全 文 ：泛素-蛋白酶体途径通过选择性降解真核细
胞中具有多种活性的蛋白质而在真核生物中扮演
重要角色. 拟南芥中有将近 6%的基因编码的蛋
白属于泛素-蛋白酶体途径, 它们广泛参与调控新
陈代谢、细胞分化与生长、激素响应等生理生化过
程[1]. 泛素活化酶 E1、泛素耦联酶 E2和泛素连接
酶 E3是泛素-蛋白酶体途径中的 3个重要的酶.
目前,已发现的 E3分子有多种,如HECT[2]、COP1[3]、
APC[4]、SCF (Skp、Cullin、F-box)复合体 [5]等 . 其中 ,
SCF复合体在植物中的功能最为重要, 也是研究
收稿日期: 2013-09-06; 修回日期: 2013-11-05
基金项目: 国家自然科学基金资助项目(31171176); 湖南省自然科学基金资助项目(11JJA002); 植物分子遗传国家重点实验室开放课题项
目(Y109Z711T1)
作者简介: 段桂芳(1987-), 女, 湖南衡阳人, 硕士研究生, 主要从事植物光形态建成分子生物学研究; *通讯作者: 赵小英(1973-), 女, 湖南
慈利人, 湖南大学生物学院副教授, 博士, 主要从事植物赤霉素信号转导和植物光形态建成的分子生物学及生理学研究, Tel: 0731-
88664048; E-mail: zxy_mm@163.com.
拟南芥 F-box基因 At3g16740的表达分析
段桂芳, 王利群, 李新梅, 赵 福, 罗 俊, 赵小英*, 刘选明
(湖南大学 生物学院 植物基因组学与发育调控湖南省重点实验室, 中国湖南 长沙 410082)
摘 要: 拟南芥 At3g16740 基因为 F-box 基因家族成员, 其功能尚不清楚. 通过连续和瞬时光照处理分析, 发现
蓝光、 红光和远红光都诱导 At3g16740 基因的表达, 其中远红光的诱导作用最明显. 蓝光受体 cry1、cry2, 红光
受体 phyB 或远红光受体 phyA 突变导致 At3g16740 基因表达的光诱导作用减弱或者消失, 表明该基因为光信
号通路相关基因. 通过实时荧光定量 PCR 分析 At3g16740 基因在拟南芥不同组织器官中的表达, 发现其在拟
南芥根、茎、叶、花和果荚中都有表达, 花和果荚中的表达量最高, 推测该基因可能参与植物花和/或果荚的发
育. 酵母双杂交分析发现, At3g16740 蛋白通过 F-box 结构域与拟南芥 ASK (arabidopsis-SKP1-like) 家族成员
ASK1、ASK2 和 ASK11 相互作用, 表明 At3g16740 是 SCF (Skp、Cullin、F-box)复合物的成员.
关键词: 拟南芥; F-box 基因; At3g16740; 基因表达
中图分类号: Q94 文献标识码: A 文章编号: 1007-7847(2013)06-0486-07
Expression Analysis of F-box Gene At3g16740 in Arabidopsis
DUAN Gui-fang, WANG Li-qun, LI Xin-mei, ZHAO Fu, LUO Jun,
ZHAO Xiao-ying*, LIU Xuan-ming
(Hunan Provincial Key Laboratory of Plant Functional Genomics and Developmental Regulation, College of Biology,
Hunan University, Changsha 410082, Hunan, China)
Abstract：The function of At3g16740 gene, a member of F-box gene family, remains unclear. mRNA expression
analysis results showed that At3g16740 is induced by continuous or transient blue, red and far red light, in
which the far red light induction is stronger. The mutation in light receptors such as cry1, cry2, phyB and
phyA resulted in reduced expression of At3g16740 under continuous or transient illumination, indicating that
At3g16740 might be a light related gene. Expression assay of At3g16740 in different organs in Arabidopsis
showed that it expressed higher in flower and silique and suggesting that it might play a role in flower and/or
silique development. At3g16740 protein interacted with ASK1 (Arabidopsis-SKP1-like), ASK2 and ASK11
through its F-box domain in yeast hybrid assay, indicating that At3g16740 is a member of SCF (Skp, Cullin,
F-box) complex.
Key words: Arabidopsis; F-box gene; At3g16740; gene expression
（Life Science Research，2013，17（6）：486～492）
第 17 卷 第 6 期 生命科学研究 Vol．17 No．6
2013 年 12 月 Life Science Research Dec. 2013
第 6 期 段桂芳等：拟南芥 F-box基因 At3g16740的表达分析
最为深入的一类泛素连接酶.
SCF 复合体在泛素-蛋白酶体途径中负责泛
素连接[6, 7]和底物绑定 [8, 9], 由 Skp1、Cullin、RBX1、
F-box蛋白 4个亚基构成. 前 3 个亚基构成基本
骨架, F-box蛋白则作为靶蛋白的受体, 特异性识
别底物. F-box蛋白的 N端含有一个保守的 F-box
结构域, 一般由 40～50个氨基酸组成. F-box蛋白
通过 F-box结构域与 Skp1 (在拟南芥中为 ASK
(arabidopsis SKP-LIKE), 由 21个基因家族编码[10])
结合而连接到 SCF复合体上. F-box蛋白的 C端
含有一个蛋白互作结构域, 通过该结构域 F-box
蛋白与靶蛋白特异性结合[11]. 在拟南芥中大约有
700个 F-box蛋白[12], 它们通过特异识别不同的靶
蛋白而参与调控许多生理现象[5], 如生长素信号传
导、花器官发育、光形态建成以及生物钟节律的调
节等 [13]. Potuschak 等 [14]发现 F-box 基因 EBF1 和
EBF2是乙烯途径的负调控因子[15]. F-box蛋白 SLY1
参与 GA 信号传导 , 使负调控因子 RGA 和 GAI
通过泛素-蛋白酶体途径降解[16, 17].拟南芥 F-box蛋白
TIR1作为生长素受体通过与生长素直接相互作
用,介导一系列生长素反应[18]. F-box蛋白 UFO (un-
usual floral organs)突变导致花发育异常[19, 20]. EID1
(empfindlicher im dunkelroten licht)和 AFR (attenu-
ated far-red response) 参与了 phyA介导的光信号
传导[21, 22].近年来,有研究发现 F-box蛋白参与生物/
非生物胁迫反应, 如 AtFBS1[23]、DOR [24]及 FOA1[25]
受非生物胁迫调控, 参与 ABA、干旱和高盐等胁
迫反应.
本研究发现 F-box基因 At3g16740受光调控,
在拟南芥各个组织器官中都有表达, 其中花和果
荚中的表达量最高. 本研究还采用酵母双杂交技
术分析了 At3g16740 蛋白与拟南芥 ASK (ara-
bidopsis-SKP1-like)蛋白家族成员的相互作用.
1 材料与方法
1.1 启动子顺式作用元件分析
利用植物启动子顺式作用元件分析工具
plantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/w
ebtools/plantcare/html/) 对 At3g16740基因起始密
码子上游 610 bp的片段进行了分析, 发现该区域
存在大量光反应元件 , 包括 3-AF1 binding site、
ATCT-motif、Box 4、Box Ⅱ 、G-box、as-2-box、GAG-
motif、chs-CMA2a等. 因此, 本研究分析了不同光
质, 包括蓝光、红光和远红光对 At3g16740基因表
达的影响.
1.2 植物材料及培养
本研究采用的拟南芥野生型 Col-4, 光受体突
变体 cry2、cry1cry2、phyA、phyB 的遗传背景均为
哥伦比亚生态型. 拟南芥播种在营养土中, 培养
在长日照(16 h光照然后 8 h黑暗)培养室, 温度
为 22～24 ℃. 收集 Col-4成年植株的根、茎、莲座
叶、茎生叶、花和果荚, 用于 RNA分析.
1.3 光源
本研究采用的蓝光、红光、远红光光源分别
为 : LED-B (波长为 470 nm, 半幅宽为 30 nm),
LED-R(波长为 660 nm, 半幅宽为 20 nm), LED-FR
(波长为 740 nm, 半幅宽为 25 nm). 蓝光和红光的
光照强度用 Li-250量子光度计测量. 远红光的强
度先用 Li-250量子光度计测量然后根据分光照
度计测得的标准曲线进行估计.
1.4 光处理
持续光处理: 将拟南芥种子用 75%酒精浸泡
30 s, 再用 10% NaClO 浸泡 10 min, 用无菌水洗
4～6次[25], 播种在MS培养基中, 放入 4 ℃冰箱冷处
理 4 d, 然后转入持续蓝光、红光、远红光或黑暗
培养 6 d, 收集材料, 液氮速冻后, 放入-80 ℃保
存, 用于 RNA分析.
瞬时光处理: 将拟南芥种子在黑暗中培养 6 d
后, 转入蓝光、红光或远红光下处理 0、0.5、1、2、
4、8、12、24 h, 收集材料, 用液氮速冻后放入-80 ℃
保存以备提 RNA.
1.5 At3g16740 及 ASK 基因家族成员克隆与载
体构建
以野生型拟南芥 (col-4) cDNA为模板, 根据
Gateway技术要求, 设计含有 attB接头的引物(表
1, 下划线序列为 attB位点), 利用 prime STAR 高
保真酶(TaKaRa), 通过 PCR反应获得带有 attB位
点的 PCR产物. 利用 BP ClonaseⅡ (invitrogen)经
BP 重组反应将 PCR 产物克隆到入门载体
pDONR/Zeo,测序后,利用 LR ClonaseⅡ (invitrogen)
将 At3g16740 克隆到 pDEST32 目标载体中 , 将
ASK 基因家族成员 ASK1、ASK2、ASK3、ASK4、
ASK5、ASK6、ASK7、ASK8、ASK10、ASK11、ASK12、
ASK13、ASK14、ASK15、ASK16、ASK17、ASK18、
ASK19、ASK21 共 19 个克隆到 pDEST22 目标载
体中 , 获得 pDEST32-At3g16740 以及 pDEST22-
ASK重组质粒.
487
生 命 科 学 研 究 2013 年
表 1 At3g16740 及 ASK 家族基因编码序列克隆引物序列
Table 1 Primer sequences used for cloning the At3g16740 and ASK family gene coding sequence
Primer name
1.6 实时荧光定量 PCR分析
总 RNA 的提取采用 RNAeasy Mini Kit
(TaKaRa)试剂盒按照说明进行,然后利用Maxima誖
First Strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa)按照说
明书合成 cDNA第一链, 将其稀释 10倍后用于实
时荧光定量 PCR分析. 采用 SYBR誖GreenⅠ 试
剂盒(东盛公司), 取 1 μL稀释的 cDNA作为模板,
在 Mx3000P (Stratagene)定量 PCR仪中进行反应.
实时荧光定量 PCR反应程序为: 95℃ 10 min, 95 ℃
30 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 共 45 个循环. 实验
重复 3 次 , 以持家基因 ACTIN2 为内参 , 用
Mx3000P软件分析被检测基因的相对表达水平.
荧光定量 PCR引物序列见表 2.
1.7 酵母双杂交
pDEST32-At3g16740 质 粒 能 够 编 码
At3g16740 和 GAL4 DNA 结合域的融合蛋白 ,
pDEST22-ASK (ASK1~19, 21)质粒能够编码 ASK
Primer name
At3g16740 F
At3g16740 R
ASK1F
ASK1R
ASK2F
ASK2R
ASK3F
ASK3R
ASK4F
ASK4R
ASK5F
ASK5R
ASK6F
ASK6R
ASK7F
ASK7R
ASK8F
ASK8R
ASK10F
ASK10R
ASK11F
ASK11R
ASK12F
ASK12R
ASK13F
ASK13R
ASK14F
ASK14R
ASK15F
ASK15R
ASK16F
ASK16R
ASK17F
ASK17R
ASK18F
ASK18R
ASK19F
ASK19R
ASK21F
ASK21R
Primer sequence (from 5′-3′)
CAAAAAAGCAGGCTTCATGGTTCAGATTTCCGATCTTC
CAAGAAAGCTGGGTCCTAGATTTGCACTGAGCTTGGA
CAAAAAAGCAGGCTTCATGTCTGCGAAGAAGATTGTGTT
CAAGAAAGCTGGGTCTCATTCAAAAGCCCATTGGT
CAAAAAAGCAGGCTTCATGTCGACGGTGAGAAAAATCA
CAAGAAAGCTGGGTCTCATTCAAACGCCCACTGAT
CAAAAAAGCAGGCTTCATGGCAGAAACGAAGAAGATG
CAAGAAAGCTGGGTCTCACTCGAACGCCCACTTG
CAAAAAAGCAGGCTTCATGGCAGAAACGAAGAAGATG
CAAGAAAGCTGGGTCTCACTCGAACGCCCACTTG
CAAAAAAGCAGGCTTCATGTCGACGAAGATCATGTTGA
CAAGAAAGCTGGGTCTCATTGAAAAGCCCATTGATTC
CAAAAAAGCAGGCTTCATGATGATAAAGGGTATGGCAGA
CAAGAAAGCTGGGTCTCAGCGACAGTTTGAAAATGTG
CAAAAAAGCAGGCTTCATGTCGACAAAAAAGATCATGTTG
CAAGAAAGCTGGGTCTCATTCAAAAGCCCATTTATTG
CAAAAAAGCAGGCTTCATGTCGACGAAAAAGATCATGTT
CAAGAAAGCTGGGTCTCATTCAAAAGCCCATTTATTCT
CAAAAAAGCAGGCTTCATGTCGACGAAGAAGATCATATTG
CAAGAAAGCTGGGTCTCATTCAAAACCCCATTGATTC
CAAAAAAGCAGGCTTCATGTCTTCGAAGATGATCGTGTT
CAAGAAAGCTGGGTCTCATTCAAAAGCCCATTGATT
CAAAAAAGCAGGCTTCATGTCTTCGAAGATGATCGTGTT
CAAGAAAGCTGGGTCTCATTCAAAAGCCCATTGATT
CAAAAAAGCAGGCTTCATGTCGAAGATGGTTATGTTGCT
CAAGAAAGCTGGGTCTCATTCAAAAGCCCATTGATT
CAAAAAAGCAGGCTTCATGTCTTCCAACAAGATTGTTTTG
CAAGAAAGCTGGGTCCTATTCAAAAGCCCATGCGT
CAAAAAAGCAGGCTTCATGTCTTCTAACAAGATTGTGTTGA
CAAGAAAGCTGGGTCCTAGGGCTTTGGATCTTCGT
CAAAAAAGCAGGCTTCATGTCTTCGAACAAGATTGTGTTG
CAAGAAAGCTGGGTCTTACTTTAGATCCTCAAAAGCCC
CAAAAAAGCAGGCTTCATGTCTTCGAAGAAGATTGTGTTG
CAAGAAAGCTGGGTCTTAATTGAAAGCCCATTCGTTC
CAAAAAAGCAGGCTTCATGGCTTCTTCTTCCGAAGAG
CAAGAAAGCTGGGTCTTACTCATTAAAAGTCCAAGCATTC
CAAAAAAGCAGGCTTCATGTCTTCGAAAAAGATTGTGTTG
CAAGAAAGCTGGGTCTCAACACAATCTTTTTCGAAGACA
CAAAAAAGCAGGCTTCATGTCAGAAGGTGAAATGGCC
CAAGAAAGCTGGGTCTCACTTGTGTCCTGCAGCTG
表 2 实时荧光定量 PCR 引物序列
Table 2 Primer sequences used for real-time
fluorescence quantitative PCR
Primer name
At3g16740 QF
At3g16740 QR
ACTIN2 QF
ACTIN2 QR
Primer sequence (from 5′-3′)
ACCGTGAAGATATGGATTAGTCGC
TTCCCAATGATGTAAGCTATGTTGC
CACTGTGCCAATCTACGAGGGT
CACAAACGAGGGCTGGAACAAG
488
第 6 期
图 1 蓝光调节 At3g16740 基因表达的实时定量 PCR 分析
Fig.1 Real time PCR analysis for At3g16740 gene expression under blue light
与 GAL4激活域的融合蛋白[26], 将两个质粒进行酵
母转化, 具体方法参照 PT3024-1手册, 将转化过
的酵母涂布在 SD/-Leu/-Try固体平板上. 28 ℃培
养 2～3 d后, 挑取 2～3个克隆混匀后涂布在 SD/-
Leu/-Try/-His 固体平板上 , 筛选与 At3g16740 蛋
白相互作用的 ASK蛋白.
1.8 滤纸显色分析
参照 COLONTECH说明书, 准备一张干净的
滤纸, 用无菌牙签将在 SD/-Leu/-Trp固体平板上
生长的酵母挑至 3 μL无菌水中混匀, 用枪头将
菌液点在滤纸上, 使菌落面朝上, 干燥后将其放
入液氮中速冻 10 s, 然后在室温条件下解冻. 反
复冻融 4次后, 在滤纸上加上 Z buffer/X-gal溶液
(100 mL Z buffer, 0.27 mL β-巯基乙醇 , 1.67 mL
20 g/L X-gal溶液). 30 ℃条件下孵育, 观察菌落是
否变蓝, 若 8 h内变蓝则为阳性, 没有变蓝则为阴
性. Z buffer: Na2HPO47H2O 16.1 g/L, NaH2PO4H2O
5.50 g/L, KCl 0.75 g/L, MgSO47H2O 0.246 g/L, 调
pH至 7.0.
2 结果
2.1 蓝光对 At3g16740基因表达的影响
采用实时荧光定量 PCR 分析蓝光对
At3g16740基因表达的影响, 发现连续蓝光条件
下, Col-4 中 At3g16740 基因的表达量有明显增
加, 表达量为黑暗处理的两倍以上, 但蓝光受体
突变体 cry2、cry1cry2中的表达量无变化 (图 1A).
说明蓝光诱导 At3g16740基因的表达, 蓝光受体
突变导致蓝光的诱导作用受抑制.
Col-4 cry2 cry1cry2
0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
Re
la
tiv
e
ex
pr
es
sio
n
le
ve
l Dark
Bule light
241284210.50
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
Re
la
tiv
e
ex
pr
es
sio
n
le
ve
l Col-4
cry1cry2
(A)
1.0
0.5
0
1.5
2.0
0.5 1 2 4 8 12 24
Time of bule light treatment/h
Re
la
tiv
e
ex
pr
es
sio
n
le
ve
l
Col-4
cry2
(B) (C)
Time of bule light treatment/h
进一步研究瞬时蓝光对 At3g16740基因表达
的影响 , 发现从黑暗转到蓝光下 , Col-4 中
At3g16740 基因的表达量呈上升趋势, cry2 突变
体中则无明显变化, cry1cry2 突变体中虽然瞬间
有较大波动, 但整体趋势无明显变化 (图 1B、C).
这说明蓝光受体突变导致瞬时蓝光对 At3g16740
基因表达的调节也发生改变 , 表明蓝光受体
CRY1、CRY2参与蓝光调节该基因的表达.
2.2 红光对 At3g16740基因表达的调节
采用实时荧光定量 PCR 分析红光对
At3g16740基因表达的影响, 结果显示 At3g16740
受红光诱导, 连续红光下 Col-4 中 At3g16740 基
因的表达量明显高于黑暗中, 为黑暗中的 5.5倍.
然而, 突变体 phyB中 At3g16740基因的表达量则
低于黑暗中(图 2A). 瞬时红光下, At3g16740基因
在 phyB 突变体中的表达先是上升, 且比野生型
中高, 然后下降与野生型之间无明显差异, 照光 8
h后野生型中的基因表达量迅速上升且比 phyB
突变体中高 (图 2B), 表明 phyB突变在一定程度
上抑制红光对 At3g16740基因表达的诱导.
图 2 红光对 At3g16740 基因表达的影响
Fig.2 Real time PCR analysis for At3g16740 gene expression under red light
7
6
5
4
3
2
1
0
Col-4 phyB
Re
la
tiv
e
ex
pr
es
sio
n
le
ve
l Dark
Red light
(A)
7
6
5
4
3
2
1
0
8
0 0.5 1 2 4 8 12 24
Col-4
cry2
Re
la
tiv
e
ex
pr
es
sio
n
le
ve
l
Time of bule light treatment/h
(B)
段桂芳等：拟南芥 F-box基因 At3g16740的表达分析 489
生 命 科 学 研 究 2013 年
2.3 远红光对 At3g16740基因表达的调节
为研究 At3g16740基因的表达是否受远红光
调节, 采用实时荧光定量 PCR 分析了远红光下
Col-4 及 phyA 突变体中 At3g16740 基因的表达 .
结果显 示 , 连续远红 光处理时 , Col-4 中
At3g16740基因的表达量增加, 为黑暗中的 11倍
左右; 在 phyA 突变体中 At3g16740 基因的表达
量也上升, 但仅为黑暗中的两倍左右 (图 3A), 表
明 phyA突变减弱了远红光对该基因表达的诱导
作用. 瞬时远红光处理结果显示, Col-4 和 phyA
突变体中 At3g16740的相对表达量在第 4 h都开
始增加, 且在 Col-4 中的表达量明显高于 phyA;
8 h后 At3g16740的表达量开始下降, 但在 Col-4
中的表达量仍然高于 phyA (图 3B). 表明 phyA参
与了远红光对 At3g16740基因表达的诱导作用.
2.4 At3g16740在拟南芥不同组织器官中的表达
图 3 远红光对 At3g16740 基因表达的影响
Fig.3 Real time PCR analysis for At3g16740 gene expression under red light
Col-4 phyA
Dark
Far red light
0
2
4
6
8
10
12
14
Re
la
tiv
e
ex
pr
es
sio
n
le
ve
l
(A)
0 0.5 1 2 4 8 12 24
0
2
4
6
8
10
Re
la
tiv
e
ex
pr
es
sio
n
le
ve
l Col-4
phyA
Time of bule light treatment/h
(B)
分析 At3g16740基因在拟南芥不同组织器官
中的表达, 发现该基因在拟南芥成年植株的根、
茎、莲座叶、茎生叶、花和果荚中都有表达, 花中
的表达量最高, 其次是果荚. 因此, 推测该基因可
能在拟南芥花和果荚的发育过程中起调控作用.
2.5 At3g16740 蛋白与 ASK 家族成员的相互作
用分析
At3g16740蛋白 N端(4～48)可形成一个 F-box
结构域, 其 C端(209～391)含有一个可能参与蛋白
相互作用的 FBA_1 结构域 (图 5A). 为确认
At3g16740蛋白是否为 SCF复合物的成员, 采用
酵母双杂交检测了 At3g16740 蛋白与 ASK 家族
成员的相互作用.
首先, 以拟南芥野生型 cDNA 为模板, 通过
PCR 克隆得到 At3g16740 基因的全长编码序列
(图 5B)、缺失 F-box结构域的 At3g16740D编码序
列片段 (图 5B), 以及 19个 ASK基因的编码序列
(图 6), 包括 ASK1-8、ASK10-19和 ASK21. 随后采
用 Gateway 技术将 At3g16740 及 At3g16740D 的
PCR 产物克隆到 pDEST32 载体中与 BD 形成融
合蛋白, 将 ASK 基因克隆到 pDEST22 载体中与
AD 形 成 融 合 蛋 白 . 将 pDEST32-At3g16740/
pDEST32-At3g16740D 和 pDEST22-ASK 共转入
AH109 酵母中 , 用共转 pDEST32-At3g16740 和
pDEST22载体及共转 pDEST32和 pDEST22载体
的酵母作为阴性对照, 涂布含 10 mmol/L 3-AT和
SD/-Leu/-Try的固体平板, 以及含 10 mmol/L 3-AT
和 SD/-Leu/-Try/-His的固体平板.结果显示,共转入
pDEST32-At3g16740 和 pDEST22-ASK1、pDEST22-
ASK2 或 pDEST22-ASK11的酵母在含 10 mmol/L
3-AT 的三缺营养缺陷培养基上 (SD/-Leu/-Try/-
His)能够继续生长, 其他酵母的生长明显受到抑
制 (图 7). 说明 At3g16740 通过 F-box 结构域与
ASK 家族成员中的 ASK1、ASK2 和 ASK11 相互
作用.
为了进一步验证 At3g16740 蛋白与 ASK1、
ASK2 和 ASK11 的相互作用, 随后采用 X-gal 显
色实验进行了分析. 滤纸显色结果显示, 共转入
图 4 拟南芥不同组织器官中 At3g16740 基因转录水平的
实时定量 PCR 分析
Fig.4 Real time PCR analysis for At3g16740 gene ex-
pression in different organs in Arabidopsis
0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.5
3.0
Re
la
tiv
e
ex
pr
es
sio
n
le
ve
l
Ro
ot
Ste
m
Ro
set
te
lea
f
Ca
uli
ne
lea
f
Flo
we
r
Sil
iqu
e
490
第 6 期
M 1 2 3 4 5 7 8 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 6bp
1 200
800
500
200
M 21bp
1 200
800
pDEST32-At3g16740和 pDEST22-ASK1、pDEST22-
ASK2或 pDEST22-ASK11的酵母在加 Z buffer/X-
gal 后 4 h 呈阳性 , 对照都呈阴性 (图 8), 表明
At3g16740 蛋白与 ASK1、ASK2 和 ASK11 3 个成
员都存在相互作用. 因此, 推测 At3g16740是 SCF
复合物的成员.
3 讨论
光是调控植物生长和发育的重要外界因素.
植物体内存在三类光受体,包括向光素 Phototropin
隐花素 Cryptochrome、光敏素 Phytochrome, 分别
感受蓝光/紫外光、红光/远红光. 它们通过调节基
因表达共同调控植物的向光性生长、光形态建成、
开花等生理发育过程[26, 27].本研究发现拟南芥 F-box
基因 At3g16740的表达受蓝光、红光和远红光诱
导调节, 其中远红光的诱导作用最强. 蓝光受体
cry2、红光受体 phyB、远红光受体 phyA突变导致
光的诱导作用减弱或者消失, 说明 At3g16740可
能为光信号通路相关基因.
分析基因在植物不同组织器官中的表达可为
预测其功能提供线索[28].本研究发现该基因在拟南
芥各个组织器官中都有表达, 花和果荚中表达最
高, 推测该基因可能参与植物花和果荚的发育 ,
这还有待作进一步功能分析研究. F-box 基因编
码的蛋白通常通过其 F-box结构域与 Skp1相互
作用, 与 Cullin、RBX1 共同构成 SCF 复合物 . 在
拟南芥中存在 21个 ASK基因家族成员[10], F-box
蛋白可能与其中 1个或者多个 ASK相互作用[29],
如 F-box 蛋白 DOR 与 ASK4 相互作用 [24], EDL3
(EID1-like protein 3)与 5个 ASK蛋白包括 ASK1、
ASK2、ASK4、ASK11 和 ASK18 相互作用 [30], COI1
(CORONATINE INSENSITIVE1) 与 ASK1 相互作
用[31]等. 本研究中发现 At3g16740与 ASK11相互
作用, 这与前人的研究结果相一致[10, 29]. 同时, 我
们还发现该蛋白与 ASK1、ASK2 也相互作用, 表
明 At3g16740 蛋白是 SCF 复合物的成员 , 这为
深入研究 At3g16740 基因的生理功能提供了重
要线索.
NH3+
F-box FBA_1
4 48 209 387
COO-
(A)
M At3g16740
1 200
800
bp
(B)
1 000
500
bp M At3
g16
74
0
(C)
图 5 At3g16740 蛋白结构域位点及基因克隆电泳图
(A) F-box结构域和 FBA_1结构域在 At3g16740蛋白序列中
的位点; (B) At3g16740 编码序列 PCR 产物电泳结果; (C) 缺
失 F-box结构域的 At3g16740基因片段 PCR产物电泳结果.
Fig.5 Diagram depicting the domain of At3g16740 pro-
tein and electrophoresis map of gene clone
(A) Diagram depicting the F-box and FBA_1 domain in
At3g16740 protein; (B) electrophoresis map of PCR product
of At3g16740 coding sequence; (C) electrophoresis map of
PCR product of At3g16740 coding sequence fragment without
F-box domain sequence.
图 6 ASK 基因家族成员编码序列 PCR 产物电泳图
M: DNA 分子标准; 1～8、10～19、21 表示 ASK1～8、ASK10～19、ASK21.
Fig.6 Electrophoresis map of the PCR product of ASK gene family
M: DNA size standard; 1～8, 10～19, 21 indicate ASK1～8, ASK10～19, ASK21.
段桂芳等：拟南芥 F-box基因 At3g16740的表达分析 491
生 命 科 学 研 究 2013 年
图 8 At3g16740 与 ASK1、ASK2 和 ASK11 相互作用的酵
母双杂交 X-gal 显色实验分析
Fig.8 X-gal staining analysis for the interaction between
At3g16740 and ASK1、ASK2 and ASK11
参考文献(References):
[1] VIERSTRA R D. The ubiquitin-26S proteasome system at the
nexus of plant biology[J]. Nature Reviews Molecular Cell Biol-
ogy, 2009, 10(6): 385-397.
[2] PICKART C M. Mechanisms underlying ubiquitination[J]. An-
nual Review of Biochemistry, 2001, 70(1): 503-533.
[3] DENG X W, CASPAR T, QUAIL P H. Cop1: a regulatory lo-
cus involved in light-controlled development and gene expres-
sion in Arabidopsis[J]. Genes Development, 1991, 5(7): 1172-
1182.
[4] STONE S L, ANDERSON E M, MULLEN R T, et al. ARC1 is
an E3 ubiquitin ligase and promotes the ubiquitination of pro-
teins during the rejection of self-incompatible Brassica pollen[J].
Plant Cell, 2003, 15(4): 885-898.
[5] CRAIG K L, TYERS M. The F-box: a new motif for ubiquitin
dependent proteolysis in cell cycle regulation and signal trans-
duction[J]. Progress in Biophysics and Molecular Biology, 1999,
72(3): 299-328.
[6] ZHANG W, KOEPP D M. Fbw7 isoform interaction contributes
to cyclin E proteolysis[J]. Molecular Cancer Research, 2006, 4
(12): 935-943.
[7] TANG X, ORLICKY S, LIN Z, et al. Suprafacial orientation of
the SCFCdc4 dimer accommodates multiple geometries for
substrate ubiquitination[J]. Cell, 2007, 129(6): 1165-1176.
[8] LI Y, HAO B. Structural basis of dimerization-dependent u-
biquitination by the SCF (Fbx4) ubiquitin ligase[J]. The Jour-
nal of Biological Chemistry, 2010, 285(18): 13896-13906.
[9] WELCKER M, CLURMAN B E. Fbw7/hCDC4 dimerization
regulates its substrate interactions[J]. Cell Division, 2007, (2): 7.
[10] ZHAO D, NI W, FENG B, et al. Members of the Arabidopsis-
SKP1-like gene family exhibit a variety of expression patterns
and may play diverse roles in Arabidopsis[J]. Plant Physiology,
2003, 133(1): 203-217.
[11] HO M S, OU C, CHAN Y R, et al. The utility F-box for pro-
tein destruction [J]. Cellular and Molecular Life Sciences,
2008, 65(13): 1977-2000.
[12] GAGNE J M, DOWNES B P, SHIU S H, et al. The F-box
subunit of the SCF E3 complex is encoded by a diverse super-
family of genes in Arabidopsis[J]. Proceedings of the National A-
cademy of Sciences USA, 2002, 99(17): 11519-11524.
[13] CALLIS J, VIERSTRA R D. Protein degradation in signaling[J].
Current Opinion in Plant Biology, 2000, 3(5): 381-386.
[14] POTUSCHAK T, LECHNER E, PAMENTIER Y, et al. EIN3-
dependent regulation of plant ethylene hormone signaling by
two arabidopsis F box proteins: EBF1 and EBF2[J]. Cell, 2003,
115(6): 679-689.
[15] GUO H, ECKER J R. Plant responses to ethylene gas are me-
diated by SCF (EBF1/EBF2)-dependent proteolysis of EIN3
transcription factor[J]. Cell, 2003, 115(6): 667-677.
[16] MCGINNIS K M, THOMAS S G, SOULE J D, et al. The Ara-
bidopsis SLEEPY1 gene encodes a putative F-box subunit of
an SCF E3 ubiquitin ligase[J]. Plant Cell, 2003, 15(5): 1120-
1130.
[17] DILL A, THOMAS S G, HU J, et al. The Arabidopsis F-box
protein SLEEPY1 targets gibberellin signaling repressors for
gibberellin-induced degradation[J]. Plant Cell, 2004, 16(6): 1392-
1405.
[18] KEPINSKI S, LEYSER O. The Arabidopsis F-box protein
TIR1 is an auxin receptor[J]. Nature, 2005, 435(7041): 446-451.
[19] LEVIN J Z, MEYEROWITZ E M. UFO: an Arabidopsis gene
involved in both floral meristem and floral organ development[J].
Plant Cell, 1995, 7(5): 529-548.
[20] INGRAM G C, DOYLE S, CARPENTER R, et al. Dual role
for fimbriata in regulating floral homeotic genes and cell divi-
sion in Antirrhinum[J]. The EMBO Journal, 1997, 16(21): 6521-
6534.
[21] BUCHE C, POPPE C, SCHAFERr E, et al. eid1: a new Ara-
bidopsis mutant hypersensitive in phytochrome A-dependent
high-irradiance responses[J]. Plant Cell, 2000, 12(4): 547-558.
[22] DIETERLE M, ZHOU Y C, SCHAFER E, et al. EID1, an F-
box protein involved in phytochrome A-specific light signaling[J].
Genes Development, 2001, 15(8): 939-944.
[23] MALDONADO-CALDERON M T, SEPULVEDA-GARCIA E,
ROCHA-SOSA M. Characterization of novel F-box proteins in
plants induced by biotic and abiotic stress[J]. Plant Science, 2012,
185-186: 208-217.
[24] ZHANG Y, XU W, LI Z, et al. F-box protein DOR functions
as a novel inhibitory factor for abscisic acid-induced stomatal
closure under drought stress in Arabidopsis[J]. Plant Physiolo-
gy, 2008, 148(4): 2121-2133.
[25] PENG J, YU D, WANG L, et al. Arabidopsis F-box gene
FOA1 involved in ABA signaling[J]. Science China Life Sciences,
2012, 55(6): 497-506.
[26] LIU H, LIU B, ZHAO C, et al. The action mechanisms of
plant cryptochromes[J]. Trends in Plant Science, 2011, 16(12):
684-691.
[27] ZHENG X, WU S, ZHAI H, et al. Arabidopsis phytochrome B
promotes SPA1 nuclear accumulation to repress photomorpho-
genesis under far-red light[J]. Plant Cell, 2013, 25(1): 115-133.
[28] QIN Y, LI X, GUO M, et al. Regulation of salt and ABA re-
sponses by CIPK14, a calcium sensor interacting protein ki-
nase in Arabidopsis[J]. Science China Life Sciences, 2008, 51
(5): 391-401.
[29] KURODA H, YANAGAWA Y, TAKAHASHI N, et al. A com-
prehensive analysis of interaction and localization of Ara-
bidopsis SKP1-like (ASK) and F-box (FBX) proteins [J]. PLoS
One, 2012, 7(11): e50009.
[30] KOOPS P, PELSER S, IGNATZ M, et al. EDL3 is an F-box
protein involved in the regulation of abscisic acid signalling in
Arabidopsis thaliana[J]. Journal of Experimental Botany, 2011,
62(15): 5547-5560.
[31] YAN J, LI H, LI S, et al. The Arabidopsis F-box protein
CORONATINE INSENSITIVE1 is stabilized by SCFCOI1 and
degraded via the 26S proteasome pathway[J]. Plant Cell, 2013,
25(2): 486-498.
Vector ASK1 ASK2
(+)His
(-)His
(+)His
(-)His
At
3g
16
74
0D
At
3g
16
74
0
ASK3 ASK4 ASK5 ASK6 ASK7 ASK8 ASK9 ASK11 ASK12 ASK13 ASK14 ASK15 ASK16 ASK17ASK18ASK19 ASK21 vector
Ve
cto
r
图 7 At3g16740 与 ASK 蛋白家族成员相互作用的酵母双杂分析
Fig.7 Yeast two hybrid analysis of interaction between At3g16740 and members of ASK protein family
β-gal
-His
+3-AT
(10 mmol·L-1)
+His
BD
-A
t3g
16
74
0/A
D
BD
-A
t3g
16
74
0/A
D-
AS
K1
BD
-A
t3g
16
74
0/A
D-
AS
K2
BD
-A
t3g
16
74
0/A
D-
AS
K1
1
BD
-A
t3g
16
74
0/A
D-
AS
K5
BD
AD
492