全 文 ：农业生物技术学报 JournalofAgriculturalBiotechnology 2007,15 (6):1074~1075
*基金项目:河北农业大学“9816”科技重点计划和河北农业大学博士基金资助。
**通讯作者。Authorforcorespondence.教授,主要从事植物分子病理学和真菌毒素方面研究。E-mail:
收稿日期:2006-11-26 接受日期:2006-12-23
·研究简报·
拟南芥抗致病疫霉突变体部分序列分析*
毛 娜,刘颖超,董金皋**
(河北农业大学真菌毒素实验室,保定071001)
关键词:拟南芥;致病疫霉;激活标签;TAIL-PCR
中国分类号:S188 文献标识码:A 文章编号:1006-1304(2007)-06-1074-02
PartialSequenceAnalysisofArabidopsisthalianaMutantsagainst
InfectionofPhytophthorainfestans
MAONa,LIUYing-chao,DONGJin-gao**
(MycotoxinLaboratory,AgriculturalUniversityofHebei,Baoding071001,China)
Keywords:Arabidopsisthaliana;Phytophthorainfestans;activatingtagging;TAIL-PCR
目前获得拟南芥(Arabidopsisthaliana)突变体的主要方
法是采用激活标签法 (activationtagging)(Kakimoto,1996;
Kardailskyetal.,1999)。本实验根据拟南芥突变体对致病疫霉
表现的抗性差异,利用 TAIL-PCR技术对感致病疫霉的拟南
芥突变体进行遗传分析,为克隆拟南芥抗致病疫霉基因提供
资料。
1 材料和方法
1.1 拟南芥与致病疫霉
拟南芥(Arabidopsisthaliana)的 Columbia生态型由美国
Danforth植物科学中心夏亦芥博士惠赠。拟南芥IGDB-XVE
突变体种子由中国科学院遗传发育研究所左建儒研究员惠
赠。致病疫霉(Phytophthorainfestans)由河北农业大学植物保
护学院朱杰华教授惠赠。
1.2 拟南芥感致病疫霉突变体的表型鉴定
选取拟南芥突变体的 4周龄植株,用微量移液器在叶片
背面接种,每叶片接种 5μL孢子悬浮液(4000个 /mL),置
于18℃光照培养室内保湿培养(每天8h光照,16h黑暗,湿
度大于 80%),以清水处理为空白对照,调查时如果只有坏死
斑点或无任何症状即为抗病,水渍状萎蔫病斑或病斑上有大
量菌丝和孢子囊产生者即为感病型。
1.3 拟南芥感致病疫霉突变体的细胞组织学鉴定
选取拟南芥 Col-0生态型和抗、感致病疫霉拟南芥突变
体的4周龄植株,在接种后取样。将拟南芥叶片在染色液(20
mL乙醇、10mL苯酚、10mL水、10mL83%乳酸和 10mg台
盘兰)中煮沸 2~5min后,用饱和水合氯醛(2.5g/mL)溶液脱
色,脱色后再用清水漂洗 3~4次,加入 50%的甘油,置显微镜
下观察。
1.4 拟南芥突变株的PCR鉴定和TAIL-PCR
拟南芥基因组DNA的提取采用CTAB法,根据nptⅡ基
因序列,合成1对引物:
5-TCGGCTATGACTGGGCACAACAGA-3
5-AAGAAGGCGATAGAAGGCGATGCG-3。
选择TAIL-PCR特异性引物:
LexA2:5-CTAATCGCATTATCATCCCCTCG-3;
LexA3:5-ATCATCCCCTCGACGTACTGTAC-3;
LexA4:5-CTGGTTTTATATACAGCAGTCGACG-3;
LexA5:5-AGTCGAGGTAAGATTAGATATGG-3。
随机简并引物为:
AD1:5-(AGCT)TCGA(G/C)T(A/T)T(G/C)G(A/TGTT-3;
AD2:5-NGTCGA(G/C)(A/T)GANA(A/T)GAA-3;
AD3:5-(A/T)GTGNAG(A/T)ANCANAGA-3;
AD4:5-AG(A/T)GNAG(A/T)ANCA(A/T)AGG-3。
1.5 DNA片段的回收、克隆和测序
取PCR产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳,回收所需片段。
根据 pMD18-Tvector试剂盒说明书进行 DNA克隆。利用
ABIPRISM377DNASequencer-E测序仪,对含有目的 DNA
片段的质粒进行测序。
第6期 毛 娜等:拟南芥抗致病疫霉突变体部分序列分析
2 结果和分析
2.1 拟南芥突变体感染致病疫霉的表型特征
拟南芥突变体接种病菌后症状表现不同。供试 258个突
变体与供试的 5个菌株互作,能够产生亲和反应的有 10个,
突 变 体 编 号 分 别 为 M31、M32、M34、M40、M113、M114、
M144、M243、M244和M246。
2.2拟南芥突变体感染致病疫霉的组织病理学特征
拟南芥接种致病疫霉 1d后,感病突变体叶片上的病菌
孢子已经萌发侵入;2d后,抗、感病突变体均出现不同程度
的细胞死亡情况,其中感病突变体出现大面积的坏死细胞
群,而抗病突变体死细胞群的数量少且面积很小(图 1);7d
时,抗病突变体上的病斑没有明显扩展,但感病突变体细胞
死亡则明显增加(图2)。
图1.拟南芥突变体接种致病疫霉后的症状
Fig.1.SymptomofArabidopsismutantsinoculatedbyP.infestants
A.野生型Col-0;B.抗病突变体;C.感病突变体。
A.WildtypeCol-0;B.Resistantmutants;C.Susceptiblemutants.
图2.拟南芥Col-0生态型和突变体接种致病疫霉后细胞特征
Fig.2.InteractionsymptomofCol-0ecotypeandmutantsof
ArabidopsisinfectedbyP.infestans
A.Col-0生态型;B.感病突变体;C.抗病突变体。A.Col-0ecotype;B.
Susceptiblemutants;C.Resistantmutants.Arowindicatesdeadcels.
2.3 拟南芥突变体的PCR鉴定和TAIL-PCR扩增
拟南芥突变体的 PCR鉴定结果发现,以突变体基因组
DNA为模板的 PCR反应能扩增到 1条大小约 750bpDNA
片段,初步证明这些突变体的基因组中确实已经插入了
T-DNA序列及nptⅡ基因(图3)。
用筛选得到的拟南芥突变体的基因组 DNA为模板,以
4个简并引物和特异引物组成的引物组合进行 TAIL-PCR扩
增。发现:特异引物(Lex2、Lex4和 Lex5)和(Lex3,Lex4和
Lex5)与简并引物 AD1,AD2和 AD4扩增到明显条带(500
bp左右)(图4),AD3没有得到明显条带。成功扩增到特异条
带的 8个突变体分别为:M31、M32、M34、M40、M113、M
144、M244和M246。
图3.拟南芥感病突变体nptⅡ基因PCR产物的电泳图谱
Fig.3.TheelectrophoresisofPCRproductsfrom
nptⅡofArabidopsissusceptiplemutants
M,makerDL2000;1~9,突变体;10,Col-0生态型。
M,marker;1~9,mutants;10,Col-0ecotype.
取第2轮和第3轮产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。发现
第 3轮扩增条带比第 2轮的条带小 100bp左右(图 4),说明
相应条带确实是 PCR的特异扩增产物。对所获得的差异表
达基因片段进行测序,经过 BLAST比对发现,片段 34号
T-DNA插入位点位于基因 AT3G13620.1的 133bp左右,处
在该基因第1个外显子上。该基因属于氨基酸透性酶家族蛋
白。片段246号T-DNA插入位点位于基因AT5G24830.1的
2672bp左右,处在该基因第5个外显子上。该基因属于PPR
模体蛋白(pentatricopeptiderepeatcontainingprotein)。
图4.第2轮和第3轮Tail-PCR产物的凝胶电
泳图谱
Fig.4.TheelectrophoresisoftheTAIL-PCR
products
1,第2轮扩增产物;2,第3轮扩增产物。
1and2,theproductsofsecondandthirdTAIL-PCR
cycle,respectively.
3 讨论
T-DNA在基因组上的整合是一个比较复杂的问题。本研
究发现,测序的 8个 TAIL-PCR第 3轮扩增产物中,只成功
获得2个拟南芥侧翼序列,有6个测序结果是载体序列;造
成上述结果的原因可能是 DNA中混有质粒,或是质粒没插
入拟南芥染色体中而独立存在于突变体细胞中。
参 考 文 献
KakimotoT.CKI1,ahistidinekinasehomologimplicatedincytokinin
signaltransduction(J).Science,1996,274:982~985
KardailskyI,ShuklaVKandAhnJH.Activationtaggingofthefloral
inducerFT(J).Science,1999,286:1962~1965
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