全 文 ：　第 5卷　第 3期 生命科学研究 Vol. 5 No. 3
　 2 0 0 1年 9月 Li fe Science Resea rch Sep. 2001
拟南芥叶片直接分化雌蕊的诱导及其 RAPD分析

刘选明 1 ,朱至清2 ,王玉秀 2 ,李银心 2 ,贾庚祥 2 ,常风启2
( 1.湖南大学 生物技术研究院 , 中国湖南 长沙　 410082; 2.中国科学院 植物研究所 , 中国北京　 100093)
摘　要: 以拟南芥为材料 ,通过培养诱导首次获得了叶片上直接分化雌蕊这一自然界罕见的拟南芥变异体 ,雌
蕊结构典型 . RAPD分析结果表明变异体 DN A分子上发生了突变 .
关键词: 拟南芥 ; 雌蕊分化变异体 ; RAPD
中图分类号: Q31-3　　　　　　　文献标识码 : A　　　　　　　　文章编号: 1007-7847( 2001) 03-0254-02
Inducement and RAPD Analysis of Mutant with Pistils
on Leaf Surface of Arabidopsis thal inia
LIU Xuan-ming
1 , ZHU Zhi-qing
2 , W ANG Yu-xiu
2 , L I Yin-xin
2 ,
JIA Geng-xiang
2
, CHANG Feng-qi
2
( 1. Biotechnological Institute , Hunan University , Changsha 410082 , Hunan, China;
2. I nstitute of Botany , Academia Sinica , Beijing 100093, China )
Abstract: A mutant o f Arabidopsis thalinian, w hich had representativ e pisti ls forming on leaf surface
o f tube-shoot , was induced by cul turing the seedlings on M S medium containing 6-BA, ZT and IAA.
The result of Random Amplifed Polymorphic DN A ( RAPD) analysis indicated that an obvious
va ria tion occur red in DN A level of mutant plants.
Key words: Arabidopsis thalinian; mutant w ith pistil dif ferentiation; RAPD
( Li fe Science Research , 2001, 5( 3): 254～ 255)
　　拟南芥 ( Arabidopsis thalinian )属十字花科芸
薹属植物 ,由于其个体小、容易获得大量的繁殖群
体、生活周期短以及基因组小、单拷贝序列比例高
等一些独特的生物学、遗传学和分子生物学特性 ,
成为当今植物发育学和植物分子遗传学研究的模
式植物 [ 1, 2] . 通过大量的研究已经获得了许多的
突变体 ,在形态方面的突变体大多畸形 ,如叶的形
状、颜色 ,花的颜色、组成等 ,并克隆出了控制相关
器官发育的基因 [3, 4 ] . 但通过诱导从完整植株营
养器官叶片上直接分化雌蕊的变异体及其
Random Amplifed Po lymo rphic DN A ( RAPD)
分析未见报道 . 我们在进行拟南芥组织培养的研
究中 ,发现试管植株叶片上直接分化雌蕊这一自
然界罕见的现象 ,并对这一拟南芥变异株进行了
形态学观察和 DNA分子水平上的检测研究 . 现
将结果初报如下:
1材料与方法
1. 1　供试材料
拟南芥 ( Arabidopsis thalinian)种子 .
1. 2　方法
1. 2. 1　种子萌发与叶片直接分化雌蕊的诱导
将种子经 70%乙醇 30 s, 0. 1% HgCl2溶液 7
min表面消毒 ,无菌水冲洗 3～ 5次后在无菌条件
收稿日期: 2001-04-26; 修回日期: 2001-06-20基金项目:国家自然科学基金重点资助项目 ;湖南省科技厅重点基金资助项目 ( 99NXY1001-03)作者简介:刘选明 ( 1963-) ,男 , 湖南新宁人 ,湖南大学教授 , 博士 , 博士生导师 ,从事生物技术研究 ;朱至清 ( 1939-) ,男 ,中国科学院北京植物研究所研究员 ,博士生导师 .
DOI : 10. 16605 /j . cnki . 1007 -7847. 2001. 03. 012
下接种于无激素的 M S基本培养基上 ,待种子萌
发后 ,将无菌小苗转移接种到添加有 6-BA、 ZT
和 IAA的 MS培养基上 . 培养的条件为: 培养温
度 ( 23± 2)℃ ,光照强度为 2 000 lx,每天光照 10
h.
1. 2. 2　试管苗微量 DNA的提取
取 10株对照试管苗及有雌蕊分化的植株 ,分
别切取其幼嫩叶片 ,在液氮冷冻条件下迅速研磨
成粉末 ,放入 5 mL离心管中 . 加入 1. 5 mL预热
的 2× CT AB缓冲液 ,置于 65℃水浴中保温 1 h.
取出离心管 ,每管加入等体积的饱和 Tris-苯酚 ,
混匀后 12 000 r /min离心 15 min,将上清液移入
另一离心管 ,加入等体积的氯仿 /异戊醇 ( 24∶ 1) ,
混匀后 12 000 r /min离心 15 min. 取上清液加入
两倍体积预冷的无水乙醇 ,静置 30 min后离心 ,
去上清 , DN A沉淀用 70%乙醇、无水乙醇分别洗
涤 1～ 2次 ,吹干后用适量超净水溶解 ,低温保存
备用 [5 ] .
1. 2. 3　 RAPD反应
随机引物来源于赛百胜公司 ( CY A1-20) ,
Taq酶和 dN TP来源于上海 Sangon公司 . 扩增
条件为: 25μL反应体系 ,先于 94℃预变性 5
min,然后进入下列循环: 94℃变性 1 min、 45℃
复性 1 min、 72℃延伸 2 min,循环 35次 ,循环结
束后在 72℃延伸 10 min. 扩增反应在 TC-96AE
型基因扩增仪上进行 . 取 10μL扩增产物进行琼
脂糖凝胶 ( 1. 5% )电泳 ,在紫外灯下观察并记录结
果 [6 ] .
2　结果与讨论
2. 1　叶片直接分化雌蕊与形态观察
实验选用的拟南芥其种子在无激素 M S的培
养基上无菌条件下萌发率为 97. 39% ,萌发时间
为 3～ 7 d,无菌实生苗生长整齐 ,植株形态正常 .
培养 20 d后 ,将部分实生苗转移接种到附加有不
同浓度的 6-BA、 ZT和 IAA组合的培养基上进行
增殖培养 ,培养至 25 d,发现其中 1株实生苗数量
上增殖了 3倍 ,在试管苗的 1个叶片上产生小的
突起 ,约过了 1周后 ,小突起生长并进一步直接分
化形成独立的雌蕊 ,该叶片共形成 3个雌蕊 ,其中
背面近叶缘的叶脉上着生 2个 ,腹面着生 1个 (图
1) . 解剖观察发现 ,该雌蕊由柱头、花柱和子房 3
部分组成 ,与正常花的雌蕊形态一致 (图 2) ,因为
未进行正常的受粉 ,在继续培养 15 d,该雌蕊逐渐
萎缩 ,不结实 . 从完整植株营养器官叶片上直接
分化雌蕊这一自然界罕见的拟南芥变异体在以往
尚未见报道 ,这一研究结果的获得为研究植株花
器官的发育和基因表达调控提供了宝贵的实验材
料 ,并提出了值得进一步深入研究的课题 .
　　　　　图 1　叶片表面有雌蕊分化的变异试管苗　　　　　　　　　　　　图 2　雌蕊结构　　
　　　　　 Fig. 1　 Tube-sh oo ts with pistil diffe rentia tionon leaf surface Fig. 2　 Pistil structure
2. 2　变异植株的 RAPD分析
在使用的 20个引物中 ,有 16个引物有扩增
产物 ,占 80% , 4个引物未有扩增产物 ,占 20% ,
不同引物产生的扩增产物数目不同 ,每个引物扩
增条带数从 1～ 9条不等 ,平均为 5. 2条 ,产物片
段大小分布在 200 bp～ 1 200 bp之间 . 从中挑选
稳定性好的引物 CYA-10对 10株对照植株及变
异植株的试管苗进行了 RAPD (下转第 274页 )
255　第 3期　　　　　　　　　　刘选明等:拟南芥叶片直接分化雌蕊的诱导及其 RAPD分析　　　　　　　　　　　
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(上接第 255页 )
分析比较 . 其中对照组在 10个试管植株中都未
发 现条带的差异 ,而变异植株与对照相比在引物
CYA-10扩增中明显增加了 1个条带 ,其分子量
大小约为 1 950 bp(图 3) ,表明变异植株在遗传
物质上发生的突变 .
图 3　引物 CYA-10的 RAPD扩增图谱
A: 变异株 ; CK:对照 ; M:分子标样 .
Fig. 3　 Pro file of RAPD products amplified with
primer CYA-10
A: Va rie ty; CK: Contract; M: Marker.
致谢: 本研究得到了中科院植物研究所梁演初研
究员的帮助 ,特此致谢!
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