全 文 ：第 0 3卷 第 2期
中 旧 种 堂 ( c辑 )
C S IE NC E N IC N H A I( Se r ie s C ) 2 0 0 0年 4月
拟南芥细胞死亡突变体 m 口d 1突变座位的
精细物理图谱构建 *
牟中林 戴 亚 李家洋 ` ’
(中国科学院遗传研究所 , 北京 10 01 01 )
摘要 拟南荞细胞死亡突变体 m 口d1 突变位点位于第 2 染色体分子标记 IG jS 和 m i 4 21
之间. 以这一 区域 Y A C 重叠群中的 Y A C 克隆末端 D N A 片段 C IC g A 3 R , C IC l l C 7 L,
CI C ZG S R 及 R F L P 分子标记克隆 C D s 3 为探针筛选 T A M U B A C 文库 , 获得 31 个阳性
B A C 克隆 . 用 B A C 克隆的末端 D N A 片段杂交所有阳性 B A C 克隆 , 确立 了由 T 6 PS,
T 7M 2 3
,
T 12 A 21
,
T S L 6及 T 18A 18 等克隆组成的M O D I 基因所在区域的B A C 重叠群 . 同
时在这一 区域发展出 n 个 C A P S 分子标记和 12 个 S T S 序标 , 为 M O D I 基因的图位克
隆与鉴定分析及这一 区域的全序列测定奠定 了基础 .
关键词 拟南芥 细胞死亡 m o dl 突变体 物理图谱 C A P S 分子标记
拟南芥是植物分子生物学研究的模式材料 , 近年来其研究取得了突飞猛进的发展 〔’ ] , 已有
的分子标记连锁图谱和物理图谱为拟南芥基因的定位克隆和基因组全序列测定奠定了良好的
基础 . 我们从甲基磺酸乙酷 (E M )S 诱变的拟南芥 M : 代中筛选到 1 株细胞死亡突变体 , 曲利苯
蓝染色结果显示其死亡细胞与活细胞镶嵌并存 12] . 该突变体被命名为 m nd l (m o s ia c d ea t h) . 植
物中已被确认的细胞死亡有两种类型 13] . 一类是植物生长发育过程中某些特定 的细胞或组织
经程序化死亡转变为特化细胞如筛管和导管 4[] , 或为其他细胞的生长发育提供营养 , 如胚柄细
胞 5[] . 另一类是超敏反应 , 是植物与病原菌相互作用时出现的细胞死亡现象 . m nd l 突变体中出
现的细胞死亡不同于植物生长发育过程中的程序化细胞死亡 , 因为它不局 限于某一特定的器
官组织 , 并且受外界环境条件的控制 ; m口 d1 突变体的细胞死亡也不同于植物发生超敏反应时
的细胞死亡 , 因为它不形成病斑 . 因此 m od l 突变体中的细胞死亡是一种新的细胞死亡类型 .
由于植物细胞死亡的机理仍不清楚 l6] , 发现新的细胞死亡突变体 、 定位和克隆与植物细胞死亡
有关的基因是阐明植物细胞死亡机理的重要途径 . M口D 了 基因的定位与克隆显然具有十分重
要的意义 .
初步的遗传分析将 m od l 突变位点定位于第 2 染色体上的两个分子标记 GI SI 和 m i 4 21 之
间 , 两者相距 5 . 8 c M (RI 图距 ) . 虽然这两个分子标记之间没有更多适合于 m od l 突变位点精细
定位的分子标记 , 但这一区域的 Y A c 重叠群 已经构建完成 7[] , 为通过染色体步行接近 m od l 位
] 9 9 9
一
0 2
一
2 5 收稿 , 19 9 9 一 0 7一 6 收修改稿
* 国家自然科学基金 (批准号 : 3 9 5 2 5 0 17 , 39 8 70 0 5 3) 和 国家 “ 八六三 ” 高技术发展计划资助项 目
* * 联系人 (E 一 m a i l : J y l i @ ig tP . a e . e n )
中 国 科 学 (C 辑 ) 第 30 卷
点奠定 了基础 . 但由于 Ac Y克隆 DN A插人片段极大 , 平均在 4 20 kb 左右 8[] , 使得克隆和分析
M O D I 基因面临较大困难 . 与 YA C 克隆相 比 , B A C 克隆的 D N A 插人片段相对较小 , 平均约为
10 kb gl]
, 因此这一区域的 B A c 重叠群是最终克隆 M o D I 基因的基础 . 然而在把 YA c 重叠群
转化为 B A c 重叠群 (即用 Y A c 克隆 D N A 插人片段作探针筛选 B A C 文库 )时发现在这一 区域
存在一个较大的 B A c 空 白地带 ’ ) , 没有建成包括 m 口d1 位点在内的完整 B A c 重叠群 .
本文在首先分离出 I G SI 和 m i 4 21 之间的 Y A C 克隆末端 D N A 片段的基础上 , 用这些 D N A
片段作探针筛选 B A C 文库获得阳性 B A C 克隆 , 分离 出阳性 B A C 克隆的末端 . 再分别杂交所
有阳性 B A C 克隆 , 完成了 m nd l 位点所在区域的以 B A C 克隆为基础的精细物理图谱构建 . 同
时在这一 区域发展出了 1 1 个酶切扩增多态性 (e l e a v e d a m p l i if e a t i o n p o l y m o r p h i c s e q u e n c e s ,
C A p S ) [’ 0 ]和 12 个 S T S ( s e q u e n e e 一 t a g g e d Si t e s )序标分子标记 l“ ] . 这些研究结果不仅有助于 m o J了
突变位点的精细定位和最终实现 M口D l 基因的克隆 , 也有助于拟南芥这一 区域测序工作的顺
利完成 .
1 材料与方法
L l 材料
拟南芥生态型 C o l u m b i a ( C o l一 o ) , L a n d s b e r g e er e ta (L e r )和遗传背景为 C o l一 o 经 EM S诱变产
生的突变体 m nd 了均按前述方法种于温室「’ “ ] . 纯合的 m nd l 植株与 L 。 : 生态型杂交再 自交获得
F : 代 , 选 F : 代中表现 m o dl 突变表型的植株作为定位群体进行连锁定位分析 .
`
D N A 克隆 C D s 3 由法国 B l a i s e P a s e a l 大学 P i e a r d 教授惠赠 . o N A 克隆 m i 4 2 1 , 文中所用的
全部 Y A C 与 B A C 克隆及 AT M U B A C 文库膜 (C D 4 一23 )F 均 由美国 O h in 州立大学拟南芥生物
资源 中心提供 .
L Z D N A 提取
植物基因组 D N A 的提取采用 c AT B 方法 [` 3 ] . 质粒 D N A 的提取按常规方法进行 〔` 4] . 酵母
总 D N A 与 B A C 克隆 D N A 的提取按文献 [1 5] 进行 .
L 3 Y A C 克隆末端 D N A 分离
YA C 克隆的左末端 D N A 片段用 质粒拯救法 (P l as m id er s cu e) 分离 , 右末端用 反 向
p C R ( i n v e r s e p C R
,
i p C R )法分离 . 两种方法均按 o i b s o n 等人 [ ’ “ ]的描述略做修改进行 . 质粒拯救
法 : 用 Xh 口 I , Nd o l 或 Xh 口 I 加 aS l 于 10 林L 反应体积中彻底酶切 2 雌 酵母总 D N A , 以重
蒸酚 (p H 5 . 0 )抽提 1次 , 氯仿抽提 2次 . 加人 2 5 林L 10 m o l /L 的醋酸钱 , 2 0 0 林L 10 0% 的乙醇 , 混
匀 , 一 2 0 ℃放置 2 0 m i n . 1 6 9 0 0 x g 离心 5 m i n . 将沉淀重悬于 2 7 0 林L 双蒸水中 , 加入 3 0 林L 10 x
连接缓冲液 , 2 u T 4 D N A 连接酶 , 16 ℃连接过夜 . 加人 6 0 林L 10 % 乙醇 , 混匀 , 一 20 ℃放置 20
m in
.
16 90 0
x g 离心 5 m in , 70 % 乙醇清洗沉淀 , 晾干 . 将沉淀溶于 or 林L 双蒸水中 , 取 3 林L 转
化大肠杆菌感受态细胞 , 然后按常规的方法进行质粒的提取和鉴定「`4] . iP C R 法 : 在用 iH nd ul
于 20 林L 反应体积中完全酶切 0 . 5 此 酵母总 D N A 后加人 80 林L 双蒸水 . 重蒸酚 (P H 8 . 0) 抽提
l 次 , 氯仿抽提 2次 . 加人 2 5 林L 10 m o l /L 醋酸按 , 2 5 0 林L 10 0% 乙醇 , 混匀 , 一 2 0 ℃放置 2 0 m in .
16 90 0
x g 离心 5 m in , 70 % 乙醇漂洗沉淀 , 晾干 . 将沉淀溶于 90 林L 双蒸水中 , 加入 10 林L 10 /
1 ) h t tP
: / l g e n o m e
一w w w
.
s t a n d fo
r d
.
e d u / a r a b id o P s i s / e h r Z上 tm l
第 2期 牟中林等 :拟南芥细胞死亡突变体 m do l突变座位的精细物理图谱构建
连接缓冲液 , 1 u T 4 D N A 连接酶 , 于 16 ℃连接过夜 . 70 ℃加热 巧 m in 失活连接酶 . 加人 10 林L
3 m o l /L 醋酸钠 (p H 5 . 4 ) , 1 10 林L 预冷的异丙醇 , 于 一2 0 ℃放置 3 0 m i n . 16 9 0 0 x g 离心 15 m i n ,
70 % 乙醇漂洗沉淀 , 晾干 . 重溶沉淀于 10 林L 双蒸水中 , 取 5 林L 作 P C :R 5 林L D N A , 2 林L 引
物 C IC 3 ( l 林m o l /L ) , 2 林L 引物 C I C S ( l 林m o l /L ) , 2 林L 10 x p C R 缓冲液 , 2 林L d N T p ( 2 m m o l几 ) ,
1 U aT q D N A 聚合酶 , 加双蒸水至 2 0 林L . p e R 条件 : 9 4 ℃变性 3 m i n , 然后 9 4℃ l m i n , 5 6℃
2 m i n
,
7 2 ℃ 2 m i n , 循环 4 5 次 , 最后 7 2 ℃再延伸 10 m i n . 凉至室温后再加人 l u 几 q D N A 聚
合酶重复 10 个循环 , 将 P C R 产物于 1 . 5% 的琼脂糖凝胶上电泳分离后 , 再克隆到测序载体
B l u e s c r i p t 1 S K (+ )上 . 引物 C IC 3 和 C I C S 的序列分别为 5 ’ 一G e e e G灯 e T e A A o灯AT C o 一 3 `
和 5 ’ 一A A A C T C A A C G A G C T G G A C G C 一 3 ` .
L 4 D N A 测序
凡用于测序的 D N A 片段均按常规方法亚克隆到测序载体 p lB ue cs ir tP n s (K +) _已 ’ 4 ] . 测序
使用 D Y E n a m i e D i r e e t d G T P 测序试剂盒 (A m e r s h a m ) , 按说明进行 . 然后用 3 7 3A D N A 测序系
统完成测序 .
L S 引物设计与 P C R 扩增
根据测序结果设计引物 . P C R 反应按常规条件进行 . 均以拟南芥生态型 C ol 一 0基因组 D N A
为模板 , 根据 P C R 产物的大小适当调节延伸时间及退火温度 .
L 6 B A C 文库的筛选
分别 以 P C R 扩增 出的 Y A C 末端 D N A 片段 C I C g A 3 R , C I C l l C 7 L , C I C Z G SR 及 R FL P 分子
标记克隆 c D s 3 作探针筛选 B A c 文库 19] . 将筛选出的阳性 B A c 克隆 D N A 点于尼龙膜上 , 用 同
一 D N A 探针再次杂交确定阳性克隆的正确性 .
L 7 B A C 克隆末端 D N A 片段的获得及 B A C 重扭群的构建
除 T 6PS E I 外 , 文中所用 B A C 克隆末端序列均从拟南芥数据库 , )中下载 , 经引物设计 , P C R
扩增获得 D N A 片段 . T 6 P S E I 通过 AT IL P c R 方法 〔’ 7 }获得
. 由于 AT IL P c R 获得的 D N A 片段
较小 , 不易转变为分子标记 , 又直接从 T 6PS 克隆亚克隆出大小约 4 . s kb 的末端片段 . 将所有
B A C 克隆 D N A 点于尼龙膜上 , 再用 B A C 末端 D N A 片段进行杂交 , 从而确定这些 B A C 克隆
的重叠关系 .
L S C A P S 分子标记的创制
用上述引物分别对拟南芥生态型 C ol 一 0 和 L 。 : 基因组 D N A 进行 PC R 扩增 . P C R 产物除
T 6PS lE
a 在 C ol 一 0与 L er 之间存在明显大小差异而直接形成一个分子标记外 , 其他引物从 C ol 一。
与 L e : 中扩出的片段大小没有差异 . 这时用限制性内切酶来检测两种生态型 P C R 产物之间的
多态性 . 限制性内切酶酶切体系在 巧 林L 体积中进行 . 每反应管 10 林L D N A , 1 . 5 林L l o x 酶切
缓冲液 , 1 . 5 林L 10 x B s A , 2 林L 双蒸水 , 混匀 , 离心 . 再分别加人各种商品化限制性内切酶 (一
般 .0 3 林L/ 管 ) , 混匀 , 离心 . 于合适温度下酶切 3一 4 h . 酶切完成后 , 加人 2 林L 上样缓冲液 , 于
琼脂糖凝胶上检测 酶切多态性 . 根据 PC R 产物 的大小决定琼脂糖凝胶 的浓度 , 一般在
1
.
5% 一 4%之间 为了便于对比 , 将同一种酶切的两种生态型 P C R 产物上样到相邻的两个泳道 .
l ) h t t P: / w w w t i g r o r g / td b /a t / a t g e n o m e儿 a e _ e n d _ s e a r e h b/ a e _ e n d _ s e a r e h . h t m l
1 40 中 国 科 学( C辑 )第0 3卷
发现多态的并经证实后 即为新的A CP S分子标记 , 未发现多态 的归入 S T S 序标 .
2 结果
.2 1 m o dl 突变位点所在染色体区域的精细物理图谱
图 1 a( )为 m 口d l 位点所在拟南芥第 2 染色体区段的分子图谱 . 初步的遗传分析将 m 口 d1 位
点定位于分子标记 I G sl 和 m i 4 21 之间 . 图 1 (b) 是 已构建的覆盖从 I G SI 到 m i 4 21 染色体区段
的 Y A C 重叠群 , 包括 Y A C 克隆 C xC ZG 一, C I C g A 3 , C I C 6 C S , C IC l l C 7 和 C I C ZG S . 通过质粒拯
救或 i p C R 方法分离出各自的末端 D N A , 并以其中的 C IC g A 3 R , e l e l l C 7 L , C IC ZG SR 及
C D s 3 D N A 片段为探针筛选 AT M u B A C 文库 ,分别获得 2 , 8 , 21 及 20 个 B A C 阳性克隆(图 1(c ) .
为了确定这些 B A C 克隆的重叠关系 , 将所有 B A C 克隆 D N A 点于尼龙膜上 , 再用 P C R 扩增 出
的 B A C 末端 D N A 片段进行杂交 . 根据杂交结果可以得到多数 B A C 克隆的相互重叠关系 , 从
而确立覆盖 m od l 位点所在区域的 B A C 克隆重叠群 (图 1( d) ) .
的出月助二一9铂助口一侧d口山户d一卜国1一叫寸工三、QOóù、的ùé9寸闪一的 已7刀l(a )
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l
— 3 0 一— 3 1 一
( d ) C IC g A 3 R C I C l l C 7 L C I C ZG S R C D s 3
— 18—
图 1 M O D了基因所在染色体区域的精细物理图谱
a( ) 拟南芥第 2 染色体 M o D I 基因所在区域的遗传图谱 . ( b) M口 D l 基因所在染色体区域的 y A C 重叠群 . (c) D N A
探针 e l e g A 3 R , e l e l 一e 7 L , e le Z o 5 R 及 e D s 3 筛选 以M u B A e 文库分别获得 2 , 8 , 2 1 和 2 0 个 B A e 阳性克隆 . R
示 、认 C 克隆的右末端 , L 示左末端 , l 为 T 6 P S , 2 为 T Z I K S , 3 为 T SL 6 , 4 为 T 2 8F 2 , 5 为 T 6 E 16 , 6 为 T 7M 23 , 7 为
T 12 A Z I
,
8 为 T 14 E g , 9 为 T 19 G 4 , 10 为 T 1 9 G 一6 , l 一为 T ZF Z ] , 一2 为 T 3I 2 2 , 13 为 T 7O 14 , 14 为 T 一I H 1 7 , 1 5为 T 15 B 17 ,
16 为 T 150 16 , 1 7 为 T 17 P 2 2 , 1 8 为 T 1 8 A 18 , 19 为 T 2 2 O 18 , 2 0 为 T 2 2 H 2 0 , 2 1为 T 2 7 P 2 2 , 22 为 T 2 8E 8 , 2 3 为 T 2 8G 6 ,
24 为 T 2 8 G 9 , 2 5 为 T Z s G 2 3 , 2 6 为 T 2 9 F 2 3 , 2 7 为 T 3M 2 3 , 2 8 为 T 2 3 I一8 , 2 9 为 T 2 3 N I , 3 0 为 T 12 D 一, 3 1 为 T 19 L 1 9 .
(d ) M O D I 基因所在染色体区域的 B A C 重叠群

1 4 2 中 国 科 学 ( C 辑 ) 第 30 卷
表 I n 对拟南芥 C A P S 分子标记的 P C R 引物序列
分子标记 正向引物 反向引物
C IC g A 3 R C A C T C T T A C A G A C A G A T T AT G T C AT T C C A C A G G G C A T G C G A G
T P S 6
一 1 8 G C A G T G C G C T G T C G T T T T A G A C A A G T G G C A C A I…G T G G G T C
T 6P S
一
1 4 G A A A G G T T G T G A G A A T G G C G G G C A G A A C T C A T A C C T C C A C
T 6P S
一
11 G A I …C C A C A G A T C T C G G A G T C C C C A T T G G C C T C T G C C A T A A C C
T P S 6
一
7 G C T A G A C T A A C G G C A C A A C C G A C C T T C T A G A G G A G C T A G A G G
T 6P S
一
4
.
8 T G A A A G A C A C C T G G G AT A G G C C C A A C T T T C G G G T C G G T T C C
T 6P S E I C G C G T G T T A A T G A T T C T C G G C G A G G A G G I A A G T G A T G C T
T 12 A 1 2 E I C T T C C A G T T G T G T A A C G A A C C C A AI
,
G T G A I
,
C A T T T G T G G G T T C
T 1 SA ] 8 E 2 G A G G A A C A A A G G A G G G T C G A I …G G C C G T T C T AT G C G T G T T G T T A G
T 1 SA 18 E ] G T T C A C T G A G T T G G A T C A A T C G T A G T G C T G A A G C T AT T C A A G A C
m i 4 2 l a T A C T G G A C T G T C G G A A G T C T G C G C A G C T A A T C C C T G G T G T C C
表 Z n 个新的 C A P S 分子标记
分子标记
C I C g A 3 R
T 6 P S
一
18
T 6 P S
一
14
T 6 P S
一
1 1
T 6 P S
一
7
T 6 P S
一
4
.
8
T 6 P S E I
T 12 A Z I E I
T 1 S A 1 8 E Z
遗传座位 “ ) r e R 产物大小 /b p
4 5 3
1 2 1 6
1 4 2 4
1 1 3 8
9 4 7
] 36 6
2 0 9 1 (C ) “ 1 0 0 0 (L )
3 59
4 4 2
酶l b p
Nl
a
nl
B s r l
石` o R I
B印H l
B s tU I
H i n d l
N 0
AP
o
l
刀戒 1 1
A lw l
H i n e l
A v a l
酶切片段大小 ” )儿 p
1 7
.
2 C o l : 4 3 8 : 13
C o l : 5 5 4 : 4 0 7 ; 15 6 ; 9 8
C o l : ] 10 5 ; 3 19
C o l : 1 13 8
L e r : < 4 3 8
] 8
.
0
18
.
2
18
`
2
L e r : 7 10 ; 4 0 7 ; 9 8
L e r : 14 24
L e r : 7 2 5
.
4 1 3
18
.
3 C o l : 6 4 8 : 2 9 9
C o l : 1 3 6 6
L e r : 9 4 7
1 8
.
4
18
.
4
L e r : 2 b an d s
18 5
18
.
6
T 1 S A 1 8 E I
m i4 2 l a
1 8
.
8
19
.
2
4 3 8
1 8 5 3
C o l : 3 5 9 L e r : 2 b a n d s
C o l : 3 2 8 : 1 14 L e r : 4 4 2
C o l : 3 ] 8 ; 12 4 L e r : 4 4 2
C o l : 4 3 8 L e r : 2 b a n d s
c ol 和 L e ; 间存在多态性
a ) 表示在 R l 连锁图上的遗传座位 ; b ) e o l 示拟南芥 e o l u m b i a 生态型 , L e ; 示 L a n d sb e r g 。 re e ta 生态型
.2 3 12 对 S T S 序标引物
为了获得 Y A C 克隆和 B A C 克隆的末端探针或为了将 R F L P 分子标记转变为 C A P S 分子
标记 , 我们根据测序结果或已知序列设计了 30 对引物 . 有 23 对引物能扩增出 P C R 产物 , 其中
n 对的产物产生限制性内切酶酶切多态 , 转变成为 C A P S 分子标记 . 另外 12 对引物的产物在
c ol
一
O 与 L 。 : 之间不存在多态性 . 由于这些引物扩增 的产物均为 Y A c 克隆或 B A C 克隆 (C D s 3
除外 )的末端 , 其在物理图谱上的位置十分清楚 . 既可用其作为探针筛选文库 , 又可以在 C ol 一O
或 L 。 ; 与其他生态型间寻找酶切多态性 , 转变为 C A P S 分子标记 . 因此对克隆拟南芥这一区域
的基因具有重要的参考价值 . 表 3 列出了这 12 对 S T S 序标引物 .
第 2 期 牟中林等 : 拟南芥细胞死亡突变体 m o dl 突变座位的精细物理图谱构建 14 3
表 3 12 个拟南芥 S T S 序标引物序列
分子标记
G I C ZG I R
C I C ZG I L
T 6 E 16 E I
T ] G 94 E 2
T 2 3 N I E I
T 14 E g E Z
T 1 A Z ZI E Z
C I C G S R Za
C IC ZG S R b
T 2 3 N I E Z
C D S 3
T 2 9F 2 3 E I
正向引物 反向引物 P c R 产物大小沁 p
G C G G A T C G A A C A C T T AT T G T G G
G C T A G G A A A A T C A A G A A G AT T A G G
C T T C A I…G T T T G G G T G G A G A T G
C T T G T T T T G A A G C C T C T A T G T C
T C T T T G G A A G G A G戌 r T A A A C C C
G C T T T T C A A G T C A G T G A T A T G
C T G T C A A C T T A A T C T G A C T G C
G T A T A C C A C T T C T T C A I
,
T T T G G
C G G T T C T C C C T G T A C A A I …G T A C
C G A G G G T G T A A T C G A G T G G T G
G T T T C G T C C G A G G T T G T C C G
T C A C C A G C C T T C T G T A A A A A G C
G G T A G A T T T T A G T A C C AT A C A I…G
G C T A G G A A A A T C A A G A A G A I…T A G G
A T G C C T C T A A A C G C C C G G A G
C A A A T C A G C T C T C C A I
,
C C A A A C
C C T C T A G G T T C C T G G A T C C A G C
T AT G A T C A 〕 ,C C A T A G T G G C A G
G A A T A G C A T A T G A G T C C T T C C
G G A G A A A A G T T A C C A A A G T A A G
T A G T A G G T T A T A A G G A G A A G C T
T G C T T T A G C T C T G A G T C C C C G
A G C T T A G G T T G A I
~
l
一
l
一
I G C T T T T C
C C A C T C G A A A I…G G A I,G A C G A A C
7 0 0
2 0 0 0
2 57
3 4 9
5 2 2
4 8 6
3 5 7
9 5 0
5 5 0
5 1 7
1 1 0 0
4 4 9
a) 数据为近似值
3 讨论
拟南芥细胞死亡突变体 m nd l 座位位于第 2 染色体 I G SI 及 m i42 1 两分子标记之间 . 在这
两个分子标记之间还有两个固定的分子标记 ve o l3 和 m i3 10 ` ) . ve 0 13 是 R F L P 分子标记 , 在拟
南芥定位中使用不方便 . m i3 10 是 C A P S 分子标记 , 只能从 C O 一 0 中扩增 出 P C R 产物 , 很难用作
遗传背景为 C ol 一 0 的 m 口d1 突变位点定位 . Ve o l3 及 m i 4 21 在染色体上的遗传座位离 m i42 1很
近 , 因此对于定位 m dn l 位点的意义不大 . 另一 C A P S 分子标记 R N SI 在 m dn l 作图群体中位
于 m 24 6 的上方 . 因此在 GI SI 及 m i 4 21 之间约 5 c M 范围内没有分子标记对 m口 d1 位点进行精
细定位 . 在拟南芥中 , 按 1 。M 平均 10 0 ~ Zo kb 计算 , 这一区域大约为 50 一 1 00 kb . 因此 , 为
了克隆 M口D l 基因有必要构建 B A C 重叠群并发展新的分子标记 .
综合分析拟南芥第 2 染色体 Y A C 克隆物理图谱与 m 口 d1 定位结果 , 表明覆盖 m od l 座位的
Y A C 重叠群由 Y A C 克隆 C IC ZG I , C I C g A 3 , C I C 6 C S , C I C l l C 7 及 C I C ZG S 等组成 . 为了精细定
位 m nd l 座位并最终克隆 M O D I 基因 , 必须构建出这一区域的更为精细的物理图谱 . Y A C 重叠
群的存在使我们可以通过分离 Y A C 末端 D N A 片段获取极其宝贵的 D N A 探针 , 然后用这些探
针从 B A C 文库中筛选 B A C 克隆 . 从本文所构建出的 B A C 重叠群 (图 1( c) )可以看出 , 在 B A C
克隆 T 6 P S和 T 7M 23 所在的部分区域 , 整个 B A C 文库中只存在 1个拷贝 . 以这一 B A C 重叠群
为基础 , 通过 B A c 指纹资料库 “ )进行分析 比较可 以与两边的 B A c 重叠群连通 , 最终形成完整
的以 B A C 克隆为基础的物理图谱 . B A C 重叠群的构建成功使我们有可能在较短的时间内接近
m 口 d1 突变位点 , 最终克隆出 M口D l 基因 . 不仅如此 我们所构建的 B A C 重叠群还填补 了拟南
芥第 2 染色体用于基因组全序列测定的精细物理图谱中这一 区域的空 白 . 实际上有关该 B A C
重叠群的结果 已提供给专门负责拟南芥第 2 染色体测序的测序中心 , 用于这一区域的测序 .
B A C 重叠群的构建为通过染色体步行法克隆 M口D l 基因奠定 了基础 . 但要监测步行的快
慢及与 目标基因的距离 , 还必须依靠分子标记 . 在植物中应用最为广泛的分子标记是 R FL P 分
子标记 L’ ” ] . 早期的遗传图谱主要是由这种分子标记构成的 . 但是 , 在利用 R FL P 分子标记进行
l ) h t tP
: / g e n o m e
一
w w w 名 t a n d fo r d 七 d u / a r a b id o P s i s /w w w / v o l 4 i i /h o m e
.
h t m l
2 ) h t tP
: / /g e n o m e
.
w u s t l七 d u /g s e / a r a b / a r a b id o P s i s . h tm l
14 4中 国 科 学 ( C辑 )第 30卷
遗传连锁分析或突变基因定位时 ,需要从 F Z单株植株或者由 F Z单株产生的 F : 株系中分离 D N A,
并进行限制性 内切酶消化 , 电泳 , 转膜 , 同位素杂交及放射性 自显影等过程 , 显然这种方法十
分消耗人力物力 . 与 R F L P分子标记相 比 , 以 P C R 为基础的分子标记为植物分子生物学研究注
人了新的活力「’ ” 1 . c A P s 分子标记就是其中的一种类型 , 它显示了 P c R 扩增的等位 D N A 片段
上的酶切多态性 . 本文以 C A P S 分子标记 CI C g A 3 R 为例说明了 C A P S 分子标记产生的基本原
理及其应用 . 文中以 y A C 克隆及 B A C 克隆末端 D N A 序列为基础 , 新发展出 n 个位于第 2 染
色体分子标记 I G SI 及 m i 4 21 之间的 C A P S 分子标记 , 既有利于通过染色体步行法克隆 M口D l
基因 , 又填补了这一 区域分子标记极少 的空白 . 同时 12 对 S T S 序标引物更增加 了这一区域
D N A 探针的密度 . 由于这些 S T S 序标在拟南芥物理图谱上的位置十分明确 , 因而在定位克隆
这一区域的其他基因时有着重要 的参考价值 .
参 考 文 献
1 M
e i n k e D W, C
h e r r y J M
,
D e a n C
,
e t a l
.
A r a b id (jP
s i s ht a l i a n a : a m o d e l Pl a n t fo
r g e n o m e a n a l y s i s
.
S e i e n c e
,
19 9 8
,
28 2 :
6 6 2~ 6 8 2
2 M o u Z
,
H e Y, D a i Y,
e t a l
.
D e if e i e n e y i n af t t y a e id s y n t h a s e l e a d s t o P r e m a t u r e e e l l d e a th a n d d r a m a ti e a l t e r a t i o n s in P la n t
m o r Ph o l o g y
.
P l a n t C e l l
,
2 0 0 0
,
12 ( 3 )
: 4 0 5~ 4 17
3 H e a t h M C
.
A P o Pt o s i s
,
P r o g r a m m e d e e l l d e a t h a n d t h e h y P e r s e n s i t i v e r e s P o n s e
.
E u r J Pl a n t P a t h o 1
,
19 9 8
,
1 04 : 1 17 一 1 2 4
4 M i t t l
e r R
,
L a m E
,
I n s i r u d e t e e t i o n o f n D N A fr a g m e n t a t i o n d u r i n g t h e d i fe
r e n t i a t i o n o f t r a e h e a r y e l e m e n t s i n h ig h e r P l a n t s
.
P l a n t P h y s i o l
,
1 99 5
,
10 8 : 4 8 9一 4 9 3
5 eY
u n g E C
,
M
e i n k e D W
.
E m b r y o g e n e s i s i n a n g i o s P e rm s : d e v e l o Pm e n t o f t h e s u s Pe n s o r P l a n t C e l l
,
19 9 3
,
5 : 1 3 7 1一 1 3 8 1
6 P e n n e l l R I
,
L a m b C
.
P r o g r a m m e d e e l l d e a t h i n P l a n t s
.
P l a n t C e l l
,
19 9 7
,
9 : 1 15 7 一 1 16 8
7 Z a e h g o E A
,
W
a n g M L
,
D e w d n e y J
,
e t a l
.
A P h y s i e a l m a P o f c h r o m o s o m e 2 o f A ar b id oP
s i s ht a l i a n a
.
G e n o m e R e s e a r e h
,
19 9 6
,
6 : 19 一 2 5
8 C r e u s o t E F o u i l l o u x E
,
D r o n M
,
e t a l
.
T h e C I C lib r a r y : a l a r g e i n s e r t 、’A C l ib r a r y fo r g e n o m e m a P Pi n g i n A r ab id o P s i s . P l a n t
J
,
19 9 5
,
8 : 7 6 3 一 7 70
9 C h o i S
,
C r e e lm a n R A
,
M
u l l e t J E
,
e t a l
.
C o n s t r u e t i o n a n d e h a r a e t e r i z a t i o n o f a b a e t e r i a l ar t i if e i a l e h r o m o s o m e l i b r a r y o f
A ra b id oP
s i s t h a l i a n a
.
P l a n t M
o l B i o l R e P o r t
,
1 99 5
,
13 : 1 24 一 12 8
10 K o n i e e z n y A
,
A u s u b e l F M
.
A P r o e e d u r e fo r m a P P i n g A r a b id o P s i s m u t a t i o n s u s i n g c o
一
d o m i n a n t e e o t y Pe
一
s P e e i if e P C R
一
b a s e d
m a r k e r s
.
P l a n t J
,
19 9 3
,
4 : 4 0 3 一 4 10
11 I n o u e T
,
Z h o n g H S
,
M iy
a o A
,
e t a l
.
S e q u e n e e
一
t a gg e d s i t e s ( S T S
s
)
a s s t a n d a r d l a n d m a r k e r s i n t h e r i e e g e n o m e
.
T h e o r A P P I
G e n e t
,
19 9 4
,
8 9 : 7 2 8 ~ 7 3 4
12 L I J
,
Z h a o J
,
R o s e A B
,
e t a l
.
A r a b i d o P s i s P h o s P h o r i b o s y l a n t h r a n i l a t e i s o m e r a s e : m o l e c u l a r g e n e t i e a n a ly s i s o f t r iP l i e a t e
t r y P t o P h a n P a t h w a y g e n e s
.
P l a n t C e l l
,
19 9 5
,
7 : 4 4 7 一 4 6 1
13 B a r e z a k A J
,
Z h a o J
,
P r u i t t K D
,
e t a l
.
5
一
F l u o r o i n d o l e r e s i s t a n e e id e n t i if e s t r y P t o P h a n s y n th a s e b e t a s u b u n i t m u t a n t s i n
A r a b id o P s i s
.
G e n e t i e s
,
19 9 5
,
14 0 : 30 3 ~ 3 13
14 S a m b r o o k J
,
F r i t s e h E F
,
M a n i a t i s T M o l e e u l a r C l o n i n g
,
a L a b o r a t o r y M
a n u a l
.
Z n d e d
.
N e w oY
r k : C o ld S P r i n g H a r bo r
L a b o r a t o yr P
r e s s
,
19 8 9
15 A u s u b e l F M
,
B r e n t R
,
K i n g s t o n R E
,
e t a l
.
C u r r e n t P r o t o e o l s i n M
o l e e u l a r B i o l o g y
,
VO I 2
.
U S A : J o h n W i l e y a n d S o n s I n e
,
19 9 7
16 G ib s o n 5 1
,
S o m e r v i l l e C R
.
C h r o m o s o m e w a lk i n g i n A r a b id op
s i s t ha l i a n a u s i n g y e a s t a r t i if e i a l e h r o m o s o m e s
.
I n : K o n e z C
,
C h u a N H
,
S e he l l J
,
e d s
.
M
e t h o d s i n A r a b id o P s i s R e s e a r c h
.
S i n g a P o r e : W 〔〕r ld S e i e n t i if e
,
19 9 2
.
11 9一 14 3
17 L i u Y G
,
W h i t t i e r R F
.
T he r m a l a s y m m e t r i e i n t e r l a e e d P C R : a u t o m a t a b l e a m P l iif e a t i o n a n d s e q u e n e i n g o f i n s e r t e n d
fr a gm e n t s fr o m P l a n d Y A C e l o n e s fo r e h r o m o s o m e w a lk i n g G e n o m i e s
,
19 9 5
,
2 5 : 6 7 4一 6 8 1
1 8 H a r u sh i m a 丫 Y a n o M , S h o m u r a A , e t a l . A h ig h一 de n s i t y r i c e g e n e t i e l i n k a g e m a P w i t h 2 27 5 m a r k e r s u s i n g a s i n g l e F Z
P o P u l a t i o n
,
G e n e t i e s
,
1 99 8
,
14 8 : 4 7 9一 4 9 4
19 B e l l C J
,
E e k e r J R
.
A s s i g n m e n t o f 3 0 m i e r o s a t e l l i t e l o c i t o th e l i n k a g e m a P o f A r a b id o P s i s
.
G e n e t i e s
,
19 9 4
,
19 : 13 7一 14 4