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第 39卷第 5期 湖南农业大学学报(自然科学版) Vol.39 No.5
2013 年 10 月 Journal of Hunan Agricultural University (Natural Sciences) Oct．2013
DOI:10.3724/SP.J.1238.2013.00489
拟南芥含 MATH结构域基因 AtSb3的表达分析
佘媛 a，赵莺婕 b，郭磊 a，刘春林 a*
(湖南农业大学 a.农学院；b.生物科学技术学院，湖南 长沙 410128)

摘 要：利用 RT–PCR的方法检测了 AtSb3在拟南芥的表达情况；在构建 AtSb3基因启动子与 GUS融合表达载
体并获得拟南芥转化子的基础上，用组织化学染色方法对 AtSb3基因在拟南芥中的表达进行了研究。RT–PCR的
结果表明：只在拟南芥根中检测到 AtSb3的表达，在茎、叶、花和果荚中均检测不到 AtSb3的表达。GUS组织化
学染色结果显示：在刚萌动的种子中，AtSb3 主要在胚根部位表达，其他部位不表达；在种子萌发后的子叶展开
期，AtSb3在根尖部位表达，其他部位不表达；在 4~5叶期幼苗中，AtSb3在地上部分没有表达，只在主根和各级
侧根的根尖部位表达；在根尖部位，AtSb3基因在根冠与分生区细胞结合部位，以及伸长区和根毛区的表达量高，
而在分生区与伸长区之间存在一段不表达的区域。
关 键 词：拟南芥；AtSb3基因；反转录聚合酶链反应(RT–PCR)；组织化学染色；组织定位
中图分类号：Q786 文献标志码：A 文章编号：1007–1032(2013)05–0489–06

Analysis of the expression of AtSb3 gene containing MATH domains
in Arabidopsis thaliana
SHE Yuana, ZHAO Ying-jieb, GUO Leia, LIU Chun-lina*
(a.College of Agronomy; b.College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128,
China)

Abstract: RT–PCR were used to investigate the expression of Atsb3 in Arabidopsis thaliana, and the vector with AtSb3
gene promoter and GUS fusion expression cassette was constructed to obtain the transgenic lines of Arabidopsis thaliana,
based on which the tissue localization of AtSb3 gene expression was investigated by histochemical staining. The results of
RT–PCR showed AtSb3 gene was expressed only in root, not in the stem, leaf, flower and silique. The results of GUS
staining showed that in seeds at early germinating stage，AtSb3 gene was only expressed in radicle. In cotyledon
expansion period after seed germination, AtSb3 gene expression was only detected in root tip, not in other parts of the
plant. In 4 to 5 leaf stage seedling，AtSb3 was not expressed in aboveground parts but in taproots and lateral roots. In the
root tip, GUS staining was heavier in conjunction region of the root cap and meristematic zone, as well as in elongation
zone and root hair, which indicated expression level of AtSb3 gene was higher in these parts; GUS staining in the region
between meristematic zone and elongation zone was not observed.
Key words: Arabidopsis thaliana; AtSb3 gene; reverse transcription polymerase chain reaction(RT–PCR); histochemical
staining; tissue localization


收稿日期：2013–04–12
基金项目：国家自然科学基金项目(31071455)
作者简介：佘媛(1987—)，女，湖南衡阳人，硕士研究生，主要从事作物基因工程与细胞工程研究，syuanyuan1212@126.com; *通信作
者，liucl100@126.com
安眠蛋白(Merprin)与肿瘤坏死因子受体相关
因子(TRAF)C端同源结构域(Merprin and TRAF–C
homology domain，简称MATH结构域)由7~8个反向
平行的β–折叠组成，它能介导蛋白质之间的相互作


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用[1–2]，参与植物与真菌的共生作用[3]。
拟南芥中含有71个MATH 结构域蛋白[3]，其根
部1个含MATH/TRAF结构域蛋白参与细胞质膜对
真菌的应答反应，并且与苜蓿属植物的成瘤作用和
蛋白质降解过程密切相关[4]。
本课题组已经从拟南芥基因组中筛选到1个编
码含有2个连续MATH结构域的基因，命名为AtSb3。
该基因与在油菜中克隆的6个含有MATH结构域的
基因中的一个具有很高的同源性[8]。为了揭示AtSb3
基因的功能，笔者采用RT–PCR和GUS组织化学定
位的方法对AtSb3基因的时空表达模式进行研究，获
得该基因在拟南芥中的组织特异性表达，旨在为进
一步研究AtSb3基因的功能及油菜中同源的含
MATH结构域基因的功能提供依据。
1 材料和方法
1.1 材 料
拟南芥(Arabidopsis thaliana) 采用 Col–0(哥伦
比亚野生型)，由湖南农业大学植物代谢调控实验室
提供。种植后的拟南芥 4 ℃春化 3 d后，置于 22 ℃
的长光照(光照 16 h，黑暗 8 h) 培养室中生长。GUS
染色材料用75%乙醇消毒后铺于1/2MS培养基[9]上，
培养皿呈竖直摆放，拟南芥种子萌发后在培养基上
垂直生长。
1.2 方 法
1.2.1 AtSb3 基因表达的检测
用 Trizol试剂盒(购自 Invitrogen 公司)分别提
取生长状况良好的拟南芥的根、茎、叶、花、果荚
的 RNA；经过 Fermentas公司的 RevertAidTM First
Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒反转录成
cDNA，反转录的产物用拟南芥的内参基因 Actin2
检测质量及调节目标基因起始模板量。
Actin2 检测引物为 Actin2–F(5′–ATGGCTGAG
GCTGATGATATTCAAC–3′)和 Actin2–R(5′–TCTC
AGCACCAATCGTGATGACTTG–3′)，预期的扩增
目标片段的长度为 766 bp。AtSb3基因的 RT– PCR
检测引物为 AtSb3–F(5′–CACATGCACTTCCAATC
TTCCTATA–3′)，AtSb3–R(5′–AACGGAGACTATG
TTTGTCACAGAG–3′)，预期的扩增目标片段的长
度为 287 bp。
1.2.2 AtSb3 基因启动子的克隆
根据TAIR网站(http://www.arabidopsis.org/)上公
布的AtSb3基因序列，取ATG上游到上1个基因UTR
序列的最后1个碱基之间的1 690 bp片段作为启动子
区，采用Primer Premier5软件设计启动子扩增引物对
AT54pro101–F/AT54prolol–R，并在正向引物的5′端
加HindⅢ酶切位点，在反向引物的5′端加上BamHI
酶切位点。
AT54pro101–F的序列为5′–CCCAAGCTTGGG
AGGTTTGGTATCTTACATAAAAAAA–3′(下划线
示HindⅢ酶切位点)；AT54pro101–R的序列为5′–CG
GGATCCCGATTTTGAGATCTTTTTTGTTTTGT–3′
(下划线示BamHⅠ酶切位点)。
参照CTAB法[10]提取拟南芥基因组DNA。以此
为模板，用Takara公司的高保真酶扩增AtSb3基因的
启动子，回收目的片段，并克隆到pMD19–T载体(购
自大连宝生物TAKARA公司)中，转化大肠杆菌
DH5α(购自湖南农业大学植物代谢调控实验室保
存)，提取质粒，酶切验证后送长沙博尚生物技术有
限公司测序。
1.2.3 AtSb3 基因启动子与 GUS 融合载体的构建
用HindIII和BamHI双酶切分别酶切测序正确的
重组 pMD19–T质粒和 pBI101载体(购自大连宝生物
TAKARA公司)，电泳后分别回收目标片段，将回收
的 1 690 bp左右的启动子片段与经双酶切的 pBI101
载体片段，用 Fermentas 公司 T4连接酶连接，构建
pAtSb3pro101::GUS 质粒，并转化大肠杆菌 DH5α，
PCR验证阳性单菌落，提取质粒进行双酶切验证，并
保存菌液。从重组大肠杆菌DH5α分离目标融合质粒
pAtSb3pro101::GUS，利用冻融法将融合质粒转化到
农杆菌 GV3101(湖南农业大学植物代谢调控实验室
保存)中。
用 PCR 检测农杆菌转化子的融合质粒，融合质
粒的检测引物为：pAtSb3–F(5′–CCCAAGCTTGGG
AGGTTTGGTATCTTACATAAAAAAA–3′)；pAtSb3–R
(5′–CCGCATAATTACGAATATCTGCATC–3′)。


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1.2.4 浸花法转化拟南芥
参照 Floral dip 浸花法[11]转化拟南芥。将带有
重组质粒 pAtSb3pro101::GUS的农杆菌 GV3101接
种至 YEB 液体培养基(1 g/L Yeast Extract、5 g/L
Tryptone、5 g/L Beef Extract、0.493 g/L MgSO4·7H2O、
1 mmol/L KOH调节 pH至 7.0)，在 28 ℃的条件下
活化并扩大，5 000 r/min室温离心后加入 10 mmol/L
MgSO4 悬浮细菌。如此操作 2 次之后加入 200
mmol/L AS(乙酰丁香酮)，室温放置 2 h。将处理好
的菌液加入到 100 mL渗透培养基(0.5 g Sucrose、
0.22 g MS 0221、50 μL Silwet–77，1 mol/L KOH调
节 pH至 5.7)中，混合均匀，将生长大约 40 d左右
的带花序的拟南芥浸泡到渗透培养基中 1~2 min，
然后盖上塑料膜，并移入 22 ℃的生长室中避光培
养，24 h后揭开塑料膜，按正常的光照培养(同 1.1)。
1.2.5 转化植株的筛选鉴定
待转化的植株成熟后，收集种子(T0代)。将 T0
代种子用 75%的乙醇消毒 10~15 min，用灭菌的蒸
馏水清洗种子 2~3遍后，铺于含有 30 mg/L Kan的
1/2MS培养基[9]筛选。4 ℃春化 3 d后，移入 22 ℃
的生长室中生长。筛选生长 10 d左右，将得到的抗
性苗移栽到蛭石中生长，刚移入的抗性苗用塑料杯
罩 1周左右保湿。抗性苗在蛭石上生长 2周左右，
采用引物 pAtSb3–F和 pAtSb3–R进行检测，呈阳性
的为 T1代转基因苗，成熟后收集 T1代种子。同样
铺于含有 Kan的 1/2MS筛选培养基[9]上进行筛选，
通过连续的自交和 PCR检测，直到筛选出纯合的转
化子，用于下一步试验。
1.2.6 GUS 组织化学定位
参照 Jefferson[12-13] GUS 染色方法进行组织化
学定位。取吸水萌发 24 h的转基因拟南芥种子及在
1/2MS培养基[9]上生长 7 d和 15 d的转基因幼苗分
别进行染色，同时取生长时期相同的野生型拟南芥
作为对照。染色步骤为：加入 90%的丙酮固定，抽
真空 15~20 min，冰上放置 1 h，吸去丙酮，加入
GUS染色液(0.04% X–Gluc，50 mmol/L磷酸钠缓冲
液(pH 7.0)，2 mmol/L K4Fe(CN)6· 3H2O，2 mmol/L
K3Fe(CN)6，5 mmol/L EDTA，0.1%TritonX–100)，
37 ℃染色 3 h左右，70%乙醇脱色，直至植株的绿
色全部褪去为止。在 Nikon SMZ1000体式显微镜下
观察 GUS表达情况并拍照。
2 结果与分析
2.1 AtSb3基因的表达
通过 RT–PCR分析发现， AtSb3基因的转录产
物只在根中检测到，而在茎、叶、花以及果荚中检
测不到该基因的转录产物(图 1)，说明该基因只在根
中特异性表达。

A中1~5分别为拟南芥根、茎、叶、花、果荚中AtSb3
基因转录产物的检测结果；B中1~5分别为拟南芥根、茎、
叶、花、果荚中Actin2内参基因转录产物的检测结果。
图1 AtSb3基因的PCR扩增结果
Fig.1 Results for PCR amplification of AtSb3
2.2 AtSb3基因启动子的克隆
通过梯度 PCR 确定扩增引物 AtSb3pro101–F/
AtSb3pro101–R 的最佳退火温度为 56 ℃。PCR 扩
增得到了约 1 700 bp的产物(图 2)。将产物连接到
pMD19–T载体测序，测序结果与 NCBI网站(http://
www.ncbi.nlm.nih.gov/index.html)公布的结果进行
比对，同源性高达 100%，表明 AtSb3 基因启动子
序列已经完整克隆到 pMD19–T 载体，可以用于下
一步试验。

1 克隆的目的片段；M 100 bp Plus Marker。
图2 AtSb3启动子区的PCR扩增结果
Fig.2 PCR amplification of AtSb3 promoter
2.3 重组质粒菌落 PCR及双酶切验证
用 HindIII和 BamHI双酶切含 AtSb3基因启动
子序列的 pMD19–T 和 pBI101 载体，经 T4连接酶
1 M
5 000 bp
3 000 bp
2 000 bp
1 500 bp
1 2 3 4 5
A
B


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连接形成的重组融合质粒 pAtSb3pro101::GUS，通
过热激法转化大肠杆菌 DH5α。随机挑取单菌落进
行 PCR 检测融合质粒，以获得阳性克隆，PCR 结
果见图 3。

1 空白对照；2 阳性对照；3 阳性克隆的PCR结果；4~8 阴性
克隆的PCR结果；M 100 bp Plus Marker。
图3 菌落PCR检测结果
Fig.3 Results of PCR test of colonies
扩大培养经 PCR检测为阳性的克隆，并提取质
粒，用 HindIII和 BamHI进行双酶切验证，结果酶
切得到 1条约 1 700 bp左右的条带(图 4)，与预期的
1 690 bp的目的条带相符，说明 AtSb3基因的启动
子全长 GUS融合表达载体构建成功。
2.4 pAtSb3pro101::GUS转基因植株的 PCR 检测
通过浸花法获得的 T0代种子在 30 mg/L Kan抗

1 未酶切的重组载体；2 HindIII和BamHI双酶切重
组载体；M 100 bp Plus Marker。
图4 重组质粒pAtSb3pro101::GUS的酶切验证
Fig.4 Identification of recombinant plasmid pAtSb3pro101::
GUS by restriction enzyme digestion
性筛选培养基上筛选得到抗性苗。抗性苗经过 PCR
检测，共获得转基因苗 2株(图 5)。继续进行 Kan抗
性筛选与 PCR 检测，筛选得到纯合的 T3 代含
pAtSb3pro101::GUS表达框的转基因材料。纯合材料
用于 GUS组织化学染色检测。

1 空白对照；2 阴性对照；3 阳性对照；4~13、15、17 未能转入pAtSb3pro101::GUS的抗性苗的检测结果；14、16 转入了
pAtSb3pro101::GUS的抗性苗的PCR结果；M 100 bp Plus Marker。
图5 抗性苗的PCR检测结果
Fig.5 The PCR test result of Kan-resistant plants
2.5 GUS组织化学染色
为了研究 AtSb3 基因的表达模式，通过 GUS
组织化学染色发现，在转基因种子刚萌动时期，染
色部位主要在胚根，并且集中在胚根的最顶端部分
(图 6–1，彩版见封三)，在其他部位，如胚芽和胚轴
中则没有，表明在种子萌动时期 AtSb3基因主要在
胚根的最顶端部分表达。
在萌发后 2片子叶展开期的幼苗期，染色部位
也主要在根部的根尖(图 7–1，彩版见封三)，而在其
他部位，如茎和子叶中则没有，说明在子叶期 AtSb3

箭头所指为GUS染色部位，下同；1 萌发24 h的转基因种子；2 萌发24 h的野生型种子。
图6 萌动期种子中AtSb3的表达定位
Fig.6 GUS histochemical localization of Atsb3 gene expression in geminating seeds
1 2 M
5 000 bp
3 000 bp
2 000 bp
1 500 bp
1 2 3 4 5 6 7 8 M
2 000 bp
1 500 bp
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 M
2 000 bp
1 500 bp
1 000 bp
1 2


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基因主要在根尖中表达。在转基因拟南芥 4~5叶期
的幼苗中，染色部位主要在主根和各级侧根的根尖
部位(图 8–1，彩版见封三)，而在茎和幼叶中都没有
染上色，说明 AtSb3 基因在地上部位没有表达，
AtSb3基因启动子驱动GUS基因只在拟南芥根部特
异表达。生长 7 d的幼苗的根尖局部放大图(图 9–1，
彩版见封三)显示，在成熟根的根冠和根尖分生区结
合部及伸长区细胞的染色非常深，说明 AtSb3基因
表达量高；从根部的伸长区细胞到成熟区细胞的颜
色变浅，说明 AtSb3基因表达量低；在分生区与伸
长区细胞之间的结合部没有颜色，则说明 AtSb3基
因在这段区域不表达。此外， AtSb3基因在根毛中
也有表达(图 9–2，彩版见封三)。


1 生长7 d的转基因幼苗；2 生长7 d的野生型幼苗。
图7 子叶展开期幼苗中AtSb3的表达定位
Fig.7 GUS histochemical localization of Atsb3 gene expression in seedlings at cotyledon expansion stage


1 生长15 d的转基因幼苗；2 生长15 d的野生型幼苗。
图8 4~5叶期幼苗中AtSb3的表达定位
Fig.8 GUS histochemical localization of Atsb3 gene expression in seedlings at 4 to 5 leaf-stage


1~2 局部放大的转基因幼苗的根尖。
图9 根尖部位AtSb3的表达定位
Fig.9 GUS histochemical localization of AtSb3 gene expression in root tip
3 结论与讨论
动物中含 MATH 结构域的基因的研究开展得
较早，此类基因在哺乳动物的生长发育、衰老及免
疫功能等方面起着重要的作用[2,11–14]。关于植物中
含MATH结构域基因的研究还不多，在对模式植物
拟南芥[3–4]以及油菜[8]等部分经济作物上开展的相
1 2
1 2
1 2


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关MATH结构域基因的功能的研究表明，含MATH
结构域的基因在抗逆性、生长发育、品质形成等诸
多方面可能发挥重要作用。
笔者通过进行氨基酸序列比对发现，AtSb3 基
因来源于拟南芥中 MATH 结构域基因家族，属于
含双 MATH 结构域的基因，其具体功能未知。本
研究利用 RT–PCR 和 GUS 组织化学染色方法证实
AtSb3 基因只在拟南芥的根中表达，在其他组织中
不表达；AtSb3 基因在拟南芥成熟根的根冠与分生
区细胞的结合部位、伸长区细胞以及根毛中都有较
高的表达，说明该基因表达有组织倾向性，似乎在
根部细胞生长替换活跃的部位表达明显。
本研究通过 RT–PCR分析发现拟南芥 AtSb3基
因为根特异性表达基因。进一步的组织化学染色分
析发现，拟南芥 AtSb3基因只在拟南芥的根尖部分
表达，预示着该基因可能在拟南芥的抗性或者根的
生长发育等方面起着一定的调控作用，今后可以侧
重这方面的研究。
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责任编辑：罗 维
英文编辑：罗 维