全 文 ：2011年 月
第 卷 第 期
四川大学学报 自然科学版
一
拟南芥糖基转移酶基因
克隆和功
〔及子 启动子的
能
张建军 , 文国琴 , 刘 震 ,
分析
童仕波 , 杨 毅
四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室 , 成都
摘 要 通过 扩增 ,从拟南芥中克隆到长度为 的 〔叉子 基因启动子 ,并构建
了此种启动子与 嵌合的重组载体 ,通过农杆菌介导法转化拟南芥 ,得到转基因拟南芥 ,
并且通过启动子分析软件对全序列进行分析 ,发现在该段序列中含有典型的 一 、
一 和光应答元件 、干旱应答元件 等一些顺式作用元件 利用分光光度法测
定转基因植株在光照 、干旱和 等胁迫处理下的 酶活力 ,结果表明 转基因植株的
酶活力介于野生型和 阳性对照之间 ,与正常条件下生长的转基因植物相比 ,光照处
理 和 后其 酶活力分别增加 倍和 倍 干旱和 胁迫处理后并未发现酶活
力有明显的增强 可见基因乙心 启动子对光照有应答 ,而对干旱和 无应答
关键词 拟南芥 启动子 光照胁迫 酶活力
中图分类号 文献标识码 文章编号 一 一 一
一 , 一 , , 一 , 产
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一 ,
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收稿日期 一 一
基金项 目 国家 自然科学基金
作者简介 张建军 一 , 男 , 山西朔州人 , 硕士 , 研究方向为植物遗传和分子生物学 一 。。
通讯作者 杨毅 一
四川大学学报 自然科学版 第 卷
, , ,
引 言
糖基转移酶 , 是细
胞内广泛存在的一类由多基因家族所编码的酶 ,是
一类与多糖 、糖脂 、糖蛋白 、植物次生代谢物以及核
酸等生物分子的代谢密切相关的酶 目前 ,已知的
根据序列同源性和催化机制被分为 个家
族 ,其中家族 包含了最多的成员 具有催
化糖基化反应 、调节激素代谢 、增加化合物的稳定
性 、参与环境中有害物质的解毒等生理功效川 另
外 , 在植物体受到外界环境胁迫时表达量增
多 ,对植物抵御和适应环境变化起着重要作用 ,
如拟南芥 和 是抗土豆假单
胞菌必需的闭 是将糖分子从活化的供体糖
转移到受体生成糖昔键 ,供体是糖分子的活化形
式 ,在植物体内一般以 一葡萄糖作为供体 ,受
体包括内源性的糖类 、脂类 、细胞分裂素 、生长素 、
脱落酸等植物激素和黄酮类 、生物碱等许多小分子
物质以及一些外源性物质如抗生素 、杀虫剂等
能使一些激素或信号分子糖基化 ,参与信号
调节 ,如糖基化调节植物激素平衡 很多植物激素
经糖基化成为最终的无活性形式 ,或者糖基化成过
渡态而储存 ,通过去糖基化而恢复其活性闭
在植物表达载体中广泛应用的启动子主要是
组成型启动子 ,如水稻肌动蛋白基因 启动子 ,
花椰菜花叶病毒 启动子等 虽然使用这
些启动子可以使 目的基因在体内高效表达 ,但对非
组成型表达的目的基因的实际生物学功能的研究
确有一定的缺陷 因此 ,对特异表达启动子 ,特别是
具组织 、器官特异性启动子和诱导型启动子的研
究 ,越来越受到重视
本实验室前期从拟南芥中克隆到的 〔石
基因 ,作为 的家族 的成员 ,推测其具有使
糖基化功能 ,并通过转基因拟南芥体系 ,对其
进行了初步探讨图 本文在前期研究基础上 ,构建
了该基因启动子与载体 连接的真核表达载
体 ,通过农杆菌介导转化法 ,得到了转基因拟南芥
植株 ,并对其在不同胁迫处理条件下的 酶活
力进行分析 ,发现该启动子是受光照胁迫诱发的诱
导型启动子 本研究为进一步揭示 〔尤子 基因
的时空表达和功能作用奠定了基础
材料与方法
材 料
野生型拟南芥 。。 生
态型 ,由本实验室保存并种 植 大肠杆 菌菌株
。和农杆菌菌株 由本实验室保存
一 载体克隆试剂盒 、 连接酶和研
究所需限制性内切酶均购 自 公司
载体由绵阳师范学院王劲教授惠赠 其他常规分子
生物学试剂购自成都博瑞克生物技术公司
方 法
载体构建及转基因植株的筛选和检测 利
用软件 设计基因特异性引物
上 游 一
一 和 下 游 一
一 用 法提取野生型拟南芥的基
因组 并纯化 ,以此为模板 , 扩增连接至
一 载体 ,转化大肠杆菌 。,进行菌落
鉴定 ,对反向插人的阳性克隆送到上海英俊
进行测序
反向 一 和 载体都用
和 进行双酶切 ,回收 目的片段 ,连接并转
化 。感受态菌株 ,利用 特异性上游引物和
下 游 引 物 一
一 进行菌落 鉴定 ,对阳性转化
子质粒小抽 ,酶切鉴定
将构建好的 重组质粒转化至农杆
菌 ,花序浸染法转化拟南芥 收集 。代
种子 , ℃春化后 ,置于 · 一`上
培养 ,观察生长情况 挑取阳性苗转移至土壤栽培 ,
待发育至一定阶段后 ,提取 转基因植株叶片总
,进行 鉴定 筛选出的阳性苗 , 代移栽
于土壤中进行培养 ,单株收种子 , 代 ,继续筛选
最终得到 代纯合种子
用相同的方法将 转化拟南芥 ,筛选得
到 阳性对照转基因植物
启动子序列分析 利用植物顺
式作用调控因子数据库 】和植物顺
式作用调控元件 模体的数据库 ”口
对启动子序列进行顺式作用元件分析并预测功能
区域
第 期 张建军等 拟南芥糖基转移酶基因〔石丁 启动子的克隆和功能分析
,`﹃﹄
分光光度法测定转基因植物 酶活力
以正常条件下生长到四周的转基因拟南芥为
材料 ,液氮中研磨成粉末 ,加人 倍体积提取缓冲
液 ,
, 一 , 户琉基乙醇 ,
, 。, 拌
, 离心 ,收集上清液 ,用
法测定提取液中总蛋白含量
取编号的 支试管 ,分别加入总蛋白含量为
。哆 的 提取液 ,再加人反应缓冲液至反应
总体积为 ,混匀 立即向 号管中加人
匹 反应终止液 一氨基一一甲基一丙二醇 ,
此为反应 时的样品 其他 管置于 ℃保温 ,分
别在 、 、 、 和 后向管内加人 拜
反应终止液 ,为不同反应时间的样品
将样品置于分光光度计中 ,以 时样品为空
白 ,测定不同反应时间的样品在 的光吸收
值 根据定义 酶活力二每分钟生成的对硝基苯酚
样品蛋白含量 。 ,作线性拟合曲线
并求出各样品的酶活力 在本实验条件下 ,对硝基
苯酚消光系数为 ,反应体积为 时 ,
。 的光吸收值代表 反应产物 〕
光照胁迫处理下转基 因植物的 酶活
力测定 转基因拟南芥在正常生长条件 光照强度
约为 拌 , , 光照 黑暗 , ℃ ,
相对湿度为 生长到四周 ,用于各种胁迫处
理 光照胁迫处理 植株经 黑暗培养后 ,再经
光照和 光照后收集材料 ,对照材料经 黑
暗培养后收集 将收集好的材料用上述方法测定其
酶活力
洲〕
耳 〕
图 〔 子 启动子全长克隆
, 产物
比 岛 即
,
图 转基因植物的筛选和鉴定
结 果
基因克隆及转基因植株的筛选和鉴定
以拟南芥基因组总 为模板 , 特异上
下游引物扩增 〔足子 启动子区段 ,扩增出与预
期 相符的特异性条带 图 通过载体构建
及花序浸染法转化拟南芥 ,得到 。代种子 ,
。 , 一培养基上生长的阳性植株与野
生型植株有明显的差异 ,表现在根的生长和发育正
常 ,子叶颜色较绿 ,箭头所指为阳性苗 图 提取
该阳性苗的基因组 , 扩增表明 已经
成功整合到拟南芥植物基因组中 ,并继续对转基因
。代种子进行筛选 ,得到 代纯合种子进行后续
实验 同样证明 阳性对照植株构建成功
启动子序列和功能元件分析
测序结果表明 ,克隆得到的 片段长度为
经 与
数据库的查询和 软件的
分析 ,推测转录起始从 位的 开始 ,保守的
盒 位于其上游一 ,
盒位于一 处 ,此外还含有多种顺式作用元
件 ,如光应答相关元件 、拟南芥早期干旱应答
元件 和 应答相关元件 等
元件的分布位置和核心序列详见图 和表
转基因植物 酶活力的测定
利用分光光度法测定转基因 、野生型
和 阳性对照植物的 酶活力 ,分别
为 , 和 对硝基苯酚
蛋白 图 , 转基因植物的 酶活力介于野
生型和阳性对照植物之间 ,确定构建的该启动子稳
定表达体系正确无误 另外转基因植物的酶活力比
阳性对照植物低很多 ,初步说明拟南芥中该启动子
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丁 胃卜
图 启动子的序列分析
波浪线表示引物序列 , 处表示转录起始位点 ,阴影部分表示翻译起始位点 ,其他标注表示顺式作用元件
乙子
表 启动子顺式作用元件的分布
一
顺式作用元件名称 分布位置 核心序列
〕
一
一
一 ,一 , 一 ,一 , 一 ,一 , ,
一 , 一
一
一
一 , 一
︵祖洲日助、兴樱友高幽︶只华谧︵皿幽飞月劲日、樱禽之兴溯已︶只谧华口
植物株系 光照时间
图 分光光度法检测转基因植物 活性
转基因植物 酶活力的测定 光照胁迫处理后转基因植物 酶活力的测定
。全
第 期 张建军等 拟南芥糖基转移酶基因 〔石 启动子的克隆和功能分析
在正常生长条件下的转录效率不是非常高 ,可能属
于弱启动子
光胁迫后转基因植物 酶活力的测定
为了检测逆境条件下 乙心 启动子的活
性 ,我们对光照 、干旱和 胁迫条件下转基因
拟南芥中 酶活力进行了分析测定 结果发
现 ,未经光照处理的转基因拟南芥 酶活力为
对硝基苯酚 蛋白 经 和
光照胁迫处理后 ,转基因拟南芥的 酶活力
分别为 和 对硝基苯酚 蛋
白 ,比未处理时增加约 倍和 倍 ,同时野生型和
阳性对照植株经处理后酶活力几乎没有明显
变化 图 该结果表明几心 启动子是一
个受光照胁迫条件引发的诱导型启动子
讨 论
基因植物株系表现出种子的休眠程度降低 、干旱不
耐受 、离体叶片失水率加强等性状上的改变 ,都符
合植物 缺陷表型 而糖基化作用能修饰许多
小脂溶性化合物 ,从而调节化合物的生物活性及其
代谢 , 被认为是植物细胞内小分子物质的管
理者 ,所以推测 可能参与 的内稳
态调节 ,成为继 〔石丁 后又一个新 的参与
内稳态的糖基转移酶 〔〕本实验试图从该基
因转录调控水平去研究该基因启动子是否受干旱
和 胁迫诱导 ,但是发现在干旱和 胁迫
处理下该基因启动子并未表现出诱导应答现象
基因转录调控有其错综复杂的生物学机制 ,为
了弄清楚该基因启动子中起作用的光应答相关元
件的具体位置 ,需要将启动子进行分段研究 ,构建
缺失表达载体 ,借助原生质体瞬时表达等手段进行
进一步研究
本实验克隆了 启动子 ,并对其序列
进行分析 ,发现该序列中包含多个与逆境胁迫 光
照 、干旱和植物激素 诱导有关的顺式作用元件 ,如
是光应答相关元件 ,是许多光调控基因共同
的结合位点 ,能与 一 复合物结合
并使之更稳定 〔“〕 在拟南芥早期干早应答中
起关键作用 〕 和 是拟南芥干早和
应答顺式作用元件 一 〕等 由此可推测克隆
到的 〔心 启动子可能是一个与逆境胁迫有
关的启动子 进而我们构建了该启动子和 嵌
合的重组载体 ,通过农杆菌介导法转化拟南芥 ,得
到转基因拟南芥 ,并运用 检测其基因组
及测定 其 酶活 力 的手 段 , 确定 构 建 的
〔及子 启动子稳定表达体系正确无误 本研究
发现正常生长条件下转基因拟南芥与 阳性对
照植株相比其 酶活力非常低 ,出现这种情况
的原因 可能是由于该启动子的 盒的位置
与其在真核生物基因中的通常分布情况 位于转录
起始位点上游 士 处 不同 ,进而影响 复
合物与 盒的结合亲和力 ,减弱了启动子的
活性 「`〕接下来我们 以光照 、干旱 、葡萄糖和
胁迫处理转基因植株 ,测定其 酶活力的变
化 ,发现该启动子受光照诱导启动表达 ,这一结果
与序列分析结果一致 序列分析发现该启动子序列
中存在八个光应答相关元件 ,是顺式作用元
件最多的一种 但是目前尚不知道是哪个或哪几个
元件起作用
实验室前期研究发现 ,议子 过量表达转
参考文献
〔 〕
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〔 」
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马章众 , 祝丹丹 , 严金平 , 等 拟南芥中与
相互作用蛋白质的初步研究 〔 四川大学学报 自
然科学版 , ,
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96 0 四川大学学报 自然科学版 第 卷
一
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责任编辑 白林含