全 文 ：第4 2卷第 3期 上海师范大学学报(自然科学版) Vol ． 42，No． 3
2 0 1 3 年 6 月 Journal of Shanghai Normal University(Natural Sciences) Jun ． ，2 0 1 3
拟南芥 ACOS5 基因表达模式分析
孙虎林，褚艳霞，郑 帮，郑亚洁，司英语，周树敏，张 卫*
(上海大学 上海市能源作物育种及应用重点实验室 上海 200444)
摘 要:探讨了拟南芥 ACOS5 基因的表达模式．采用 PCＲ方法对拟南芥 col 生态型基因组进
行扩增，获得 ACOS5 基因启动子序列，将其连入 p1300 植物表达载体中以 GFP作为报告基因，
并将该载体通过农杆菌转基因转入拟南芥 col 生态型中，观察转基因植物花药中 GFP 的表达
情况．结果: ACOS5: : GFP转基因植物从花药发育第四期到十二期均有 GFP 表达，GFP 的表达
峰值在第八期．结论:该表达载体可用，且 ACOS5 基因从花药发育第四期开始有微弱表达，且
随着时期发展逐渐增强，至第八期达到表达最高峰值，随后随时期发展表达量逐渐减弱．
关键词:拟南芥; 花药; GFP; ACOS5
中图分类号:Q 754 文献标识码:A 文章编号:1000-5137(2013)03-0314-06
收稿日期:2013-03-25
基金项目:上海市教育为浦江人才计划(09PJ1405500) ;国家自然科学基金面上项目(30870225)
作者简介:孙虎林(1986 －) ，男，上海大学生命科学学院硕士研究生;张 卫(1966 －) ，男，博士，上海大学生命科学
学院教授．
0 引 言
拟南芥是一种十字花科植物，由于其基因组较小、生长周期短、容易种植等特点深受众多研究学者
喜爱，是当今生物学研究的热门模式，为多数实验室和研究机构的研究对象．花是植物中最后重要的器
官之一，而花药在植物花发育中占有重要地位［1］．研究表明，拟南芥的花药及小孢子发育在时空上受到
精确调控，使花药从分生组织逐步分化、成熟并最终释放花粉［1 － 2］． ACOS5 是拟南芥花药中特异表达的
一种基因，该基因编码一种脂酰辅酶 A合成酶，该酶能够在有辅酶 A存在的情况下消耗 ATP将肉桂酸、
油酸等合成肉桂酰辅酶 A和油酰辅酶 A［3］．其主要参与拟南芥花药绒毡层的形成及发育，若该基因无
意突变会直接导致拟南芥雄性不育［2 － 3］．如果在模式植物拟南芥中能够探明 ACOS5 的基因表达模式，
将有助于在水稻、小麦等其他粮食和经济作物中应用．
1 材 料
1． 1 植物材料
拟南芥 Columbia生态型，于人工光照温室培养，培养条件为温度 22℃，16 h 光照，8 h 黑暗［4］．定期
进行浇水和营养液浇灌．营养液由上海永通化工有限公司生产．
2 方 法
2． 1 基因组抽提
基因组抽提采用康为世纪植物复杂基因组抽提试剂盒进行抽提．
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2． 2 ACOS5 启动子克隆
自 www． arabidopsis． org下载 ACOS5 启动子序列，长度选取转录起始点至上游 3Kbp．根据启动子序
列设计引物，上下游引物两端分别加入 HidIII 和 Sac1 酶切位点．引物合成由上海生工生物工程公司进
行合成．
引物序列为:上游(HindIII) CCCAAAGCTTGTAGAGGCTGAGAAATTGTA
下游(SacI) CGGAGCTCGATTTATGTGTTAGGAACAGGG
采用 PCＲ方法对目的序列进行扩增，扩增采用 takara公司生产的 KOD PCＲ扩增试剂盒． PCＲ扩增
参数为:
变性:
退火:
延伸:
94 ℃ 2 min
94 ℃ 30 s
52 ℃ 30 s
68 ℃ 1． 5 min
72 ℃ 10 min
10 ℃ 10 min
33 tims
将所扩增的目的片段用 taq酶进行加 A，加 A后进行胶回收操作．胶回收采用 takara 公司生产的胶
回收试剂盒．
2． 3 基因测序
将所回收得到的目的片段连入 pMD18 － T 载体进行测序，该产品由 TAKAＲA 公司生产．测序公司
为上海美吉生物医药科技有限公司．
连接体系(10 μL)如下:
目的片段: 1． 5 μL
T载体: 0． 5 μL
Solution I: 5 μL
ddH2O: 3 μL
Solution I内含 T4 DNA连接酶，为试剂盒内配套试剂．
2． 4 GFP基因克隆
实验室自有 GFP － T质粒．通过设计引物进行 PCＲ，PCＲ产物回收加 A后连入 T载体进行测序．
引物序列为:上游(BamHI) :CGCGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGA
下游(SalI) :GCGTCGACTTACTTGTACAGCTCGTCC
PCＲ扩增参数为
变性:
退火:
延伸:
94 ℃ 2 min
94 ℃ 30 s
50 ℃ 30 s
68 ℃ 1． 5 min
72 ℃ 10 min
10 ℃ 10 min
33 tims
连接体系(10μL)如下:
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上海师范大学学报(自然科学版) 2013 年
目的片段: 1． 5 μL
T载体: 0． 5 μL
Solution I: 5 μL
ddH2O: 3 μL
挑选阳性克隆后送上海美吉生物公司进行测序．
2． 5 表达载体构建
以下为实验室自有 p1300 载体图谱．
图 1 p1300 载体多克隆位点示意图
首先，将 P1300 载体以 HindIII、SacI进行酶切并回收载体片段．然后，将测序正确的 ACOS5 启动子
以 HindIII、SacI自 T载体上酶切，并回收连入 P1300 载体中，并进行阳性克隆筛选和鉴定．将鉴定的载
体以 BamHI、SalI进行酶切，并回收载体片段备用．将测序正确的 GFP基因以 BamHI、SalI进行酶切并回
收，随后连入上述 BamHI、Sal I处理的载体中并进行阳性克隆筛选和鉴定．
GFP连接体系(10 μL)如下:
GFP片段: 1． 5 μL
p1300 载体: 0． 5 μL
Solution I: 5 μL
ddH2O: 3 μL
ACOS5 连接体系(10μL)如下:
ACOS5 片段: 1． 5 μL
p1300 载体: 0． 5 μL
Solution I: 5 μL
ddH2O: 3 μL
将两个目的片段分别连入 p1300 载体后挑选阳性克隆并抽提质粒进行酶切鉴定，剩余质粒备用．
2． 6 转化入农杆菌
将构建好的载体热激转化入农杆菌 GV3101 中．转化方法详见参考文献［5 － 7］．随后进行农杆菌阳性
克隆筛选及鉴定．
2． 7 转基因
将已转入载体的农杆菌阳性克隆进行划板、挑选单克隆、小型摇培(5 mL)、中型摇培(200 mL)后进
行转基因操作．转基因具体步骤详见参考文献［5 － 8］．
2． 8 阳性苗筛选
转基因植物转化后 3 个月收集种子，对种子进行干燥．于 50 μg /mL 的潮霉素抗性平板上进行阳性
苗筛选．并将所筛选到的阳性苗移出至人工光照培养箱进行培养．
2． 9 荧光观察
以蔡司 LSM710 共聚焦显微镜对筛选阳性苗进行荧光鉴定及表型观察，并采用蔡司 2． 0 图形分析
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软件对拍摄图片进行荧光定量分析，统计不同时期花药内 GFP的表达情况．
3 结 果
3． 1 启动子克隆
将 ACOS5 启动子、GFP基因测序结果在 NCBI网站与原始序列进行比对，测序结果与原始序列完全
匹配，无错配、缺失等．
3． 2 载体构建
对构建好的 p1300 阳性克隆进行质粒抽提和酶切鉴定． 分别采用 HindIII、SacI 对 ACOS5 启动子，
BamHI、Sal I 对 GFP 进行酶切鉴定，分别切出 3Kbp 条带和 750 bp 条带及剩余载体带． 鉴定结果如
图 2，3所示:
图 2 ACOS5 启动子酶切鉴定 图 3 GFP酶切鉴定
3． 3 转基因植物鉴定
对筛选到的阳性苗基因组进行 PCＲ 鉴定，PCＲ 扩增条带包括 GFP 及 ACOS5 部分片段，长度约为
450bp，抗性平板共筛选到 15 株阳性苗，经过 PCＲ鉴定结果如下:
鉴定引物为:
F:CTATTTATATTCACTCTAGAG
Ｒ:GTACTCCAGCTTGTGCCCCA
图 4 转基因植物 PCＲ鉴定
3． 4 荧光观察
选取 4 号、6 号转基因植株进行传代，在 T3 代通过抗性平板筛选分析，得到转基因纯合子．通过共
聚焦显微镜对 T3 代转基因植物进行观察如图四所示．同时对各个时期的荧光强度进行定量．结果显示，
转基因植物花药从四期开始微弱表达 GFP，并在八期时表达最高，随后逐渐减弱，至十二期时最弱．
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图 5 共聚焦显微镜分时期观察结果
图 6 分时期荧光定量结果
4 讨 论
花粉和花药的发育一直是现代植物学研究的热点，其过程复杂，涉及多个基因的表达及调控．随着
分子生物学的不断发展，植物学的研究也不仅仅局限于分类、组织器官的显微观察、解剖观察等方法，而
是越来越多地运用现代分子生物学手段对某些基因进行转基因及表达模式分析，这些手段可以直接得
到有力的生物学证据，并极大地推动植物花药发育的相关研究．以本研究为例，本报告系统可以直观地
对 ACOS5 的表达模式进行分析，如对不同时期花药中 ACOS5 的表达观察与分析，并进行量化分析．通过
对 ACOS5 的表达模式进行分析，可以发现该基因在花药发育第八期表达最强烈．据此推测，该基因发挥
主要作用的时期为第七到第八期，相关资料显示［1 － 2］，该基因突变会导致雄性不育，那么，可能其主要影
响花药发育第七到第八期时的花药结构，使绒毡层完整结构不能建立［2 － 3］，进而导致雄性不育．目前国
内外著名学者多数以原位杂交来研究基因的表达模式［3］，原位杂交具有一些如实验周期长、不能活体
观察、经费开支大等缺点，而以 GFP作为报告基因在操作上更方便，时间上更短，经费上更经济，适合在
拟南芥花药研究中进行应用．
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第 3 期 孙虎林，褚艳霞，郑 帮，等:拟南芥 ACOS5 基因表达模式分析
参考文献:
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Expression pattern analysis of Arabidopsis anther-specific gene ACOS5
SUN Hulin，CHU Yanxia，ZHENG Bang，ZHENG Yajie，SI Yingyu，ZHOU Shumin，ZHANG Wei*
(Energy Crop Breeding and Application Key Laboratory of Shanghai，Shanghai University，Shanghai 200444，China)
Abstract:To investigate ACOS5 gene expression patterns in Arabidopsis，PCＲ was used to amplify the genome of Arabidopsis col
ecological，to get ACOS5 gene promoter sequence to be connected to the p1300 plant expression vector with GFP as a reporter
gene，and the vector transgenic transferred by Agrobacterium intends ecotypes of Arabidopsis col observe GFP expression in trans-
genic plants anther． Ｒesults:In ACOS5:GFP transgenic plants from anther development fourth stage to the twelve were GFP ex-
pression． GFP expression peak is in the Eighth stage． Conclusion:The expression vector can be used，and ACOS5 gene from anther
development fourth stage with weak expression，and gradually increased with the stage of development，to the Eighth achieve ex-
pression of the highest peak，then at any stage of development was gradually weakened．
Key words:Arabidopsis thaliana;anther;GFP;ACOS5
( 责任编辑:顾浩然)
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