全 文 ：HEREDITAS (Beijing) 2012年 3月, 34(3): 348―355
ISSN 0253-9772 www.chinagene.cn 研究报告
收稿日期: 20110703; 修回日期: 20110803
基金项目: 山西省国际科技合作计划(编号：2009081005), 山西省留学人员科技活动项目择优资助项目, 山西省回国留学人员科研资助项目(编
号：201003)和太原市科技明星专项(编号：11014902)资助
作者简介: 李文超, 博士研究生, 专业方向：植物分子遗传学。E-mail: lwch.001@163.com
通讯作者: 赵淑清, 教授, 博士生导师, 研究方向：植物分子遗传学。E-mail: shuqing@sxu.edu.cn
网络出版时间: 2012-1-11 14:35:52
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20120111.1435.001.html
DOI: 10.3724/SP.J.1005.2012.00348
人工 microRNAs对拟南芥 At1g13770和 At2g23470基
因的特异沉默
李文超, 赵淑清
山西大学生物技术研究所,化学生物学与分子工程教育部重点实验室, 太原 030006
摘要: DUF647 (Domain of unknown function 647) 蛋白家族是在真核生物中广泛存在的、高度保守的蛋白家族。
拟南芥中该基因家族共有 6 个成员, 迄今为止拟南芥 DUF647 家族中 4 个成员的功能尚不清楚。文章以拟南芥
内源 MIR319a 前体为骨架 , 构建了敲减 DUF647 家族中 2 个基因 At1g13770 和 At2g23470 表达的人工
microRNAs(Artifical microRNAs, amiRNAs)。利用 WMD(Web microRNA designer)平台设计分别靶向 At1g13770
和 At2g23470 基因的 amiRNAs 序列, 通过重叠 PCR 置换拟南芥 MIR319a 前体序列。构建融合 amiRNAs 前体
的植物表达载体 pCHF3-amiRNAs, 在农杆菌介导下转化拟南芥。RT-PCR 分析表明, amiRNAs 能够显著抑制
At1g13770 和 At2g23470 基因的表达, 获得了抑制效果明显的转基因株系。At2g23470-amiRNA 转基因植株
At2g23470 转录水平的下调导致育性严重下降。文章为进一步研究这两个基因的功能奠定了良好的基础。
关键词: 拟南芥; DUF647 基因家族; 人工 microRNA; 基因沉默
Specific gene silencing of At1g13770 and At2g23470 by artificial mi-
croRNAs in Arabidopsis
LI Wen-Chao, ZHAO Shu-Qing
Key Laboratory of Chemical Biology and Molecular Engineering of Ministry of Education, Institute of Biotechnology, Shanxi University,
Taiyuan 030006, China
Abstract: DUF647 (domain of unknown function 647) protein family is found in diverse eukaryotic organisms and
highly conserved in eukaryotes. It has 6 members in Arabidopsis genome. So far, the function of 4 members of Arabidopsis
DUF647 family is unknown. In this report, using an endogenous Arabidopsis MIR319a precursor as the backbone, we con-
structed two artificial microRNAs (amiRNAs) to knock down the expression of two DUF647 family genes At1g13770 and
At2g23470. Using the WMD (Web microRNA Designer) platform, we designed two amiRNAs targeting At1g13770 and
At2g23470 genes, respectively. Both amiRNAs sequences were engineered into the MIR319a precursor using overlapping
PCR and the amiRNAs backbones were transferred into the binary vector pCHF3. The resulting plasmids that harbor
第 3期 李文超等: 人工 microRNAs对拟南芥 At1g13770和 At2g23470基因的特异沉默 349
amiRNAs stem loop fragments were transformed into Arabidopsis by Agrobacterium-mediated floral diping. Upon consti-
tutive expression of these two amiRNAs, the target genes were efficiently down-regulated in transgenic line. The decreased
level of At2g23470 transcript in At2g23470-amiRNA transgenic plants resulted in severe sterility. This work will facilitate
the functional analysis of At1g13770 and At2g23470 genes in Arabidopsis growth and development.
Keywords: Arabidopsis; DUF647 gene family; artificial microRNAs; gene silencing
DUF647 (Domain of unknown function 647)蛋白
家族是在真核生物中广泛存在、高度保守的蛋白家
族。在拟南芥中, 有 6个 DUF647蛋白家族成员, 分
别由 At2g31190、At3g45890、At1g13770、At5g01510、
At5g49820和 At2g23470基因编码。通过 T-DNA 插
入突变、快中子诱变以及 EMS 诱变筛选获得了拟
南芥 DUF647 家族基因 At3g45890(rus1)和 At2g31190
的突变体(rus2/wxr1)[1~3]。功能鉴定显示, RUS1通过
感觉低通量率的 UVB 参与拟南芥幼苗的早期形态
建成和发育, 而 RUS2 与 RUS1 共同作用于根 UVB
感受途径[1, 2]。最新的研究表明, RUS2/WXR1对植物
生长素的极向运输和保持根部正常水平的 PIN 蛋白
是必须的。在 wxr1幼苗中, 生长素的极向运输减少。
此外, 在 wxr1 根部, 生长素运输蛋白 PIN 的水平降
低[3]。不过, rus2/wxr1 突变体的生长素运输/分配缺
陷以及 UV高度敏感似乎都是由于细胞调控(可能是
蛋白运输)缺陷引起的, 因为WXR1是一个质体蛋白,
而 PIN是一个质膜蛋白。质体蛋白 WXR1功能的缺
失如何影响到质膜蛋白的水平 , 只有等得到
RUS1/WXR1 和其他 DUF647 蛋白家族成员的生化
功能信息才能解答。研究 DUF647 蛋白家族中其他
成员的功能, 对于全面理解 DUF647 家族蛋白的作
用非常必要。
MicroRNAs (miRNAs)是由核基因编码、具有典
型发夹结构的转录本加工生成、大约 21个核苷酸长
的小 RNAs 分子。miRNAs 通过序列特异的碱基配
对切割靶标 mRNA 或者抑制其翻译, 从而控制靶基
因的表达[4~6]。植物可以利用高度保守的以及种特异
的 miRNA控制一系列的生物过程[5]。但天然的植物
miRNAs 通常以高度的序列互补影响靶基因, 因此,
天然植物 miRNAs 影响到的靶基因数目较少[7]。近年
来, 人工 microRNAs (Artifical microRNAs, amiRNAs)
技术发展迅速, 先后在拟南芥、水稻、苔藓和衣藻
等植物中得到了成功的应用 [7~11]。简单来说 ,
amiRNAs 是通过置换内源 miRNAs 前体的 miRNA/
miRNA*为 amiRNA/amiRNA*, 而保留 miRNAs 骨
架中的碱基配对和错配模式而产生。这样, amiRNAs
可以设计成靶向任何一个感兴趣的基因或同时靶向
某几个相关的基因。amiRNAs技术最大的优点是特
异性高、作用谱广和沉默效应稳定。因此, amiRNAs
技术正成为基因功能分析的一种有效手段。
本研究针对拟南芥 DUF647 家族中另外 4个基
因功能未知的情况 , 利用人工 microRNAs 技术对
DUF647 家族 中 其 中 两 个 基 因 At1g13770 和
At2g23470 进行了特异沉默。以 MIR319a 前体分子
作为骨架, 替换 miRNA序列为 amiRNA序列, 构建
高效表达载体分别沉默 At1g13770 和 At2g23470基
因 , 旨在得到干扰这两个基因表达的转基因株系 ,
从而为研究这些基因的功能奠定基础, 这对于了解
DUF647 家族基因在拟南芥生长发育中的作用具有
重要的意义。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 菌株和质粒
大肠杆菌(Escherichia coli)Top10和根癌农杆菌
(Agrobacterium tumefaciens)AGL1由本实验室保存。
质粒 pRS300和双元载体 pCHF3由美国 Salk研究所
郑祖宇博士惠赠。
1.1.2 植物材料与生长条件
本研究所用拟南芥(Arabidopsis thaliana)品系均
来自 Columbia (Col-0)生态型。生长条件：光周期 16
h 光照/ 8 h 黑暗; 光照强度 120 μmol/m2·s1、相对湿
度 50%~70%; 温度 22±2℃。
350 HEREDITAS (Beijing) 2012 第 34卷
1.2 方法
1.2.1 人工 microRNA 的分子设计及其克隆
利用 WMD(http://wmd2.weigelworld.org)平台设
计靶向拟南芥 At1g13770、At2g23470基因的 amiRNAs
序列(表 1)及产生这些 amiRNAs的特异引物Ⅰ、Ⅱ、
Ⅲ、Ⅳ(表 2)。另外两个通用引物 A和 B与 MIR319a
外围的 pRS300质粒配对, 其序列为:
A: 5′-CTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAAC-3′;
B: 5′-GCGGATAACAATTTCACACAGGAAACA
G-3′。
以质粒 pRS300 为模板, 通过重叠 PCR 把质粒
pRS300中内源 miR319a序列的 20个核苷酸 miRNA
序列置换为 21个核苷酸的 amiRNA序列[7]。在第一
轮的 PCR中首先扩增出 amiRNAs 前体的 5′臂(片段
a)、中心环(片段 b)和 3′臂(片段 c), 产物 a、b、c利
用 2％琼脂糖凝胶电泳纯化。然后以这 3 个片段的
DNA混合物为模板, 以 A和 B为引物扩增覆盖整个
前体的片段 d。利用 1％琼脂糖凝胶电泳纯化片段
d, 连接至克隆载体 pCR@-Blunt(Invitrogen), 转化
感受态 E. coli Top10。挑取阳性克隆, 酶切鉴定, 并
测序确认。
1.2.2 植物表达载体 pCHF3-amiRNAs 的构建
BamHI 和 SalI 双酶切经测序正确的包含
amiRNAs 的质粒 DNA 和 pCHF3 载体, 回收目的片
段, 用 T4 DNA 连接酶(Promega)连接, 转化感受态
E. coli Top10, 挑选阳性克隆, 提取质粒 DNA, 酶切
鉴定。将植物表达载体分别命名为 pCHF3-amiR-
At1g13770和 pCHF3-amiR-At2g23470。amiRNAs表
达载体的构建如图 1所示。
1.2.3 拟南芥转基因植株的获得
采用液氮冻融法 [12]将 pCHF3-amiR-At1g13770
和 pCHF3-amiR-At2g23470 质粒分别转入农杆菌
AGL1, 在含(Amp 50 mg/L、Spec 100 mg/L)抗性的
LB固体培养基上筛选阳性克隆, 并用 PCR 法鉴定。
利用农杆菌介导的花苞浸染法[13]转化野生型拟
南芥。将转化后收集的 T1 代种子在含有 100 mg/L
卡那霉素的 1⁄2 MS 固体培养基平板上进行抗性筛
选。转基因幼苗具有卡那霉素抗性, 在抗性平板上
能够正常生长, 叶片为绿色, 而非转基因幼苗由于
表 1 amiRNA 序列及相应的靶基因
amiRNA名称 预测的成熟 amiRNA序列(5′→3′) 靶向基因
At1g13770-amiRNA TCACACATGATTAAAGCGGTT At1g13770
At2g23470-amiRNA TGACAAATAACGATGCCCCAT At2g23470
表 2 产生 amiRNA 的引物序列
引物序列(5′→3′)
amiRNA
I II III IV
At1g13770-am
iRNA
GATCACACATGATTAA
AGCGGTTTCTCTCTTT
TGTATTCC
GAAACCGCTTTAATCATG
TGTGATCAAAGAGAATC
AATGA
GAACCCGCTTTAATGAT
GTGTGATCACAGGTCGT
GATATG
GATCACACATCATTAA
AGCGGGTTCTACATAT
ATATTCCT
At2g23470-am
iRNA
GATGACAAATAACGAT
GCCCCATTCTCTCTTT
TGTATTCC
GAATGGGGCATCGTTATT
TGTCATCAAAGAGAATC
AATGA
GAACGGGGCATCGTAAT
TTGTCATCACAGGTCGT
GATATG
GATGACAAATTACGAT
GCCCCGTTCTACATAT
ATATTCCT
图 1 amiRNAs表达载体的构建示意图
第 3期 李文超等: 人工 microRNAs对拟南芥 At1g13770和 At2g23470基因的特异沉默 351
没有卡那霉素抗性发生黄化。待平板上的绿苗长出
4片真叶时, 将其转入混有蛭石的营养土中, 覆膜保
湿一周 , 然后去除塑料膜 , 继续培养至成熟 , 单株
收取种子。
采用 CTAB 法抽提转基因植株 DNA[14], 根据
MIR319a 前体骨架的序列设计引物, 引物序列为：
5′-GGTACCGGGCCCCCCCTCGAGGTCGA-3′和 5′-
GGATCCCCCCATGGCGATGCCTTAAAT-3′, PCR鉴
定整合有 amiRNA表达载体的转基因株系。PCR扩增
程序为：94℃预变性 3 min; 然后 94℃变性 30 s, 65℃
复性 30 s, 72℃延伸 30 s, 35个循环; 最后 72℃延伸
5 min。扩增产物在 1.5%琼脂糖凝胶上电泳检测。
1.2.4 转基因拟南芥植株中目的基因的转录分析
取培养 21 d 的野生型拟南芥 col、At1g13770-
amiRNA 和 At2g23470-amiRNA 转基因植株的叶片,
用 TRIzol 试剂(Invitrogen, 目录编号 15596-026)提
取 RNA。用 DNase I(TaKaRa)去除 DNA污染。按照
SuperScript III cDNA 第一链合成系统(Invitrogen,
目录编号 18080-051)试剂盒说明书进行 RT-PCR。以
Tublin作为内参。RT-PCR引物序列见表 3。PCR扩增
程序为：94℃预变性 3 min; 然后 94℃变性 30 s, 57℃
复性 30 s, 72℃延伸 30 s, 30个循环; 最后 72℃延伸
5 min。PCR产物在 2%琼脂糖凝胶上电泳检测。
2 结果与分析
2.1 人工 microRNAs载体的构建及鉴定
利用重叠 PCR分别扩增包含 At1g13770-amiRNA
和 At2g23470-amiRNA 的 amiRNA 前体序列。在第
一轮的 PCR 中分别用 At1g13770-amiRNA 和
At2g23470-amiRNA特异引物扩增得到了大小为 272
bp、171 bp、298 bp片段 a、b和 c(图 2A)。以这 3
个 DNA 片段的混合物作模板, 以 A 和 B 为引物扩
增得到了 701 bp 的片段, 其大小与预期相一致(图
2B)。将纯化后的 PCR产物 d克隆到 pCR@-Blunt 载
体。提取质粒 DNA, 经过 EcoRI酶切得到大小为 3.5
kb (pCR@-Blunt 载体)和 551 bp(部分 AMIRNA前体)
的目的片段(图 2C)。测序结果表明, 重组质粒含有
正确的 At1g13770-amiRNA 和 At2g23470-amiRNA
序列, 分别命名为 pCR-amiR-At1g13770及 pCR-amiR-
At2g23470。
对表达载体 pCHF3-amiRNAs 的酶切鉴定有
10.4 kb的载体 pCHF3和 468 bp的 amiRNAs前体片
段(图 3), 与预期结果完全一致, 表明 pCHF3-amiR-
表 3 RT-PCR 引物序列
基因 正向引物(5′→3′) 反向引物 (5′→3′)
At1g13770 CAACCATCACTGCCTCCTCT GAGCCTGAGTGGAAAGCATC
At2g23470 GATCCTAAGGCCCAGATTCC TGGTTCTATTGGCTCCAAGG
Tubulin GAGCCTTACAACGCTACTCTGTCTGTC ACACCAGACATAGTAGCAGAAATC AAG
图 2 At1g13770-amiRNA 和 At2g23470-amiRNA 前体片段的 PCR 扩增及其克隆
A：PCR 扩增 a、b和 c片段。M：25～700 bp DNA Marker; 1、2、3分别为构建 At1g13770-amiRNA 的 a、b和 c 扩增产物; 4、5和
6分别为构建 At2g23470-amiRNA的 a、b和 c扩增产物。B：PCR 扩增 d片段。M：1 kb DNA Marker; 1、2分别为构建 At1g13770-amiRNA
和 At2g23470-amiRNA的 d扩增产物。C：重组质粒 pCR-amiR-At1g13770和 pCR-amiR-At2g23470的酶切鉴定。M：1 kb DNA Marker;
1～3：pCR-amiR-At1g13770的酶切产物; 4～6：pCR-amiR-At2g23470的酶切产物。
352 HEREDITAS (Beijing) 2012 第 34卷
图 3 人工 microRNAs 植物表达载体的酶切鉴定
1～4: pCHF3-amiR-At1g13770的双酶切产物; 5: pCHF3载体双
酶切结果; 6、7: pCHF3-amiR-At2g23470的双酶切产物; 8: 1 kb
DNA Marker。
At1g13770和 pCHF3-amiR-At2g23470表达载体构建
成功。
2.2 转基因拟南芥植株的获得与鉴定
利用农杆菌介导的花苞浸染法, 以 pCHF3-amiR-
At1g13770和 pCHF3-amiR-At2g23470分别转化野生
型拟南芥, 收获的种子在含有 100 mg/L卡那霉素的
1⁄2MS 培养基上进行抗性筛选, 得到 pCHF3-amiR-
At1g13770转基因植株 10株, pCHF3-amiR-At2g23470
转基因植株 8 株, 抗性植株转土继续培养。提取这
些抗性植株的基因组 DNA, 用 amiRNAs 前体特异
性的引物进行 PCR扩增, 转基因植株检测到 476 bp
的目标条带(图 4), 说明 amiRNAs 前体已经整合到
拟南芥基因组中, 所获得的抗性植株为转化株。
2.3 AmiRNAs转基因植株 At1g13770和 At2g23470
的转录及表型分析
分别提取 At1g13770-amiRNA 和 At2g23470-
amiRNA 转基因植株的总 RNA, 采用 RT-PCR 检测
amiRNAs分子对目的基因转录水平的影响。结果显
示, 与野生型 Col 靶基因的表达水平相比, At1g13770
和 At2g23470 在转基因植株中的表达水平明显降低,
在有些转基因株系中几乎检测不到靶基因的表达
(图 5)。本研究共筛选到 10 个 At1g13770 表达水平下
调、8 个 At2g23470 表达水平下调的转基因株系。观
察转基因植株的表型变化, 发现 At2g23470-amiRNA
转基因植株的营养生长和花发育基本正常, 但育性
严重下降(图 6A, 6C)。在我们的实验条件下, 野生型
col-0 一般每个角果可产生 30 粒左右的种子, 而
图 4 amiRNAs 转基因拟南芥植株的 PCR 鉴定
A: pCHF3-amiR-At1g13770 转基因植株的 PCR 检测。1: 100 bp DNA Marker; 2: 野生型对照; 3～12: At1g13770-amiRNA 株系。B:
pCHF3-amiR-At2g23470转基因植株的 PCR检测。1：1 kb DNA Marker; 2: 野生型对照; 3～10: At2g23470-amiRNA株系。
第 3期 李文超等: 人工 microRNAs对拟南芥 At1g13770和 At2g23470基因的特异沉默 353
At2g23470-amiRNA 转基因植株大多数角果不产生种
子, 少数角果可产生 7～8粒种子。At1g13770-amiRNA
转基因植株的表型变化不明显(图 6B)。这些对靶基
因有明显下调作用的 amiRNAs转基因株系的获得为
进一步深入研究这些基因的功能奠定了良好的基础。
3 讨 论
基因沉默是生物界广泛存在的一种现象, 近年
来已经发展成为反向遗传学研究的有力工具。在植
物系统中, 基因沉默通常通过异源表达双链 RNAs[15]、
病毒载体[16]或人工 miRNAs[7, 8, 17, 18]而实现。基于人
工 miRNAs 的基因沉默技术由于具有特异性高、稳
定性强和沉默效应可预见而备受青睐。已有研究显
示, 利用 amiRNAs 技术对基因的特异沉默在拟南
芥、烟草、番茄和水稻等多种高等植物中都取得了
成功[7, 18~20]。本研究利用拟南芥内源 MIR319a前体
作为骨架, 构建了拟南芥 At1g13770和 At2g23470基
因的人工 microRNAs, 实现了对目的基因的特异沉
默, 得到了期待的突变体表型。
At1g13770 和 At2g23470 是拟南芥 DUF647 基
图 5 RT-PCR 检测 amiRNAs 转基因植株目的基因表达
A: At1g13770在野生型和 At1g13770-amiRNA表达构建转基因株系中的表达分析。1: 野生型对照; 2～11: At1g13770-amiRNA 株系。
B: At2g23470在野生型和 At2g23470-amiRNA表达构建转基因株系中的表达分析。1: 野生型对照; 2～9: At2g23470-amiRNA株系。
图 6 amiRNAs 转基因植株的表型分析
A：野生型对照(左)和 At1g13770-amiRNA转基因植株(右)的表型; B：野生型对照(左)和 At2g23470-amiRNA转基因植株(右)的表型; C：
野生型对照(左)和 At2g23470-amiRNA转基因植株(右)的角果。标尺=1 cm。
354 HEREDITAS (Beijing) 2012 第 34卷
因家族中两个重要的成员。其中 At1g13770 基因在
水稻和苔藓中都有相应的同源基因, 它们之间表现
出高度的进化枝[2,3]。而且 At1g13770 基因也是动物
家系中的直系同源基因[3]。而 At2g23470只在苔藓中
有同源基因, 在水稻中似乎已经丢失。目前这两个
在进化中处于不同地位的基因的功能尚不清楚。
AtGenExpress注释显示, At2g23470在花瓣分化和扩
展阶段表达, 表达部位在雄蕊和茎[21], 提示At2g23470
的功能可能与育性有关, At2g23470功能的缺失有可
能导致雄性不育。本研究利用人工 miRNAs 技术对
拟南芥 At1g13770 和 At2g23470进行了特异沉默。
研究结果显示 At2g23470-amiRNA 转基因植株的育
性比野生型大幅降低, 支持 At2g23470 的功能与育
性相关的观点。
DUF647 蛋白广泛存在于植物[22~25]、动物和一
些真菌中。在拟南芥中, 共有 6 个 DUF647 蛋白家
族成员, 虽然都这 6 个成员都包含未知功能结构域
647, 但它们之间的序列相似性很低 , 最高的仅为
33.8%, 最低的只有 18.1%。研究显示, 突变拟南芥
DUF647 蛋白家族基因 RUS1 和 RUS2 导致幼苗对
UVB 光的高度敏感。RUS1 与 RUS2 通过 DUF647
结构域相互作用, 共同作用于根 UVB 感受途径, 参
与拟南芥幼苗的早期形态建成和发育[1, 2]。但 Ge 等[3]
认为介导对UVB光的应答不可能是 RUS2/WXR1的
主要功能。理由如下：第一, 他们的实验并不能证
实 wxr1(wxr1 是 rus2 的等位基因)根对 UVB 的高度
敏感, 即使在完全黑暗的条件下, wxr1 的根也比野
生型的短 ; 第二 , 提高生长素移动到根的条件 , 比
如提高温度或过量表达 PIN1, 可以恢复 wxr1 突变
体根的生长; 第三, wxr1 突变增强了受体三突变体
tir1 afb2 afb3 的强胚胎表型, 表明对胚胎形成有贡
献。因此推测 rus2/wxr1 突变体的生长素运输/分配
缺陷以及 UV高度敏感似乎都是由于细胞调控(可能
是蛋白运输)缺陷引起的。蛋白组学研究表明 WXR1
定位于叶绿体外膜[26, 27], 对于一个叶绿体蛋白功能
的缺失如何影响到其它膜蛋白的水平目前还没有一
个清楚的模型。是否 At1g13770 和 At2g23470 也在
细胞内吞和蛋白运输中发挥作用, 还有待于我们进
一步研究。
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