全 文 ：遗　传 HEREDITAS(Beijing)25(5):620～ 622 , 2003 专论与综述
收稿日期:2002-09-02;修回日期:2002-12-02
作者简介:唐荣华(1965-), 男 , 广西人 ,副研究员 , 在职博士生。 E-mail:t ronghua@hotmail.com
通讯作者:吴为人 , 男 ,博士 , 教授 ,博士生导师。 E-mail:zjwei ren@pub5.f z.fj.cn
拟南芥 SUPERMAN 基因表观突变的研究进展
唐荣华1 , 2 ,张君诚2 ,庄伟建2 ,吴为人2
(1.广西农业科学院经济作物研究所 ,广西 南宁 530007;2.福建农林大学作物科学学院 ,福建福州 350002)
摘　要:本文综述了拟南芥 SUPERMAN 基因表观突变体 clark kent(clk)的表型、基因型 、DNA 甲基化及表观突变机
制等方面的研究进展。主要研究结果有:clk 是 SUPERMAN(SUP)的等位基因, 能遗传但不稳定 , 其对称位点(CpG
和CPXPG)和非对称位点的胞嘧啶高度甲基化, 伴随着 SUP 转录水平的下降;CpG 和 CPXPG 胞嘧啶甲基转移酶分别
是 METHYLTRANSFERASE1(MET1)和受 KRYPTONITE 基因调控的 CHROMOMETHYLASE3 (CMT3)。
关键词:拟南芥;SUPERMAN;甲基化;表观突变
中图分类号:Q344　　　文献标识码:A　　　 文章编号:0253-9772(2003)05-0620-03
Progress of the SUPERMAN Epigenetic Mutation in Arabidopsis
TANG Rong-Hua1 ,2 ,ZHANG Jun-Cheng2 ,ZHUANG Wei-Jian2 ,WU Wei-Ren2
(1.Insti tute of Cash Crops , Guangxi Academy of Agricu ltural Science , Nanning , Guangxi , 530007 , China;
2.Col lege of Crop Science , F ujia n Agricu lture &Forest ry U niversity , Fuzhou , Fuj ian , 350002 , China)
Abstract:The SUPERMAN gene in Arabidopsis has its epigenetic mutants(the clark kent alleles , clk).The pheno type
of clk and its geno type and methyla ted patterns and the epi-mutation mechanisms of SUPERMAN were summarized in
the review.Heritable but unstable sup epi-alleles are associated with nearly identical patterns of excess cytosine methyla-
tion within the SUP gene and a decreased level of SUP RNA.The methyla tion of cy tosine at CpG and CPXPG is con-
trolled by ME THYLTRANSFERASE1 (ME T1)and CHROMOMETHYLAS E3 (CMT3) w hich is regulated by
KRYPTONITE gene , respectively.
Key words:Arabidopsis;SUPERMAN;methy lation;epigenetic mutation
　　超人基因(SUPERMAN , S UP)是模式植物拟南芥
(Arabidopsis thaliana)花器官发育的调控基因之一。它能抑
制花器官发育基因 B 功能基因(APETALA3 和 PIS TILLA-
TA)在雌蕊中的表达 , 是拟南芥第三轮花器(雄蕊)和第四轮
花器(雌蕊)的定域基因 ,主要在第三轮花器分生组织内侧表
达[ 1 , 2 , 3] 。它合成 C2H2型具锌指结构的蛋白质 ,是一种转录
调节因子[ 4] 。
DNA 分子胞嘧啶甲基化在基因表达或沉默 、细胞记忆
及外源 DNA 的限制等方面起着重要的作用[ 5] 。 DNA 甲基
化一般发生在对称位点 CpG ,并由研究得较透彻的甲基转移
酶 DNMT1 控制 , 其中包括拟南芥中的 ME T1 。 ME T1 突
变会引起基因组 DNA 总体甲基化水平的下降 , 引起拟南芥
生长发育障碍[ 6 ～ 10] 。
基因突变体研究在揭示基因表达和调控机制上具有重
要作用。在拟南芥中发现了 7 个不同突变株系——— clark
kent 1 ～ 7(clk1 ～ 7)[ 11] , 花的表型与超人基因突变体相似 ,
但没有那么严重 , 称为表观突变(Epigenetic Mutation)。本文
综述了这些突变体的表型 、等位基因鉴定 、S UPERMAN 基
因表观突变分子机制等方面研究进展。
1　拟南芥表观突变株系花的表型特点
拟南芥花共有四轮花器 , 从外到内分别为花萼 、花瓣 、雄
蕊 、雌蕊。野生型花含有 4 个花萼 、4 个花瓣 、6 个雄蕊和由
2 个心皮合生的雌蕊。 SUP 基因 DNA 片段大部分缺失突
变体 sup-5 在最初 10 朵花上雄蕊和心皮数都增加 , 雄蕊为
12.3±0.3(平均数±标准误), 心皮数为 2.9±0.1;clk-3 雄
蕊数为7 .8 ±0 .3 ,心皮数为3 .4 ±0 .1 ;clk-1 雄蕊数为 6.4±
0.1 ,雌蕊为 3.2 ±0.1。由于这些突变体与野生型相比 , 表
型变异只发生在第三 、四轮花器上 ,根据 SUPERMAN 基因
的功能特点 ,可以初步推定拟南芥的这些表观突变与 SU-
PERMAN 基因有关[ 11 , 12] 。
2　拟南芥表观突变等位基因的鉴定
在互补测验中 ,用 clk-3 纯合体与 sup-5 纯合体杂交 , F 1
植株花与 sup-5 一样 , 证明 clk 不能与 sup 互补 , 但在 F2 代
中出现 1%～ 3%的野生型植株。这些数据好象说明 CLK
与SUP 是连锁的两个不同基因 , 但进一步分析则可证明 clk
为SUP 的等位基因[ 11] 。
限制性内切酶的酶切片段多态性表明 clk 和 sup 是紧密
连锁的。用 EcoRI酶切 SUP 基因产生的 5.5kb DNA 片段作
探针 , 检测到一个 clk 基因组 HindIII限制性片段多态性标记
与 clk-3 完全共分离。另外通过顺反测验 ,证明 clk-3 与 sup-5
是在同一条染色体上 ,即使是两个不同的等位基因 ,相隔也非
常近。转基因试验表明 , SUP 基因的编码区和其上游 5kb序
列共 6.7kb 导入到 clk-3 中则可与 clk-3 互补 ,但 SUP 基因近
轴端 25kb 和远轴端 40kb都不能与 clk-3 互补。另外 ,通过原
位杂交证明, 在 clk-3 纯合体中 , SUP 的 RNA 表达量在某些
花中减少 ,而在另一些中则不能检出[ 11] 。
上述研究结果从不同侧面证明 clk-3 与 SUP 是等位基
因。为了证明 clk 是可遗传的突变 , 构建了 clk-3 gll-1 双突
变体 ,其中 gll-1 距离SUP 10cM ,是表皮无毛突变体。通过
分析双突变体自交后代的表现 ,在 586 株后代中 , 有 17 株的
花与野生型相同或相似 , 但表皮仍然无毛。 在这 17 株中有
3 株与野生型有完全一样的花 , 其自交后代中野生型与 clk
植株出现 3∶1 的分离比例 , 并在随后世代中分离出纯合的
clk 单株和野生型单株。原位杂交结果表明 , 其中一株 SUP
RNA 的表达已经恢复到野生型水平。说明 clk 是可遗传的
突变 ,但也能回复突变 , 重新变成野生型[ 11] 。
DNA测序表明 , clk 和SUP 具有完全相同的碱基顺序。
对来自 clk-1 , -2 , -3 , -5 的SUP 基因编码区和 clk-1 , clk-3 的
SUP 基因整个 6.7kb 进行测序 , 发现它们与野生型没有任
何核苷酸序列差异。说明 clk 是 SUP 的表观突变株系 , 因
而可以推测 clk 是由于遗传因素作用于 SUP 基因所产生的
突变 ,非环境因素造成。
3　SUPERMAN 表观突变基因的甲基化特点
双亚硫酸盐基因组测序法检测结果表明 , SUP 与 clk 系
列基因在甲基化碱基位置和数量上存在差异。在 SUP 基因
和一个无义突变(sup-1)基因中 ,未检测到甲基化胞嘧啶;但
在 clk 系列基因的转录起始点到大部分转录区都检测到大
量甲基化胞嘧啶。在 clk-3 检出了 211 个甲基胞嘧啶 , 比突
变程度较弱的 clk-1 多 6 个甲基胞嘧啶。而在一个 clk-3 回
复突变株中 , 上述 211个甲基胞嘧啶除 14 个外都去甲基化 ,
并伴随着 SUP RNA 表达水平的恢复[ 12] 。 clk-3 在胞嘧啶
甲基化上没有表现出序列特异性 , 在对称位点(CPG 和
CPXPG)和非对称位点上都有胞嘧啶甲基化。而且 , 在不同
clk 等位基因中 , 它们的甲基化模式几乎一样。 如 clk-1 和
clk-3 有 204个相同位点的甲基胞嘧啶 , clk-3 另有 7 个位点
甲基化 , clk-1 另有 1 个位点甲基化。 clk-2 , clk-6 与 clk-1 和
clk-5 在甲基化密度最高的正义链上具有很相似的高度甲基
化模式。这种甲基化模式在不同突变体之间的重复出现说
明这些序列被甲基化的机制非常独特。 另外 , SUP 基因中
的这些甲基化序列好象是单拷贝的。这说明 S UP 的高度甲
基化与大多数重复序列和主要在对称位点发生甲基化的机
制是不一样的。
一些反义胞嘧啶甲基化酶(antisense cy tosine methay l-
transferase , AMT)株系与 sup 突变体表型相似。用与 sup 植
株具有相同花结构的 AM T 株系与 clk-3 或 sup-5 杂交 ,其 F1
植株具有 sup 花型 , 而与野生型植株杂交 F1 具有野生型花
型。说明该 AMT 株系含一个有缺陷的 SUP 等位基因 , 其
SUP 基因也是高度甲基化的 , 与 clk 株系相同。在其中检测
出 186 个甲基化胞嘧啶 ,只有 3 个位点与 clk-3 不一样。 因
此 ,尽管 AMT 整个基因组的甲基化水平下降了 90%, SUP
基因仍然是高度甲基化的。如果在 clk 植株或者 met1 植株
中导入 AMT , 则发现大多数 CPG 去甲基化 ,其他类型甲基
化仍然保持 , 说明非 CPG 甲基化对保持 SUP 基因沉默起决
定性作用[ 12] 。
4　SUPERMAN 表观突变的分子机制
为了鉴定甲基化位点对保持 S UP 基因甲基化和基因沉
默的重要性 , Anders M.Lindro th 等进行了 clk 等位基因抑
制子的突变筛选实验[ 12] 。他们通过在 clk-3 植株中导入一
个额外的S UP 位点获得了一个不会回复突变的株系 , 称为
clk-st。然后用化学诱变剂对 clk-st 的种子进行人工诱变 , 并
对 M 2 株系进行筛选 , 以获得抑制 clk 表达而产生野生型花
型的突变体。共获得了 16 个隐性突变体 , 并用其中 5 个进
行预备研究。在这 5 株中 , 有 4 株完全使 clk 植株开出了野
生型花 ,另一株显示部分恢复。这 5 个突变体之间不能互
补 , 说明它们是同一基因丧失功能后产生的等位基因。
这些突变体之一已被定位到 1 号染色体 , 靠近 CHRO-
MOME THYLASE3(CMT3)基因。 CMT3 是一种未曾证实
的胞嘧啶甲基转移酶。用所获得的一个强抑制子植株与
cmt3-2 杂交 , cmt3-2 是早已获得的 CMT3 的一个无义突变
体 ,但它们之间不能互补 , 说明所有五个抑制子突变体均是
CMT3 的等位基因。因而把它们称为 cmt3-3(部分抑制
子), cmt3-4 , cmt3-5 , cmt3-6 , 和 cmt3-7 [ 12] 。
以 clk-st ,具有 clk-st 背景的 cm t3-7 和一个具有 clk 表型
的 met1 为材料 , 对它们的 S UP 基因 , 一个近着丝粒的
621　3 期　　　　　　　　　　　　　唐荣华等:拟南芥 SUPERMAN 基因表观突变的研究进展
Athila 反转座子长末端重复序列(long terminal repeat , LTR)
和着丝粒处 180 个碱基对重复序列进行了甲基化检测。
cmt3-7 突变体在所检测的序列中将近失去了全部 CpXpG 甲
基化 ,但仍然保持大部分 CpG 甲基化。相反 , met1 的 CpG 甲
基化显著减少 , 但对 CpXpG 甲基化几乎没有影响。 cmt3-7
在非对称位点上的胞嘧啶甲基化表现出不同的影响 , 在某些
区域没有减少 ,在某些区域几乎全部去甲基化 ,但总体趋势
比 clk-st和 met1 减少了。
CM T3 能控制拟南芥中一些内源反转座子的沉默。
cmt3 跟 met1 一样可激活反转座子 Athila 的转录活性 ,
Athila 在野生型中则由于过度甲基化而保持沉默。另一个
像复印机一样的反转座子元件 Ta3 ,只有 cmt3-7 能激活它
的转座活性 ,而在野生型和 ddm1 突变体中均保持沉默 , 在
clk-st 中也没观察到它的转录产物。 但 cmt3 对反转座子
Evelknievel 或 Tar17 的激活没有影响[ 13 ～ 15] 。
CpG 双核苷酸胞嘧啶甲基化和去甲基化在哺乳动物基
因表达中有重要的调控作用[ 16] 。真核生物染色体 DNA 甲
基化是基因表达调控的一种方式。 DNA 甲基化作用可引起
染色质结构 、DNA 构型 、DNA 稳定性以及 DNA 与蛋白质因
子相互作用方式的改变 ,从而控制基因的表达。当 DNA 处
于高水平甲基化状态时 ,基因表达受到抑制;当 DNA处干低
水平甲基化状态时 , 基因得以表达[ 17] 。甲基化在植物基因
沉默和调控中具有重要作用 , 但上述研究结果表明 , 不同类
型基因的沉默机制有区别。 有些基因的沉默主要依靠
CpXpG 的胞嘧啶甲基化 , 如 SUP 基因和Ta3 转座子 ,另一些
基因主要依靠 CpG 的胞嘧啶甲基化 ,如反转座子 Tar17 , 而
像反转座子 Athila 等基因则需要 CpXpG 和 CpG的胞嘧啶共
同甲基化才能保持沉默。
Jackson JP等在筛选抑制 SUPERMAN 基因的突变体
实验中 ,鉴定出专一作用于异染色质组蛋白 H3 的 9 号赖氨
酸的甲基转移酶(KRYPTONITE), 其突变体与 cmt3 相似 ,
引起 CpX pG的胞嘧啶去甲基化 , 并能激活内源反转座子 , 说
明 KRYP TONITE 基因通过调控 CMT3 酶与甲基化的染色
质互作来控制 CpXpG的胞嘧啶甲基化[ 18] 。
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