC 用于荧光实时定量 PCR 反应
LFY real F TCCACTGCCTAGACGAAGAAGC 用于荧光实时定量 PCR 反应
LFY real R TCCCAGCCATGACGACAAGC 用于荧光实时定量 PCR 反应
GAI real F ACGCCGAGTACGATCTTAAAGC 用于荧光实时定量 PCR 反应
GAI real R TTTCCACGACGCCGTTTGAG 用于荧光实时定量 PCR 反应
RGA real F AAGCATACGACGGTGGTGGAG 用于荧光实时定量 PCR 反应
RGA real R TTCAGTTCGGTTTAGGTCTTGGTC 用于荧光实时定量 PCR 反应



图 1 ANAC089(At5g22290)与 NTL8(At2g27300)蛋白序列比对
保守 NAC DNA 结合结构域以虚下画线标出; 疏水跨膜结构域以实下画线标出
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图 2 ANAC089 的亚细胞定位
(A) 拟南芥原生质体瞬时转化: 转 pUC-EGFP 空载体 Vector 作为对照, ANAC089F-EGFP 绿色荧光出现在胞质内, ANAC089ΔC-EGFP 绿
色荧光出现在细胞核内; (B) 烟草叶片瞬时转化: 绿色荧光示 ANAC089F-GFP 定位, 红色荧光示内质网标记蛋白 ER-mCherry 定位, 绿色
荧光与红色荧光能重叠



图 3 酵母转录激活系统中 ANAC089 的转录激活活性分析
(A) 转化子在 YPAD 培养基上均能正常生长; (B) 为(A)与(C)中各转化子的位置; (C) 在缺少组氨酸的 SD 培养基上, 转 pBD-ANAC089-C,
pBD-ANAC089ΔC-C 重组质粒和阳性对照质粒 pGAL4 的酵母能正常生长, 转化 pBD-ANAC089-N 重组质粒和阴性对照质粒 pBD 的酵母
不能正常生长
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即检测到 GUS 信号(图 4(A)); 幼苗子叶、下胚轴和根
部(根尖除外)的维管组织以及成熟的莲座叶片和茎
生叶片的维管组织中均有强烈的 GUS 信号(图 4(B)~
(E)); 在花器官里, 花冠、花丝及柱头的维管组织中
均有表达(图 4(F)), 然而在成熟的角果、茎及种子中
未检测到 GUS 信号(图 4(E)和(G)). 以上结果表明,
ANAC089 的表达部位主要在维管组织中.
2.5 长日照条件下, 35S::ANAC089ΔC 转基因植株
开花延迟
为了进一步研究 ANAC089 的生理功能, 构建了
截掉跨膜结构域的 ANAC089 过表达载体 (35S::
ANAC089ΔC), 转化野生型拟南芥. 与野生型植株相
比, 35S::ANAC089ΔC 转基因植株株型矮小、叶片小
而浓绿, 最为明显的是开花延迟(图 5(A)). 3 个 T3 代
纯合 35S::ANAC089ΔC 转基因株系用于功能研究, 分
别命名为 OE-1, OE-2 及 OE-3. 在长日照条件下, 野
生型, OE-1, OE-2 及 OE-3 在开花起始时的莲座叶片
总数分别为 12.10, 16.52, 20.13 和 22.87; 野生型的开
花时间平均为 27.73 天, 而 OE-1, OE-2 及 OE-3 的开
花时间天数则分别为 33.17, 38.85 和 42.54, 35S::
ANAC089ΔC 转基因株系开花明显延迟(图 5(C)). 同
时发现, 转基因株系中 ANAC089ΔC的表达倍数越高,
开花延迟也越明显(图 5(A)~(C)).
2.6 35S::ANAC089ΔC 转基因植株中开花相关基
因的表达情况
35S::ANAC089ΔC 转基因植株表现出晚花的明
显表型, 那么, 在转基因植株中与开花相关的一些重
要调节基因是否也分生了相应的变化呢? 应用实时



图 4 pANAC089-GUS 转基因植株分析 ANAC089 的组织表达特性
(A) 萌发的种子; (B) 生长 3 天的幼苗; (C) 生长 10 天的幼苗; (D) 生长 3 周的莲座叶; (E) 生长 5 周的茎及茎生叶;
(F) 生长 5 周的花序; (G) 成熟的角果
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定量 PCR 技术检测了开花相关基因 CO, FLC, SOC1,
FT, LFY, GAI 和 RGA 在野生型植株及转基因株系
OE-2 和 OE-3 中的表达水平. 结果表明, 在 OE-2 和
OE-3 中, CO, SOC1, FT 和 LFY 的表达均受到不同程
度的抑制, 在 OE-2 中, CO, SOC1, FT 和 LFY 的表达
水平分别是野生型的 38%, 37%, 13%和 35%, 在OE-3
中分别为 27%, 23%, 9%和 28%. FLC 的表达在 OE-2
和 OE-3 中被增强, 分别是野生型的 3.23 和 4.06 倍.
而 GAI 和 RGA 的表达水平在野生型植株和 OE-2 和
OE-3 中则没有明显差异 (图 6). 以上结果表明 ,
ANAC089 通过调节 CO, SOC1, FT, LFY 及 FLC 的表
达水平, 从而实现对拟南芥开花诱导的调控.
3 讨论
膜系留转录因子的研究已越来越受到人们的关
注. 现有的研究表明, 膜系留转录因子依靠跨膜结构
域锚定在细胞内膜上, 并通过选择性蛋白水解的方
式被激活, 这种机制使得植物能够快速应答内外环
境的变化[17,41,42]. 通过序列预测发现, 在 ANAC089
的C末端存在一个疏水的跨膜结构域, 由此推测它可
能是一个膜系留转录因子. 瞬时转化实验表明全长
ANAC089 蛋白 (ANAC089F)定位在内质网 , 截掉
TMD 的 ANAC089 蛋白(ANAC089ΔC)则定位在细胞
核内. 此外, ANAC089 的 C 端区域以及去掉了 TMD
的截短 C 端都具有转录激活功能. 以上研究表明,
ANAC089 是一个膜系留转录因子, 与其他的 MTTFs
相似[16], 以截短蛋白 ANAC089ΔC 的形式进入细胞
核内发挥转录因子的功能.
35S::ANAC089ΔC 转基因植株表现出晚花的明
显表型, 实时定量 PCR 结果证实了转基因株系体内
CO, SOC1, FT 和 LFY 的表达水平受到了不同程度的
抑制, FLC 的表达水平被增强. 同时获得了过表达
ANAC089 全长蛋白的转基因株系(35S::ANAC089F),
35S::ANAC089F 只表现出较轻程度的开花延迟(结果
未显示), 可能是由于过表达的是全长 ANAC089, 因



图 5 35S::ANAC089ΔC 转基因植株开花延迟
(A) 长日照条件下, 35S::ANAC089ΔC 转基因植株开花延迟, Col-0 为野生型拟南芥, OE-1, OE-2 及 OE-3 为 3 个 35S::ANAC089ΔC 转基因
株系; (B) 实时定量 PCR 检测 3 个 35S::ANAC089ΔC 转基因株系中 ANAC089ΔC 的表达水平, 3 次独立重复实验; (C) 开花时间及莲座叶数,
每种材料统计 30 株植株. Bar 代表标准差
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图 6 开花相关基因的表达变化情况
实时定量 PCR 检测 35S::ANAC089ΔC 转基因植株 OE-1, OE-2 及
野生型植株中开花相关基因的表达水平, 3 次独立重复实验, Bar
代表标准差

而不能像过表达ANAC089ΔC那样, 无需经过胞内蛋
白质选择性水解过程去除 TMD, 便可直接进入细胞
核内起到转录因子的调控作用 . 此外还从 Institute
Jean-Pierre Bourgin 获得了 ANAC089 的 T-DNA 插入
突变体 FLAG066A02, 然而该突变体在表型上与野生
型相比, 没有明显差异(结果未显示). 这可能是由于
同一亚家族的成员之间功能冗余所致, Kim 等人[5]的
研究结果指出过表达 NTL8ΔC 也表现出开花延迟的
表型, 而 ANAC089 与 NTL8ΔC 同属于 OsNAC8 亚家
族. 由于没有合适的 ANAC089 功能缺失突变体, 利
用双(多)突变或 RNA 干扰技术, 也许会进一步更好
地阐明 ANAC089 的功能.
ANAC089抑制了开花相关基因CO的表达, 那么
CO 是否可能为 ANAC089 作用的一个下游靶基因呢?
Tran 等人[13]的研究认为, NAC 家族转录因子所识别的
顺式元件中包含有 CATGT 和 CACG 核心序列. 用顺
式元件软件(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/index.
html)分析了 CO 的启动子序列(ATG 上游 1900 bp 长
度的 DNA 序列), 发现存在 7 个 CATGT 基序和 4 个
CACG 基序. 在长日照下, CO 在子叶和叶片的维管
组织中合成后, 直接激活下游靶基因FT的表达. 图 4
显示, ANAC089 主要是在叶的维管组织中表达, 推测
CO 可能是 ANAC089 的一个靶基因, 然而, ANAC089
是否直接作用于CO, 以及ANAC089所识别的核心序
列是什么, 还有待进一步研究.
在所有已研究过的膜系留转录因子中, 大多数
MTTFs 还参与了对环境胁迫的应答[16,17]. ANAC089
在转录水平上受到甘露醇的诱导(结果未显示), 那么
它除了调控开花诱导外, 是否也参与了对环境胁迫
的应答呢? 作为一个膜系留转录因子, 又是什么因
素把它激活, 将它从膜上释放下来成为活性蛋白的
形式? 这些问题都有待于进行深入的研究.
综上所述, 本研究表明, ANAC089 是一个膜系留
转录因子 , 只有截掉跨膜结构域的截短蛋白
ANAC089ΔC 才能进入细胞核内执行转录因子的功能,
ANAC089 在拟南芥的开花诱导过程中起负调控作用.
致谢 感谢加拿大林业资源研究中心的刘俊君博士对本文的建议.
参考文献
1 Ooka H, Satoh K, Doi K, et al. Comprehensive analysis of NAC family genes in Oryza sativa and Arabidopsis thaliana. DNA Res, 2003, 10:
239—247
2 Takada S, Hibara K, Ishida T, et al. The CUP-SHAPED COTYLEDON1 gene of Arabidopsis regulates shoot apical meristem formation.
Development, 2001, 128: 1127—1135
3 Vroemen C W, Mordhorst A P, Albrecht C, et al. The CUP-SHAPED COTYLEDON3 gene is required for boundary and shoot meristem
formation in Arabidopsis. Plant Cell, 2003, 15: 1563—1577
4 Kim Y S, Kim S G, Park J E, et al. A membrane-bound NAC transcription factor regulates cell division in Arabidopsis. Plant Cell, 2006, 18:
3132—3144
5 Kim S G, Kim S Y, Park C M. A membrane-associated NAC transcription factor regulates salt-responsive flowering via FLOWERING
LOCUS T in Arabidopsis. Planta, 2007, 226: 647—654
6 Xie Q, Frugis G, Colgan D, et al. Arabidopsis NAC1 transduces auxin signal downstream of TIR1 to promote lateral root development.
Genes Dev, 2000, 14: 3024—3036
7 He X J, Mu R L, Cao W H, et al. AtNAC2, a transcription factor downstream of ethylene and auxin signaling pathways, is involved in salt
stress response and lateral root development. Plant J, 2005, 44: 903—916
李建琴等: 膜系留转录因子 ANAC089 在拟南芥开花诱导过程中起到负调控作用

416
8 Ko J H, Yang S H, Park A H, et al. ANAC012, a member of the plant-specific NAC transcription factor family, negatively regulates xylary
fiber development in Arabidopsis thaliana. Plant J, 2007, 50: 1035—1048
9 Mitsuda N, Ohme-Takagi M. NAC transcription factors NST1 and NST3 regulate pod shattering in a partially redundant manner by
promoting secondary wall formation after the establishment of tissue identity. Plant J, 2008, 56: 768—778
10 Guo Y, Gan S. AtNAP, a NAC family transcription factor, has an important role in leaf senescence. Plant J, 2006, 46: 601—612
11 Yoon H K, Kim S G, Kim S Y, et al. Regulation of leaf senescence by NTL9-mediated osmotic stress signaling in Arabidopsis. Mol Cells,
2008, 25: 438—445
12 Lu P L, Chen N Z, An R, et al. A novel drought-inducible gene, ATAF1, encodes a NAC family protein that negatively regulates the
expression of stress-responsive genes in Arabidopsis. Plant Mol Biol, 2007, 63: 289—305
13 Tran L S, Nakashima K, Sakuma Y, et al. Isolation and functional analysis of Arabidopsis stress-inducible NAC transcription factors that
bind to a drought-responsive cis-element in the early responsive to dehydration stress 1 promoter. Plant Cell, 2004, 16: 2481—2498
14 Kim S G, Lee A K, Yoon H K, et al. A membrane-bound NAC transcription factor NTL8 regulates gibberellic acid-mediated salt signaling
in Arabidopsis seed germination. Plant J, 2008, 55: 77—88
15 Kim S Y, Kim S G, Kim Y S, et al. Exploring membrane-associated NAC transcription factors in Arabidopsis: implications for membrane
biology in genome regulation. Nucleic Acids Res, 2007, 35: 203—213
16 Chen Y N, Slabaugh E, Brandizzi F. Membrane-tethered transcription factors in Arabidopsis thaliana: novel regulators in stress response
and development. Curr Opin Plant Biol, 2008, 11: 695—701
17 Seo P J, Kim S G, Park C M. Membrane-bound transcription factors in plants. Trends Plant Sci, 2008, 13: 550—556
18 Hoppe T, Rape M, Jentsch S. Membrane-bound transcription factors: regulated release by RIP or RUP. Curr Opin Cell Biol, 2001, 13: 344—
348
19 Liu J X, Srivastava R, Che P, et al. An endoplasmic reticulum stress response in Arabidopsis is mediated by proteolytic processing and
nuclear relocation of a membrane-associated transcription factor, bZIP28. Plant Cell, 2007, 19: 4111—4119
20 Iwata Y, Fedoroff N V, Koizumi N. Arabidopsis bZIP60 is a proteolysis-activated transcription factor involved in the endoplasmic
reticulum stress response. Plant Cell, 2008, 20: 3107—3121
21 Tajima H, Iwata Y, Iwano M, et al. Identification of an Arabidopsis transmembrane bZIP transcription factor involved in the endoplasmic
reticulum stress response. Biochem Biophys Res Commun, 2008, 374: 242—247
22 Searle I, He Y, Turck F, et al. The transcription factor FLC confers a flowering response to vernalization by repressing meristem
competence and systemic signaling in Arabidopsis. Genes Dev, 2006, 20: 898—912
23 Grennan A K. Variations on a theme. Regulation of flowering time in Arabidopsis. Plant Physiol, 2006, 140: 399—400
24 Boss P K, Bastow R M, Mylne J S, et al. Multiple pathways in the decision to flower: enabling, promoting, and resetting. Plant Cell, 2004,
16 Suppl: S18—S31
25 Putterill J, Robson F, Lee K, et al. The CONSTANS gene of Arabidopsis promotes flowering and encodes a protein showing similarities to
zinc finger transcription factors. Cell, 1995, 80: 847—857
26 Kardailsky I, Shukla V K, Ahn J H, et al. Activation tagging of the floral inducer FT. Science, 1999, 286: 1962—1965
27 Samach A, Onouchi H, Gold S E, et al. Distinct roles of CONSTANS target genes in reproductive development of Arabidopsis. Science,
2000, 288: 1613—1616
28 Corbesier L, Vincent C, Jang S, et al. FT protein movement contributes to long-distance signaling in floral induction of Arabidopsis.
Science, 2007, 316: 1030—1033
29 Lee H, Suh S S, Park E, et al. The AGAMOUS-LIKE 20 MADS domain protein integrates floral inductive pathways in Arabidopsis. Genes
Dev, 2000, 14: 2366—2376
30 Michaels S D, Amasino R M. FLOWERING LOCUS C encodes a novel MADS domain protein that acts as a repressor of flowering. Plant
Cell, 1999, 11: 949—956
31 Helliwell C A, Wood C C, Robertson M, et al. The Arabidopsis FLC protein interacts directly in vivo with SOC1 and FT chromatin and is
part of a high-molecular-weight protein complex. Plant J, 2006, 46: 183—192
32 Tyler L, Thomas S G, Hu J, et al. Della proteins and gibberellin-regulated seed germination and floral development in Arabidopsis. Plant
Physiol, 2004, 135: 1008—1019
33 Tamada Y, Yun J Y, Woo S C, et al. ARABIDOPSIS TRITHORAX-RELATED7 is required for methylation of lysine 4 of histone H3 and
for transcriptional activation of FLOWERING LOCUS C. Plant Cell, 2009, 21: 3257—3269
34 He Y. Control of the transition to flowering by chromatin modifications. Mol Plant, 2009, 2: 554—564
中国科学: 生命科学 2010 年 第 40 卷 第 5 期

417
35 Cao Y, Dai Y, Cui S, et al. Histone H2B monoubiquitination in the chromatin of FLOWERING LOCUS C regulates flowering time in
Arabidopsis. Plant Cell, 2008, 20: 2586—2602
36 Zhai J, Liu J, Liu B, et al. Small RNA-directed epigenetic natural variation in Arabidopsis thaliana. PLoS Genet, 2008, 4: e1000056
37 Clough S J, Bent A F. Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J, 1998, 16:
735—743
38 Su Z, Chai M F, Lu P L, et al. AtMTM1, a novel mitochondrial protein, may be involved in activation of the manganese-containing
superoxide dismutase in Arabidopsis. Planta, 2007, 226: 1031—1039
39 Nelson B K, Cai X, Nebenfuhr A. A multicolored set of in vivo organelle markers for co-localization studies in Arabidopsis and other plants.
Plant J, 2007, 51: 1126—1136
40 Jefferson R A. The GUS reporter gene system. Nature, 1989, 342: 837—838
41 Hoppe T, Matuschewski K, Rape M, et al. Activation of a membrane-bound transcription factor by regulated ubiquitin/proteasome-
dependent processing. Cell, 2000, 102: 577—586
42 Auld K L, Silver P A. Transcriptional regulation by the proteasome as a mechanism for cellular protein homeostasis. Cell Cycle, 2006, 5:
1503—1505