全 文 ：基金项目：北京市科技计划项目(No. D121100003112001, No. D121100003112004)
收稿日期：2013-08-07 接受日期：2013-10-01
Online system: http://www.jabiotech.org
农 业 生 物 技 术 学 报
Journal of Agricultural Biotechnology
2013, 21(12): 1413~1419
DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2013.12.002
研究论文
Article
乙烯在赭曲霉毒素A(OTA)诱导的拟南芥毒性中的作用
郝俊冉 1 彭晓丽 1 许文涛 1，2，3* 吕杨俊 1 翟亚楠 1 黄昆仑 1，2，3
1中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京100083；2农业部转基因生物食用安全检验监督测试中心，北京100083；3营养健康与食品
安全北京市重点实验室，北京100083
*通讯作者，xuwentao1111@sina.com；HKL009@163.com
摘 要 赭曲霉毒素A(ochratoxin A, OTA)是毒性最强的真菌毒素之一，具有较强的动物毒性和植物毒
性。乙烯(ethylene, ETH)作为植物激素能够调节植物生长、发育、响应生物及非生物胁迫的多个环节，但
是乙烯在OTA诱导的拟南芥(Arabidopsis thaliana)植物毒性中的作用尚不清楚。本研究利用气相色谱测
定了OTA处理下拟南芥叶片乙烯和乙烯前体氨基环丙烷羧酸(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid,
ACC)含量的变化。结果显示，OTA胁迫促进了ETH和ACC含量的上升；通过实时荧光定量PCR检测到
OTA能诱导ETH合成限速酶——ACC合成酶(ACC synthase, ACS)基因ACS6的表达，且这种诱导作用与
OTA的胁迫时间有关；ACC和乙烯作用抑制剂(AgNO3)分别与OTA作用处理拟南芥叶片后，观察到ACC
能加重OTA引起的叶片坏死斑，增加相对电导率和活性氧含量，加剧OTA对叶片的伤害，而AgNO3则引
起相反的作用效果，缓解OTA引起的植物损伤。本研究结果表明，乙烯参与了OTA诱导拟南芥毒性的
过程，并且乙烯在拟南芥响应OTA胁迫中可能起到负调控的作用。本研究初步明确了乙烯在OTA诱导
的拟南芥毒性中的作用与部分机理，为深入研究OTA植物毒性致毒机理提供了基础资料。
关键词 拟南芥，赭曲霉毒素A(OTA)，乙烯，毒性
Role of Ethylene in Ochratoxin A(OTA) Toxicity to Arabidopsis thaliana
HAO Jun-Ran1 PENG Xiao-Li1 XU Wen-Tao1,2,3* LV Yang-Jun1 ZHAI Ya-Nan1 HUANG Kun-Lun1,2,3
1 College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China; 2 The Supervision, Inspection &
Testing Center of Genetically Modified Orginisms Food Safety, Ministry of Agriculture, Beijing 100083, China; 3 Beijing Key Laboratory of Nu-
trition, Health & Food Safety, Beijing 100083, China
*Corresponding author, xuwentao1111@sina.com
Abstract Ochratoxin A (OTA) is one of the most toxic mycotoxins to both animals and plants. Ethylene
(ETH), as a gaseous plant hormone, contributes greatly to a wide range of cellular and developmental process-
es, and it responses to abiotic and biotic stress. However, the role of ETH in OTA toxicity to Arabidopsis thali⁃
ana is not uncovered. In this study, ETH and the ethylene biosynthetic precursor 1-aminocyclopropane-1-car-
boxylic acid (ACC) content of A. thaliana leaves exposed to OTA were measured by high performance liquid
chromatography. The results showed that OTA treatment increased ETH and ACC content in A.thaliana
leaves. Quantitative Real-time PCR was performed to determine the relative expression level of ACC synthase
gene 6 (ACS6) which is an important gene in ETH synthesis, and ACS6 expression was induced by OTA and
农业生物技术学报
Journal of Agricultural Biotechnology
赭曲霉毒素A (ochratoxin A, OTA)是由青霉属
和曲霉属等真菌产生的一种次级代谢产物，其化学
分子式为 C20H18ClNO6(van der Merwe et al., 1965;
郝俊冉等, 2012)。OTA广泛存在于谷物、食品及饲
料中，还曾在水果、牛奶等中被检测到。OTA通过
进食间接进入动物和人的血液，并在许多器官积
聚，能对肾、肝造成损伤并且具有致畸、致癌和致突
变等作用 (Schwerdt et al., 2003; Cui et al., 2010;
Coronel et al., 2011; Jennings et al., 2012; Shen et
al., 2013)。和许多其他真菌毒素一样，OTA具有较
强的植物毒性，OTA能抑制玉米(Zea mays)胚芽萌
发期根和茎的伸长 (McLean, 1996)，在抑制洋葱
(Allium cepa)根部生长的同时还能引起洋葱染色体
水平的基因损伤(Lerda et al., 2010)。本研究组从
多个角度研究了 OTA诱导的拟南芥 (Arabidopsis
thaliana)植物毒性，结果发现，OTA可以抑制植株
的生长，导致拟南芥叶片细胞损伤或坏死，诱导坏
死病斑的产生，活性氧 (reactive oxygen species,
ROS)的爆发及抗氧化系统的全面响应 (Peng et al.,
2010)。OTA还可以引起基因及蛋白质表达异常，
破坏细胞膜完整性，造成DNA降解，诱导植物细胞
程序性死亡(王龑等, 2010)。除此之外通过数字基
因表达谱(digital gene expression tag profile, DGE)
及蛋白组学研究发现，OTA诱导的拟南芥毒性是一
个复杂的过程，包括光合作用、光呼吸等在内的多
条生物通路都参与其中，并且水杨酸等信号传递分
子都发挥了重要作用(Wang et al., 2013;赵维薇等,
2012)。
乙烯(ethylene, ETH)是重要的植物激素之一，
通过蛋氨酸 - S-腺苷蛋氨酸 -氨基环丙烷羧酸
(ACC)-乙烯的途径进行生物合成，其中ACC为乙
烯合成的前体物质，ACC合成酶 (ACC synthase,
ACS)是乙烯合成的限速酶。研究表明，乙烯能够
调节植物的生命活动，从种子萌发，幼苗生长，植
株衰老到响应胁迫的整个生命过程中，乙烯都起
了重要作用。乙烯信号在调节植物响应生物和非
生物胁迫中具有“遇激而增，信急应变”的性质和
作用。研究发现，FB1 和 AAL 在诱导番茄
(Lycopersicon esculentum)细胞死亡过程中会诱导番
茄乙烯合成酶基因 ACS2和ACC氧化酶基因 ACO
的表达(Moore et al, 1999)。在研究低钾对拟南芥
损伤过程中发现，钾缺乏能够诱导乙烯合成相关
基因的表达，并且可能通过自身或者乙烯不敏感
基因 EIN2来调节拟南芥响应钾胁迫(Jung et al.,
2009)。本研究组在前期研究中用 0.25 mmol/L
OTA处理拟南芥离体叶片10 h后进行DGE结果分
析，发现乙烯合成酶基因ACS2和ACS6分别上调了
5.762倍和 4.53倍。另外，与乙烯响应有关的转录
因子(ethylene response factor, ERF)的表达也上调
了 15.9倍，说明乙烯可能参与了OTA诱导的拟南
芥毒性效应(彭晓丽, 2010; Wang et al., 2012)。为
进一步了解乙烯在OTA诱导的拟南芥毒性中的作
用，本研究通过添加乙烯调节剂等来探索乙烯在
OTA植物毒性的信号途径中的作用，了解乙烯在
OTA诱导的拟南芥毒性中的作用与部分机理，为深
入研究OTA植物毒性致毒机理提供基础资料。
1结果与分析
1.1 OTA处理对拟南芥叶片乙烯及ACC含量的影响
图 1结果表明，0.25 mmol/L OTA处理后拟南
芥离体叶片的乙烯和ACC含量整体呈先上升后下
降的趋势。乙烯含量在 10 h达到最高峰，峰值为
(3.89 ± 0.45) nmol/(h · kg FW)，与 0 h 比上升了
13.56 倍，甲醇对照组在 10 h 也出现了乙烯高峰，
与0 h比上升了2.92倍(图 1A)。在OTA处理后的
the effect was related to the treatment time of OTA. When exogenous ACC with OTA was added to A.thali⁃
ana leaves, aggravated lesions, promoted relative leakage rate and increased reactive oxygen species content
were observed, showing that ACC could intensify the damage of OTA to leaves. What was in contrast with the
results above was that in the presence of the ethylene receptor antagonist Ag+ by addition of AgNO3, the toxici-
ty of OTA to A.thaliana leaves was lessened. The research indicated the involvement of ETH in phytotoxicity
of OTA as a possible negatively regulator. This study preliminary reveals the role and partly mechanism of
ETH in phytotoxicity of OTA to A.thaliana, and can provide foundation for further research on the mechanism
of phytotoxicity of OTA.
Keywords Arabidopsis thaliana, Ochratoxin A(OTA), Ethylene, Toxicity
1414
前 20 h 内，ACC含量逐渐升高，在 20 h时达到高
峰，为 (1.97±0.12) nmol/(h·kg FW)，此后ACC含量
逐步降低。而对照组在处理过程中ACC含量一直
呈升高趋势，但幅度小于OTA处理组。在处理 6 h
后，OTA处理叶片中ACC含量达到显著水平(P＜
0.05)(图 1B)。说明OTA处理能促进乙烯和ACC
的合成，但是随着处理时间的延长，叶片受损程度
加深，影响了乙烯和ACC的合成，从而使其含量逐渐
降低。
1.2 OTA处理对乙烯合成相关基因表达的影响
ACS在调节乙烯生物合成中起关键的作用，是
催化 SAM向 ACC转化的限速酶。为了进一步验
证拟南芥在响应OTA胁迫时促进了乙烯的合成，
本研究通过实时荧光定量PCR检测了OTA处理拟
南芥叶片时ACS6的表达量(图 2)，在第 3、10及 20
h，ACS6的表达量分别是甲醇对照处理在相应时间
的 1.02、1.43和 3.05 倍，这表明OTA诱导了ACC
合成酶基因的表达，进而促进乙烯前体及乙烯的合
成。同时，ACS6的表达在 20 h 较之前为最高，与
ACC含量在 20 h出现高峰相一致，但是乙烯释放
高峰在 10 h出现，说明乙烯升高可能还有除ACS6
以外的基因起调节作用。
1.3外源ACC、乙烯抑制剂(AgNO3)分别与 OTA共
同处理对叶片形态的影响
本研究用不同浓度的ACC(0、0.005、0.050和
0.500 mmol/L)和 AgNO3(0、0.001、0.010 和 0.100
mmol/L)分别与0.500 mmol/L OTA协同处理，处理
时先用ACC或AgNO3预处理 3 h，然后添加OTA
进行处理，30 h后拍照观察(图 3)。从图 3可以看
出，0~0.500 mmol/L ACC及0~0.100 mmol/L AgNO3
单独处理对叶片外观形态均没有明显影响，但随着
ACC浓度的增加，ACC与 0.500 mmol/L OTA配合
处理加速叶片失绿，病斑数目增多，面积增大，
0.500 mmol/L ACC+OTA处理的叶片到第 30小时
几乎完全失色(图 3A)。与添加ACC不同的是，不
同浓度的AgNO3对OTA诱导的毒性效应均有所缓
解，且随着AgNO3浓度的增加，缓解作用越加明显
(图3B)。
1.4 ACC和Ag+分别与OTA共同处理对叶片相对
电导率的影响
0~0.050 mmol /L ACC 及 0~0.100 mmol /L
AgNO3单独处理叶片的电导率没有显著变化，但
ACC和OTA协同处理能促进OTA诱导的叶片细胞
死亡，相对电导率增加(图4A)，而AgNO3处理能缓解
OTA诱导的细胞膜损伤及相对电导率增加(图4B)。
1.5 ACC和Ag+分别与OTA共同处理对叶片ROS的
影响
选用 0.005 mmol /L ACC 和 0.010 mmol /L
AgNO3，测定处理后拟南芥叶片活性氧 (reactive
oxygen species, ROS)含量。结果表明，0.005 mmol /L
ACC和 0.010 mmol /L AgNO3单独处理 ROS含量
变化不显著，但ACC+OTA处理组叶片中ROS含量
显著增加，比OTA单独处理增加了30.0%，而0.010
mmol /L AgNO3抑制了 OTA诱导的拟南芥叶片
ROS含量升高，比OTA处理降低了 22.1%(图 5)。
说明外源ACC加速了OTA产生ROS，而AgNO3则
起到一定的抑制作用。
2讨论
在乙烯的生物合成中，ACC为乙烯合成的前
0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
0
Control
OTA
乙
烯
释
放
量
/n
m
ol
·h- 1
·kg
- 1 F
W
E
th
yl
en
e
em
is
si
on
t/h A
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
0
1.5 3 6 10 20 30 48
t/h
A
C
C
含
量
/n
m
ol
·h- 1
·kg
- 1 F
W
A
C
C
co
nt
en
t
Control
OTA
B
图1 OTA处理乙烯释放量(A)及ACC释放量(B)
Figure1ETH(A)andACC(B)contentunderOTAtreatment
对照：0.122%甲醇；赭曲霉毒素A(OTA)：0.25 mmol/L；下同
Control: 0.122% methanol; ochratoxin A(OTA): 0.25 mmol/L;
The same below
乙烯在赭曲霉毒素A诱导的拟南芥毒性中的作用
Role of Ethylene in Ochratoxin A (OTA) Toxicity to Arabidopsis thaliana 1415
农业生物技术学报
Journal of Agricultural Biotechnology
0 0.001+0.500 0.010+0.500 0.100+0.500
0 0.001 0.010 0.100
0 0.005 0.050 0.500
0 0.005+0.500 0.050+0.500 0.500+0.500
体物质，ACC合成酶(ACS)是乙烯合成的限速酶。
本研究中测定了OTA胁迫时拟南芥叶片的乙烯和
ACC含量，在 OTA处理后的第 10小时出现了乙烯
高峰，为对照的 3.16倍，在OTA处理后的第 20小
时出现了ACC高峰。这说明 OTA能够诱导乙烯
生成，ACC高峰滞后于乙烯的出现可能是由于处
理前期ACC向乙烯转化所导致。彭晓丽(2010)和
Wang等(2012)的研究表明，0.25 mmol/L OTA处理
拟南芥离体叶片 10 h的DGE结果分析显示，乙烯
合成酶基因 ACS6 和 ACS2分别上调了 4.53和 5.76
倍。本研究结果与此相一致，但是研究中乙烯高峰
与ACS6表达高峰时间不一致，说明乙烯升高可能
还有ACS6以外的基因起调节作用，而ACS2则可能
是其中之一。
许多研究表明，乙烯信号在调节植物响应生物
和非生物胁迫，包括细胞死亡过程中起着重要作
用。Knoester等(2001)研究表明，乙烯合成抑制剂
和乙烯不敏感转基因烟草植株能够减轻烟草花叶
病毒侵染部位的植物超敏性细胞死亡和被侵染组
织的系统获得性抗性；Shi等(2012)采用类似的手
段在研究拟南芥幼苗冷胁迫时发现，在添加ACC
幼苗和乙烯过表达突变体幼苗中冷胁迫导致的伤
害加剧，而在添加乙烯竞争性抑制剂Ag+的幼苗中
冷胁迫伤害有所缓解，乙烯在冷胁迫中起到了负调
节的作用；在拟南芥响应盐胁迫的过程中，乙烯还
可以和NO共同作用通过改变质膜 H+-ATP酶的活
性从而调节离子平衡来响应胁迫，且乙烯在NO保
护拟南芥盐胁迫过程中可能是一个下游的信号分
子(Wang et al., 2009)。本研究用乙烯效应剂ACC
及AgNO3处理证明Ag+可通过与乙烯受体不可逆
的结合抑制乙烯与受体的结合，从而抑制乙烯的生
理作用。研究发现，外源ACC的加入促进了 OTA
诱导拟南芥病斑的产生，增加了细胞膜透性，提高
了 ROS水平。而AgNO3的加入一定程度上缓解了
OTA对拟南芥的毒性，对细胞膜透性和ROS水平
的升高均有一定的抑制效果。综合判断，乙烯信号
传递途径是对 OTA诱导的细胞死亡或是 PCD可
能起了负调控的作用。
本研究组前期的DGE结果显示与乙烯响应有
关的转录因子 ERF上调表达了 15.9倍 (彭晓丽,
2010; Wang et al., 2012)。ERF1处在乙烯和茉莉酸
0 3 10 20
10
8
6
4
2
0
AC
S6
相
对
表
达
量
AC
S6
re
la
ti
ve
ex
pr
es
si
on Control
OTA
t/h
图2 OTA胁迫下ACS6的表达
Figure 2 The expression of ACS6 under OTA stress detect⁃
ed by Real-time PCR
内参基因为Actin2，n=3
The internal reference gene was Actin2, n=3
图3外源ACC和AgNO3对OTA诱导的叶片损伤
Figure 3 Leaf injury induced by OTA with exogenous
ACC and AgNO3
ACC(A)或AgNO3(B)处理3 h后，在对照组和处理组中分别
加入 0.224%甲醇溶液 (上排)，0.500 mmol/L OTA溶液 (下
排)，30 h后拍照。0~0.500 mmol/L ACC和 0~0.100 mmol/L
AgNO3单独处理对叶片外观形态均没有明显影响；ACC+
0.500 mmol/L OTA处理加速叶片失绿，病斑数目增多，面积
增大；AgNO3+OTA对OTA诱导毒性有所缓解
ACC(A) or AgNO3(B) treatment lasted for 3 h, then 0.244%
methanol (upper line) and 0.500 mmol/L OTA (lower line)
were added respectively. Leaves treated with 0~0.500 mmol/L
ACC or 0~0.100 mmol/L AgNO3 alone showed no obvious
damage in appearance morphology; ACC+0.500 mmol/L OTA
treatment accelerated leaf chlorosis, increased the number and
areas of the necrotic lesions; The toxicity induced by OTA was
alleviated with the treatment of AgNO3+OTA
30 h
ACC
ACC
+OTA
A
AgNO3
+OTA
B
浓度/mmol·L-1
Concentration
AgNO3
30 h
1416
信号转导的上游并在拟南芥响应非生物胁迫中发
挥作用，研究表明，ERF1超表达植株能够通过调节
特异基因从而对乙烯茉莉酸乃至脱落酸的信号转
导产生影响从而增加拟南芥对盐胁迫和热胁迫的
抗性(Cheng et al., 2013)，因此，通过对ERF的研究
有助于明确乙烯在OTA诱导拟南芥植物毒性中的
信号途径，以及该途径与其他信号途径之间的相互
作用，从而全面了解OTA的植物毒性。除此之外，
OTA诱导拟南芥植物毒性初期乙烯的作用，采用
多样化的处理方式，如乙烯代谢改变的突变体或转
基因植物等，可以更好的研究其信号作用及交互关
系。本研究为深入研究OTA植物毒性致毒机理提
供了基础资料，同时为研究其他激素在植物抗逆过
程中的作用机制提供了思路。
3材料与方法
3.1实验材料及处理
拟南芥(Arabidopsis thaliana)，Columbia-0型，由
中国科学院遗传与发育研究所馈赠。拟南芥的种
植条件等参照王龑等 (2010)。赭曲霉菌株
(Aspergillus ochraceus, 3.4412)由本实验室保存。赭
曲霉毒素A(ochratoxin A, OTA)为实验室自行提取
(梁志宏, 2008;王龑等, 2010)最终提取的OTA溶解
在甲醇中待用。。
处理组先用效应剂渗透处理拟南芥离体叶片
3 h，之后加入OTA与效应剂共同处理样品并计时，
一定时间后取样测定指标。对照组先用双蒸水渗
透处理叶片 3 h，再加入与OTA等体积的甲醇处
理。环境条件及数据处理均参照赵维薇等(2012)，
每项指标的数据均由3次重复实验得出。
3.2主要仪器及试剂
仪器：Perkin Elmer Series 200 HPLC，C18 柱
(Perkin Elmer Series 200, 美国)；电导仪 (DDS- 11
型, 上海精科)；荧光定量 PCR 仪 (Qiagen Rotor
Qgene, 德国)；分光光度计 (UNIC UV- 2100, 美
国 )；气相色谱仪(岛津GC-14C型,日本)。
试剂：TRIZON Reagen RNA 提取试剂盒，
0 0.005 0.050
ACC
OTA+ACC
35
30
25
20
15
10
5
0
相
对
电
导
率
/%
R
el
at
iv
e
la
ck
ag
e
ra
te
ACC浓度/mmol·L-1
Concentration of ACC A
25
20
15
10
5
0
相
对
电
导
率
/%
R
el
at
iv
e
la
ck
ag
e
ra
te
AgNO3浓度/mmol·L-1
Concentration of AgNO3
AgNO3
OTA+AgNO3
0 0.001 0.010 0.100
B
图 4 外源 ACC(A)和 AgNO3(B)对 OTA 诱导的叶片相对
电导率的影响
Figure 4 Relative leakage rate of leaves induced by OTA
with exogenous ACC(A) and AgNO3(B)
ACC或AgNO3处理 3 h后，在对照组和处理组中分别加入
0.224%甲醇溶液和 0.500 mmol/L OTA溶液，24 h后测定叶
片相对电导率
ACC or AgNO3 treatment lasted for 3 h, then 0.244% metha-
nol and 0.500 mmol/L OTA were added respectively to the
control or treatment group, the relative leakage rate of leaves
was measured after 24 h
1 2 3
1000
800
600
400
200
0R
O
S
含
量
/R
F
U
·mg
- 1 p
ro
te
in
R
O
S
co
nt
en
t
4 5 6
组别
Groups
图5外源ACC和AgNO3对OTA诱导的叶片ROS含量的影响
Figure 5 ROS content of leaves induced by OTA with exog⁃
enous ACC and AgNO3
1：对照 (0.244%甲醇)；2:ACC(0.005 mmol/L)；3：AgNO3
(0.010 mmol /L)；4：OTA(0.500 mmol/L)；5：OTA+ ACC；6：
OTA+AgNO3。叶片处理同图4，24 h后测定各组ROS含量
1: Control(0.244% methanol); 2: ACC(0.005 mmol/L); 3: Ag-
NO3(0.010 mmol /L); 4: OTA(0.500 mmol/L); 5: OTA+ ACC;
6: OTA+AgNO3. Treatment on the leaves was same as figure 4
and ROS content was measured after 24 h
乙烯在赭曲霉毒素A诱导的拟南芥毒性中的作用
Role of Ethylene in Ochratoxin A (OTA) Toxicity to Arabidopsis thaliana 1417
农业生物技术学报
Journal of Agricultural Biotechnology
HiFi- MMLV cDNA 第 一链 合成 试 剂盒，Real
SYBR Mixture均购自北京康为世纪生物科技有限
公司；乙烯合成前提物质(ACC)及乙烯作用抑制剂
(AgNO3)均购自百灵威科技有限公司。
3.3方法
3.3.1 ETH的提取及含量测定
取大约 10片叶，蒸馏水冲洗3遍，然后放入含
1 mL蒸馏水容积大约为 20 mL的容器中，密闭3 h，
用注射器抽取1 mL气体，用于乙烯含量测定。乙烯
含量采用岛津 GC-14C型气相色谱仪测定，GDX-
502填充柱，柱长 1.5 m，氢离子火焰检测器(FID)检
测，N2为载气，燃气为H2，流速为20 mL/ min，进样温
度120℃，柱温60℃，检测器温度150℃。
3.3.2 ACC含量测定
称取约 0.3~0.5 g叶片，5 mL 80%乙醇研磨，
10 000×g 离心 10 min，取上清；残渣加 2 mL 80%
乙醇 70 ℃浸提 30 min，离心、合并上清；提取液在
60 ℃下真空旋转蒸发至干，用 2 mL双蒸水定容，
摇匀做为制备液；取 0.25 mL制备液于密闭小瓶
中，加预冷的 0.1 mL 25.0 mmol/L 的 HgCl2和 0.6
mL蒸馏水，密闭，然后注入预冷的 0.1 mL 5%
NaClO-饱和NaOH混合液(2∶1, V/V)，冰浴中放置
2 min，取出后马上抽取1 mL气体测定乙烯含量。
3.3.3基因相对表达量测定
采用 TRIZON Reagen RNA提取试剂盒进行
总RNA提取，HiFi-MMLV cDNA第一链合成试剂
盒用于反转录，双标准曲线法用于数据的相对定量
分析。测定ACC合成酶基因 ACS6表达量所用的
引物：
F：TTTCGGTCTTGTTTCGTC；
R：GGTTATCTCAGCGTGCC。
扩增体系为 25 µL：Temple cDNA(50 ng/µL)5
µL；2.5 × SYBR GREEN Ⅰ MasterMix 12.5 µL；
Forward primer(10 µmol /L) 0.6 µL；Reverse temple
(10 µmol /L) 0.6 µL；添加ddH2O至25 µL。反应程
序：94 ℃预变性 10 min，40个循环；变性 94 ℃ 15
s，退火60 ℃ 15 s，延伸72 ℃ 30 s。基因相对表达
量的计算应用 F=2- ΔΔCt 计算得出。其中 ΔΔCt=
(CtTarget-Ct 内参)OTA-(CtTarget-Ct 内参)Control ，式中Ct.Target代表
待测基因的Ct值，Ct内参代表内参基因的Ct值。内参
基因为Actin2，n=3。
3.3.4相对电导率测定
相对电导率测定参照文献 (Romero-Puertas et
al., 2004)进行。
3.3.5 ROS测定
ROS 含量测定参照文献 (Mahalingam et al.,
2006)进行，其中蛋白定量采用考马斯亮蓝G250法
(Bradford, 1976)。
参考文献
Bradford M M, 1976. Arapid and sensitive method for the
quantitation of microgram quantities of protein utilizing
the principle of protein- dye binding. Analytical
Biochemistry, 72: 248~254
Cheng M C, Liao P M, Kuo W W and Lin T P, 2013. The
Arabidopsis ethylene- response- factor1 regulates abiotic-
stress- responsive gene expression by binding to
different cis- acting elements in response to different
stress signals. Plant Physiology, DOI:10.1104/
pp.113.221911
Cui J F, Xing L X, Li Z N, Wu S, Wang J, Liu J, Wang J L,
Yan X and Zhang X H, 2010. Ochratoxin A induces G2
phase arrest in human gastric epithelium GES-1 cells in
vitro. Toxicology Letters, 193 (2): 152~158
Coronel M B, Sanchis V, Ramos A J and Marin S, 2011.
Ochratoxin A in adult population of Lleida, Spain:
Presence in blood plasma and consumption in different
regions and seasons. Food and Chemical Toxicology, 49
(10 ): 2697~2705
Hao J R, Xu W T and Huang K L, 2012. Research on the
mechanism of biosynthesis, biotransformation and
toxicity of ochratoxin A. Science and Technology of
Food Industry, 12 (33): 427~433(郝俊冉,许文涛,黄昆
仑, 2012.赭曲霉毒素 A生成转化及致毒机制的研究
进展.食品工业科技, 12 (33): 427~433)
Jennings P, Weiland C, Limonciel A, Bloch K M, Radford R,
Aschauer L, McMorrow T, Wilmes A, Pfaller W, Ahr H
J, Slattery C, Lock E A, Ryan M P and Ellinger-
Ziegelbauer H, 2012. Transcriptomic alterations
induced by ochratoxin A in rat and human renal
proximal tubular in vitro models and comparison to a rat
in vivo model. Archives of Toxicology, 86: 571~589
Jung J Y, Shin R and Schachtman D P, 2009. Ethylene
mediates response and tolerance to potassium
deprivation in Arabidopsis. The Plant Cell, 21: 607~621
Knoester M, Linthorst H J M, Bol J F and van Loon L C,
2001. Involvement of ethylene in lesion development
1418
and systemic acquired resistence in tobacco during the
hypersensitive reaction to Tobacco mosaic virus.
Physiological and Molecular Plant Pathology, 59: 45~57
Lerda D, Bistoni M B, Pelliccioni P and Litterio N, 2010.
Allium cepa as a biomonitor of ochratoxin A toxicity
and genotoxicity. Plant Biology, 12: 685~688
Liang Z H, 2008. Detection of ochratoxin A and analysis of
ochratoxigenic-fungi in foodstuff. Dissertation for Ph.D,
China Agriculture University, Supervisor: Luo Y B,
pp26~33(梁志宏, 2008. 粮食中赭曲霉毒素 A的检测
及产毒菌株的分析与研究.博士学位论文,中国农业
大学,导师:罗云波, pp.26~33)
Mahalingam R, Jambunathan N, Gunjan S K, Faustin E,
Weng H and Ayoubi P, 2006. Analysis of oxidative
signaling induced by ozone in Arabidopsis thaliana.
Plant Cell Environment, 29(7): 1357~1371
McLean M, 1996. The phytotoxicity of selected mycotoxins
on mature, germinating Zea mays embryos.
Mycopathologia, 132: 173~183
Moore T, Martineau B, Bostock RM, Lincoln J E and
Gilchrist D G, 1999. Molecular and genetic
characterization of ethylene involvement in mycotoxin-
induced plant cell death. Physiological and Molecular
Plant Pathology, 54: 73~85
Peng X L, 2010. The phytotoxic effects of ochratoxin A and
its mechanism on Arabidopsis thaliana. Dissertation for
Ph.D, China Agriculture University, Supervisor: Luo Y
B, pp100~106 (彭晓丽, 2010.赭曲霉毒素 A对拟南芥
的毒理机制研究. 博士学位论文, 中国农业大学, 导
师:罗云波, pp100~106)
Peng X L, Xu W T, Wang Y, Huang K L, Liang Z H, Zhao W
W and Luo Y B, 2010. Mycotoxin ochratoxin A-
induced cell death and changes in oxidative metabolism
of Arabidopsis thaliana. Plant Cell Report, 29(2): 153~
161
Romero- Puertas M C, Rodńguez- serrano M, Corpas F J,
Gómez M., Delrío L A and Sandalio L M, 2004.
Cadmium- induced subcellular accumulation of O2- and
H2O2 in pea leaves. Plant Cell & Environment, 27(9):
1122~1134
Schwerdt G, Freudinger R, Schuster C, Silbernagl S and
Gekle M, 2003. Inhibition of mitochondria prevents cell
death in kidney epithelial cells by intra- and
extracellular acidification. Kidney International, 63:
1725~1735
Shen X L, Zhang Y, Xu W T, Liang R, Zheng J J, Luo Y B,
Wang Y and Huang K L, 2013. An iTRAQ- based
mitoproteomics approach for profiling the
nephrotoxicity mechanisms of ochratoxin A in HEK
293 cells. Journal of Proteomics, 78: 398~415
Shi Y T, Tian S W, Hou L Y, Huang X Z, Zhang X Y, Guo H
W and Yang S H, 2012. Ethylene signaling negatively
regulates freezing tolerance by repressing expression of
CBF and type- A ARR genes in Arabidopsis. The Plant
Cell, 24: 2578~2595
van der Merwe K J, Steyn P S, Fourie L, Scott D B and
Theron J J, 1965. Ochratoxin A, a toxic metabolite
produced by Aspergillus ochraceus Wilh. Nature, 205:
1112~1113
Wang H H, Liang X L, Wan Q, Wang X M and Bi Y R, 2009.
Ethylene and nitric oxide are involved in maintaining
ion homeostasis in Arabidopsis callus under salt stress.
Planta, 230: 293~307
Wang Y, Hao J R, Zhao W W, Yang Z J, Wu W H, Zhang Y,
Xu W T, Luo Y B and Huang K L, 2013. Comparative
proteomics and physiological characterization of
Arabidopsis thaliana seedlings in responses to
ochratoxin A. Plant Molecular Biology, 82: 321~337
Wang Y, Peng X L, Xu W T, Luo Y B, Zhao W W, Hao J R,
Liang Z H, Zhang Y and Huang K L, 2012. Transcript
and protein profiling analysis of OTA- induced cell
death reveals the regulation of the toxicity response
process in Arabidopsis thaliana. Journal of Experimental
Botany, 63(5): 2171~2187
Wang Y, Xu W T, Peng X L, Luo Y B, Zhao W W, Tang X G
and Huang K L, 2010. Preliminary study on the toxicity
of ochratoxin A (OTA) in Arabidopsis thaliana. Journal
of Agricultural Biotechnology, 18(6): 1079~1083 (王龑,
许文涛, 彭晓丽, 罗云波, 赵维薇, 唐小革, 黄昆仑,
2010. 赭曲霉毒素A(OTA)对拟南芥植物毒性的初步
研究.农业生物技术学报, 18(6): 1079~1083)
Zhao W W, Xu W T, Peng X L, Wang Y, Hao J R and Huang
K L, 2012. Role of salicylic acid in ochratoxin A (OTA)
toxicity to Arabidopsis thaliana. Journal of Agricultural
Biotechnology, 20(2):146~151 (赵维薇, 许文涛, 彭晓
丽,王龑,郝俊冉,黄昆仑, 2012.水杨酸在赭曲霉毒素
A诱导的拟南芥毒性中的作用. 农业生物技术学报,
20(2): 146~151)
乙烯在赭曲霉毒素A诱导的拟南芥毒性中的作用
Role of Ethylene in Ochratoxin A (OTA) Toxicity to Arabidopsis thaliana 1419