全 文 ：拟南芥色氨酸生物合成途径中 PAI 基因编码区
5′端序列对基因表达的影响＊
何奕昆＊＊　刘新仿　李家洋＊＊＊
(中国科学院遗传研究所植物生物技术开放实验室 ,北京 100101;De Montfort大学
Norman Borlauy 植物研究所 ,中国中心 ,北京 100101)
摘要　　将 3个非等位 PAI 基因的启动子与其编码区 5′端序列及 GUS 报告基因拼
接成表达质粒 ,并转化拟南芥.GUS 活性分析表明 , PAI 基因编码区 5′端序列对维持
PAI 启动子所驱动的 GUS 活性是必须的 , 有无该序列对 GUS 活性影响极大 , 在
PAI1 和PAI3 中相差 60 ～ 100倍 , PAI2 中相差 1倍左右.GUS 组织化学定位有相似
结果 , 具 5′端序列时 ,PAI 启动子所驱动的GUS 在植株的不同组织器官中有不同程
度的表达 ,在叶片的叶肉细胞 、保卫细胞中表达 , 但在无叶绿体的表皮细胞中不表
达.因此认为 PAI 基因的 5′端片段所编码的多肽确有 PTP 的功能 , PAI 基因产物主
要在质体(叶绿体)中表现出活性.
关键词　　磷酸核糖氨基苯甲酸同分异构酶　色氨酸生物合成途径　基因表达调控　质体导入序列
拟南芥
真核细胞的正常生命活动依赖于各种代谢过程协调进行 , 锚定在不同亚细胞区域的酶的
协调工作则是整个生命活动的基础.高等植物细胞的细胞核是遗传信息贮存和表达的最重要
场所.叶绿体 、线粒体有一定自主性 , 含有自己的基因组 , 能合成少数蛋白.绝大数多肽由
核遗传信息控制 , 在细胞质中合成 , 然后输送到叶绿体 、线粒体等靶细胞器 , 最终形成有一定
功能的成熟蛋白.研究多肽靶向运输对于深入了解多肽的结构与功能 、功能蛋白的定向表达 、
以及酶活性所需的亚细胞环境等具有重要意义 ,因而成为分子生物学 、生物化学等领域的研究
热点[ 1 ,2] .揭示多肽转运机理的研究源于方法学上的突破.首先是“小麦胚芽非细胞体系”的
创建 , 为体外翻译蛋白创造了条件[ 3] .其次是离体完整叶绿体的分离 , 并可利用光能进行蛋
白质和 RNA的合成[ 4] .应用上述实验系统 ,对光合作用过程中的核酮糖 1 ,5-二磷酸羧化酶/
加氧酶(Ribulose-1 ,5-bisphosphatecarboxylase/oxygenase , Rubisco EC4.1.1.39)的小亚基进行了深
入研究 ,确定其多肽 N端 44个氨基酸在成熟过程中被切除 , 切除的部分被命名为“叶绿体转
运多肽”(Chloroplast transit peptide , CTP;或称为 Plastid transit peptide ,PTP)[ 5] , 也称“质体导入序
列”(Plastid transit sequence ,PTS).
　　　1998-03-05收稿 , 1998-11-13收修改稿
　　＊国家杰出青年基金 、中国博士后科学基金资助项目
　 ＊＊现在通讯地址:首都师范大学生物系
＊＊＊联系人
中　国　科　学　　　(C 辑)　　　　　　 　
第 29 卷　第 3期 SCIENCE IN CHINA(Series C)　 1999 年 6月
　　高等植物拟南芥植物基因组 PAI 基因有3个拷贝 , 其中 PAI1 和PAI3 定位于第1染色体 ,
PAI2 定位于第 5染色体[ 6] .DNA测序结果显示 , PAI1 和PAI2 基因的同源性高达 99%, 所编
码的多肽只有 1个氨基酸不同 , 即在第 136位的氨基酸 , PAI1 为 Glu , PAI2 为 Asp.PAI3 与
PAI1 或PAI2 的同源性为 90%, 所编码的多肽与 PAI1 , PAI2 相比分别有 18 ,19个氨基酸不同.
另外 , PAI 基因有以下值得关注的结构特点:与色氨酸合成途径中其他酶相似 , PAI 基因编码
的多肽N端有 60个左右的氨基酸序列在微生物相应蛋白中不存在.并且 , 在N-端 65个氨基
酸中 , PAI1 和PAI2 有 15个羟基氨基酸(Ser 和 Thr), 12个带正电荷氨基酸(Arg , His和 Lys),
两者合占比例为 40%左右;PAI3 有 17个羟基氨酸 , 13个带正电荷氨基酸 , 二者合占比例为
40%.富含多羟基氨基酸和带正电荷氨基酸被认为是识别 PTP 结构的标志.离体合成的
PAI1 前体多肽能定向转入离体叶绿体 , 切掉 N-端 46个氨基酸后产生成熟 PAI 多肽[ 7] .但
是 ,在活体细胞中 ,含有 PTP 的前体多肽能否靶向转入叶绿体?如果细胞中没有靶目标叶绿
体 , 前体多肽能否被转化成功能蛋白? PAI 基因编码N端多肽的 5′端序列对 PAI 基因的转录
和翻译有无影响 ?我们将 PAI 基因的启动子与报告基因GUS 拼接 ,构建成嵌合基因表达载
体 ,通过对转基因植物 GUS 活性的分析来推测PAI 基因 5′编码端序列对 PAI 基因表达的影
响.
1　材料与方法
1.1　材料与试剂
拟南芥生态型 Columbia (Col-0), 栽培用蛭石∶营养土(1∶1)混合而成 , 用稀释 4 倍的
PNS[ 6]培养基从栽培钵底部浸泡灌溉.培养室温度 21 ～ 23℃, 连续光照 , 强度 80 ～ 100 μmol·
m-2·s-1.
DNA限制性内切酶为 Biolabs产品 , T4DNA连接酶 、抗生素 、质粒提取试剂盒 、DNA探针放
射性标记试剂盒为 Promega 产品.1 kb DNA ladder 购自 Gibico BRL 公司.Tryptone 和 Yeast
extract为 OXOID产品.HybondTMN+尼龙膜 、SDS 、琼脂糖 、琼脂为 Amersham产品.X-光片为富
士产品.其他化学试剂为 Sigma或国产分析纯产品.
1.2　表达质粒的构建
分别将 PAI1 , PAI2 与PAI3 的启动子序列(含有起始密码子 ATG)与报告基因 GUS 拼接 ,
构建成表达质粒 pJL238 , pJL240 与 pJL242(图 1).同时 ,再将 PAI 基因编码区 5′端序列(300
bp ,含编码多肽N端的PTP 序列和2个内含子)插入 PAI 的启动子与GUS 之间 ,构成如图 1所
示的表达质粒 pJL237 , pJL239与 pJL241.为了确保融合基因只能够以 PAI 基因本身的起始密
码子ATG起始合成融合蛋白 ,通过PCR方法将 GUS 基因的起始密码子ATG转变为CTG 密码
子(图 1)[ 8] .并以含将 CaMV的 35S 启动子与 GUS 报告基因的 pBI121质粒作为对照系统(图
1).
1.3　拟南芥 DNA提取
取生长3周的拟南芥新鲜叶片 100 mg , 加入 65℃的 DNA提取液 200μL , 用手持钻于 1.5
mL 离心管内磨匀 , 再加入 500μL提取液 , 混匀后于 65℃水浴 40 min , 加入 750μL 氯仿:异戊
醇(24∶1)抽提除去多糖蛋白等杂物 , 10 000 r/min离心 5 min.取上清液 , 加入等体积的异丙
醇 , 轻轻颠倒几次混匀 , 10 000 r/min离心10 min , 用 70%冷却乙醇洗沉淀 , 风干 , 加入 50μL
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超纯水溶解 , -20℃保存备用.DNA提取液主要由 3种储液混合而成.储液 a:每升含山梨醇
63.77 g , Tris 12.1 g , pH8.2 , EDTA 1.861 g.储液 b:每升含 200 mmol Tris , pH7.5;50 mmol
EDTA;2 mol NaCl;20 g CTAB.储液 c:5%N-月桂酰肌氨钠(Sarkosyl).使用时按 a∶b∶c=1∶1∶
0.4混合 , 每升再加入亚硫酸钠 3.8 g , 混匀后即可使用.
图 1　pJYL236-pJYL242 表达质粒的结构
1.4　GUS 活性测定与组织化学定位
GUS 活性测定参照 Jefferson[ 9]的方法 , 略作修改后按以下程序进行.100 mg 新鲜叶片 ,
加 500 μL提取缓冲液 (50 mmol/L Na2HPO4 ,pH7.0 , 10 mmol/L Na2EDTA , pH8.0 , 10 mmol/L β-
疏基乙醇 , 0.1%TritonX-100 , 0.1%Sarkosyl)研磨 , 10 000 r/min离心5 min ,取上清液 , 现用或
贮存于-70℃冰箱备用.取 50 μL 提取液 , 加 60 μL 反应液(1 mmol/L 4-Methylumbelliferyl-β-
glucuronide溶解于提取液中), 37℃反应 30 min后立即加入 1.4 mL 反应停止液 (0.2 mol/L
Na2CO3)终止反应.用F-4010(HITACHI)型荧光分光光度计测定 E365/ 455值.根据反应产物 MU
含量换算成 GUS 活性单位:pmol·min-1·mg-1.蛋白含量测定参照 Bradford[ 10]的方法.
GUS 组织化学定位参考文献[ 11]方法 , 并作改良:取材※反应液中 37℃温育 2 ～ 6 h※
70%乙醇脱叶绿素 , 室温 5 h , 重复几次 , 直到绿色完全去除※观察 , 摄影.反应液组成(每
升):100 mmol NaPO4 缓冲液 , pH7.0;10 mmol EDTA;0.5 mmol KFerricyanide;0.5 mmol
KFerrocyanide , ;0.1%Triton X-100;1.0 mmol X-Gluc.以上组分分开贮存于-20℃冰箱 , 用时
混合 , 根据使用量加入 X-Gluc.
第 3 期 何奕昆等:拟南芥色氨酸生物合成途径中 PAI 基因编码区 5′端序列对基因表达的影响 305　
1.5　其他方法与技术
质粒提取 、酶切 、回收 、连接 、大肠杆菌 XL1-blue 菌株和农杆菌 LBA4404 感受态细胞的制
备及 Southern印迹等基本技术均参考《分子克隆实验指南》或成品试剂盒的要求进行.拟南芥
的幼根法转化按文献[ 12]方法进行.
2　实验结果
2.1　单位点插入转基因植物的获得
为了研究拟南芥 Col-0生态型 PAI 基因产物是否被导入叶绿体 ,我们分别构建了 PAI 基
图 2　转基因植株中的GUS 活性
因的启动子与GUS 基因拼接成的 6个表达质粒 ,用含 CaMV 35S 启动子的 pBI121表达质粒作
为对照系统(图 1).用农杆菌介导法转化拟南芥 ,共获得 100余株独立的转基因植物 ,自花授
粉后代经卡那霉素抗性分析表明 ,大约有 1/3的植株具有单个位点插入(其表型为 3KanR∶
1KanS), 选留其纯合株系 ,经 PCR和 Southern blot分析 ,选出具有插入完整表达片段的转基因
植物作为分析 GUS 活性的材料(表 1).
表 1　用于 GUS 活性分析的转基因植株及转化质粒
编号 表达载体结构 具单位点插入的株系数
JLT 236 35 S 启动子-GUS 5
JLT 237 PAI3 启动子-PTP-GUS 8
JLT 238 PAI3 启动子-GUS 8
JLT 239 PAI2 启动子-PTP-GUS 6
JLT 240 PAI2 启动子-GUS 7
JLT 241 PAI1 启动子-PTP-GUS 5
JLT 242 PAI1 启动子-GUS 7
2.2　PAI N端多肽的功能
在完全展开的成熟叶片中(实验中均取第 8 ～ 10真叶), 含有 PAI 基因编码区 5′端序列的
JLT237 , JLT239和 JLT241植株表皮层的保卫细胞和叶肉细胞由于存在叶绿体 , GUS 活性较高 ,
这些细胞出现较深蓝色(图版Ⅰ-4 ,5 ,附本刊后 ,下同), 而在 JLT238 , JLT240和 JLT242植株中 ,
由于转入的表达载体缺乏 PAI 基因编码区 5′端序列 ,保卫细胞和叶肉细胞则均不出现蓝色.
该结果首次表明 ,在拟南芥含有叶绿体的活体细胞中 , PAI 基因编码区5′端序列对维持GUS活
性必不可少 ,它所编码的 N端多肽确具有 PTP 的功能.
2.3　PAI基因编码区 5′端序列对 PAI高表达的作用
在 JLT237和 JLT241转基因植株中 , GUS 活
性的均值比不含有 PAI 基因编码区 5′端序列的
JLT238和 JLT242 转基因植株高出 60 ～ 100 倍 ,
PAI2 的差异较小 , 高出 1倍左右(图 2).尽管如
此 , 用数学统计方法分析 , PAI2 有无基因编码区
5′端序列的 GUS 活性差异也达到极显著水平.
PAI 基因编码区 5′端序列对维持 PAI 基因的高表
达是必须的.
从 GUS 活性的组化定位结果看 , JLT237 ,
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JLT239和 JLT241植株(萌发 3 ～ 4 d)几乎所有部位均有明显蓝色(图版 Ⅰ-1), 而 JLT238 ,
JLT240和 JLT242全株几乎无蓝色 , 仅在茎尖基部和下胚轴基部出现很小蓝色斑点(图版 Ⅱ-
1).值得注意的是在 JLT238 , JLT240和 JLT242植株成熟花药中却出现显著蓝色(图版 Ⅱ-2).
JLT240植株普遍具有与 JLT239相似分布特征的蓝色 , 只是蓝色较浅.GUS 组化显色的程度
与GUS 活性测定结果具有很好的一致性.
图 3　PAI2 (JLT239)转基因植物的 DNA 印迹分析
转基因植物的 DNA 分别以 Sal Ⅰ/ EcoR Ⅰ(a), EcoRⅠ
(b)或 Hind Ⅲ(c)限制性内切酶酶切 , GUS 基因为探针.
样品 1 , 4, 7为 JLT239-8;样品 2, 5 , 8为 JLT239-11;样
品 3 , 6 , 9为 JLT239-36
2.4　转基因植株的 Southern blot检测
经连续多代卡那霉素筛选 , 自花受粉繁育第
4代后 , 得到 100 多个独立转基因株系(lines).
经DNA印迹(Southern blot)分析 , 除 2个株系中
未检测出插入片段 , 1个株系中的插入片段变小
以外 , 其余株系均有完整插入片段.为了排除插
入点位置效应的干扰 , 我们用 GUS 为探针 ,对
JLT239转基因系列 3个不同株系的 DNA 插入情
况进行了 DNA印迹分析.如图 3所示 ,转基因植
株DNA以 Sal Ⅰ/EcoRⅠ双酶切 ,只有单一的片
段存在 ,表明这些转基因植株含有完整的插入片
段.分别用 Hind Ⅲ和 EcoRⅠ酶切对应的 DNA ,
结果显示不同株系中插入片段的位点不同 , 而它
们的 GUS 组化定位模式相同 , 这就排除了“插入
点位置效应”的可能.
3　讨论与结语
3.1　PTP对 PAI 基因表达的影响
对拟南芥 PAI 氨基酸序列分析 ,发现 PAI 基因编码的多肽N端(65个氨基酸)富含羟基氨
基酸和带正电荷氨基酸[ 6] , 具有 PTP 的特征.与色氨酸合成途径中其它酶相似 , 在非绿色生
物 ,如酵母和大肠杆菌中 , PAI 基因编码的多肽 N端缺乏相应氨基酸序列.另外 ,离体合成的
PAI1 前体多肽能定向转入离体叶绿体 , 并在离体叶绿体中检测到切掉了N 端 46个氨基酸后
产生的成熟 PAI 多肽 , 该实验证明了 PAI 的 N端序列在离体的非细胞系统中具有 PTP功能.
然而 ,没有实验证据显示 PAI 或色氨酸合成途径中其他酶在活体细胞的叶绿体中具有活
性[ 13] .本实验中 ,我们在 PAI 基因启动子后接上该基因编码的 5′端序列(包含编码推测的N
端PTP 序列和 2个内含子),再与 GUS 报告基因拼接成融合基因表达载体 ,分析转基因植株表
明 ,在遗传背景和生长环境完全一致 、并含有叶绿体的叶肉细胞或叶片保卫细胞中观察到
GUS 表达所产生的蓝色 ,而叶绿体具有更深的蓝色(图版 Ⅰ-4 ,箭头),在没有叶绿体的叶片表
皮细胞中却观察不到 GUS 表达所产生的蓝色.该结果表明 ,在 PAI 基因启动子驱动下合成的
PTP-GUS 融合多肽可在活体细胞中转入叶绿体 , GUS 在叶绿体中催化 X-gluc 生成蓝色产物 ,
PAI 基因编码多肽的N端序列确具有 PTP 功能 ,并在活体细胞中可将前体多肽转入叶绿体.
值得注意的是 ,在小孢子发育过程中 , GUS 活性似乎不受 PAI 基因编码区 5′端序列的影
响.随着小孢子发育进程 , GUS 不但在 JLT237 , JLT239和 JLT241(含有 PAI 基因编码区 5′端序
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列),而且在 JLT238 , JLT240和 JLT242植株(不含 PAI 基因编码区 5′端序列)的小孢子中均有较
强的表达(图版 Ⅰ-2 ,3及图版 Ⅱ-2).该结果暗示在小孢子发育过程中可能会产生促进 GUS
基因表达的影响影响因子.
3.2　PAI基因编码区 5′端序列对 PAI基因表达的影响
PAI 基因编码区 5′端序列包含了编码 PTP 和 2个内含子(1和 2)的序列[ 6] .图 2结果显
示 , JLT236植株由于 35S 启动子驱动 , GUS 活性较高.JLT237与 JLT238相比 , 前者的插入片
段中包含 5′端编码序列 , 后者是 PAI3 启动子直接GUS 基因 , 二者的 GUS 活性相差近 100倍 ,
JLT241和 JLT242间也相差 60倍左右.出人意料的是 JLT239和 JLT240之间的 GUS 活性相差
仅1倍左右.该结果表明 , PAI 基因编码区 5′端序列对 3个非等位 PAI 基因的启动子活性具
有不同程度的影响.5′端序列对 PAI2 基因表达的影响不如对PAI1 和PAI3 基因表达的影响那
么强烈.GUS 组织化学染色深浅与GUS 活性强弱具有一致的结果.
据以上结果可以认为 , PAI 基因编码区 5′端序列不只是编码决定多肽靶向运输的 PTP ,
可能对 PAI 基因的表达具有重要的调节功能.35S 启动子来源于 CaMV基因[ 14] , CaMV 基因
中既无编码PTP的序列也无内含子 , 该启动子与 GUS 构成的融合基因中不含PAI 基因编码区
5′端序列 , 按常规也不会对启动子所驱动的基因表达产生明显影响 ,故在有无叶绿体的叶片
保卫细胞或表皮细胞中均可表达 ,显示出蓝色(图版 Ⅰ-6).而 PAI 基因则不同 , 不含基因编
码区 5′端序列的融合基因几乎不表达 GUS 活性 , 5′端序列很可能影响融合基因的转录或相应
mRNA的稳定性.对拟南芥中另一个酶 PAT(催化色氨酸合成反应的第 2步)的详细研究发
现 , 基因编码区 5′端序列的内含子对 PAT 基因表达有重要的调节作用[ 15] .内含子对基因表
达的增强作用在玉米和拟南芥其他基因中也观察到类似结果.当然.要阐明 PAI 基因编码
区5′端序列中究竟是内含子或是编码 PTP的序列对 PAI 基因具有调控功能还需进一步实验.
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