全 文 ：华北农学报 · 2010, 25(6):30-33
收稿日期:2010-10-07
基金项目:国家转基因重大专项重大课题(2009ZX08004-005)
作者简介:孙佃臣(1986-),男 ,山东邹城人 ,硕士 ,主要从事大豆转基因研究。
通讯作者:周新安(1963-),男 ,湖北人 ,研究员 ,主要从事大豆遗传育种研究。
拟南芥 pre-miR399b植物表达载体的构建
孙佃臣 1, 2 ,沙爱华 1 ,单志慧1 ,陈李淼1 ,周新安 1
(1.中国农业科学院油料作物研究所 ,农业部油料作物生物学重点开放实验室 ,湖北 武汉　430062;
2.中国农业科学院研究生学院 ,北京　 100081)
　　摘要:根据拟南芥 miR399b茎环序列设计引物 , PCR扩增克隆了拟南芥 pre-miR399b(precursormiRNA)基因。采
用 LIC(Ligation-Independentcloning)法将 pre-miR399b连接到双元植物表达载体 pJG045上 , 构建成植物表达载体 pS-
DC2,并用冻融法将其导入根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105中。 研究结果为将 pre-miR399b基因转化
大豆再生植株 , 鉴定 miR399b基因在大豆磷吸收利用中的功能及培育磷高效大豆新品种奠定了基础 。
关键词:拟南芥;pre-miR399b;载体构建
中图分类号:Q78　　文献标识码:A　　文章编号:1000-7091(2010)06-0030-04
ConstructionofAPlantExpressionVectorTargeting
theArabidopsisthalianapre-miR399bGene
SUNDian-chen1, 2 , SHAAi-hua1 , SHANZhi-hui1 , CHENLi-miao1 , ZHOUXin-an1
(1.InstituteofOilCropsResearch, ChineseAcademyofAgricultureSciences, Wuhan　430062, China;
2.GraduateSchoolofChineseAcademyofAgricultureSciences, Beijing　100081, China)
Abstract:miR399 couldregulatePihomeostasis, consistsofsixmembers(miR399a-f)inArabidopsisthaliana.
Hereweclonedpre-miR399bfragmentwithprimersdesignedaccordingtothestem-loopsequence.Thefragementwas
insertedintothemultiplecloningsitesofthebinaryvectorpJG045withLigation-Independentcloning.Thevectorwas
transformedintotheAgrobacteriumtumefaciensstrainEHA105.Itmayprovideanexcelentfoundationforfunctional
verificationofmiR399binsoybeanandcultivatinghighPi-eficiencysoybeanbydeliveringpre-miR399bgeneintosoy-
bean.
Keywords:Arabidopsisthaliana;pre-miR399b;Vectorconstruction
　　磷是植物三大营养元素之一 ,对植物的生长发
育具有重要的作用。土壤有效磷缺乏是一个世界性
问题 ,已成为许多地区作物生长的限制性因素 [ 1] 。
在长期的进化过程中 ,植物自身也发展了一套适应
性变化 ,如改变根系形态结构以增加与土壤的接触
面积 ,根系分泌有机酸和酸性磷酸酶分解根际难溶
性磷来增加对磷的吸收 ,提高植物体内磷的循环利
用等[ 2, 3] 。这些适应性变化与低磷胁迫下某些特定
基因的表达和调控密切相关。
MicroRNA最早由 Lee等 [ 4]于 1993年在研究线
虫(C.elegans)的 lin-4 基因(一种控制发育时间的
基因)时发现 ,它是一类长 21 ～ 25 nt的内源非编码
RNA,可以与目标 mRNA结合使之断裂或降解 ,从
而在转录后水平发挥作用。 miR399 长 22 nt,在拟
南芥中有 6个成员 , 分别是 miR399a-f[ 5] 。 Chiou发
现 ,在低磷胁迫下 ,拟南芥中 miR399 大量表达;而
在高磷条件下 ,未检测到 miR399 的表达。 miR399
过表达的转基因植株叶片中磷浓度为野生型植株的
5 ～ 6倍 [ 6] ,茎中磷浓度比野生型高 2倍多[ 7] 。进一
步试验证明 , miR399可与编码泛素结合酶的 mRNA
(UBCmRNA)的 5′UTR结合 ,导致该 mRNA降解 ,
当 miR399大量表达时 , UBCmRNA的含量减少 ,反
之 , UBCmRNA的含量增加 。当 UBCmRNA的含量
减少后 ,泛素结合酶的表达受到限制 ,导致了磷酸转
移基因 AtPT1的大量表达 ,从而促进了磷的大量吸
收。 UBC的下调表达对主根的延长 、磷高亲和力转
6期 孙佃臣等:拟南芥 pre-miR399b植物表达载体的构建 31　
运子的表达(如 AtPT1)具有重要的作用 ,这些对保
持植物体内磷的稳定十分重要 [ 8] 。
成熟的 miRNA序列在植物中比较保守 ,本研究
从拟南芥中克隆了编码 miRNA399b前体 pre-
miR399b的基因片段 , 采用 LIC[ 9] (Ligation-Inde-
pendentcloning)方法构建了植物表达载 pSDC2,并
将其导入根癌农杆菌 ,拟进一步转化大豆植株 ,希望
为大豆耐低磷胁迫的遗传改良 ,培育磷高效大豆新
品种提供基因资源和基础 。
1　材料和方法
1.1　材料
扩增 pre-miR399b材料为拟南芥哥伦比亚生态
型(A.thalianaecotypeColumbia)。 Marker、大肠杆
菌(Escherichiacoli)DH5α购自北京全式金生物科技
公司;农杆 菌 (Agrobacterium tumefaciens)菌株
EHA105为本实验室保存;试验中所用的各种限制
性内切酶 、Taq酶 、T4DNA聚合酶均购自 Fermentas
公司;胶回收试剂盒 、质粒提取试剂盒均购自天根公
司;乙醇 、氯仿 、异戊醇 、异丙醇 、甘油 、琼脂 、CTAB
等均购自上海生工生物工程有限公司;引物由上海
英骏生物技术有限公司合成;DNA测序工作由北京
六合华大基因科技股份有限公司完成 。
1.2　方法
1.2.1　拟南芥基因组 DNA的提取　取哥伦比亚生
态型拟南芥叶片 2 g,参照 Doyle[ 10]修改后的 CTAB
法提取拟南芥叶片总 DNA。
1.2.2 　PCR扩增　根据 miR399b(htp://www.
mirbase.org/ )茎环的序列设计引物:5′-AGATGTC-
CAGCATTATGAAGAGAC-3′和 5′-CAACACAGTCT-
GTTCTATTCGGTCG-3′。
从拟南芥基因组扩增 pre-miR399b片段 ,反应体
系为 50 μL,内含:2 μL10 ×PCRBufer, 1.2 μL25
mmol/LMgCl2 , 0.2μmol/LdNTPs, 0.5μmol/LPrimer,
1UTaqEnzyme, 2 μLDNA。反应条件:94℃ 4 min,
(94℃ 30s, 53℃ 30s, 72℃ 1min)×35, 72℃ 5min。
1.2.3　植物表达载体的构建与酶切鉴定　参照
Dong等[ 11]的 LIC法 ,将纯化后的 PCR产物连入载
体 pJG045,步骤如下:
取 50ng纯化后的 PCR产物置于含 T4 DNA聚
合酶 、1 ×Bufer、5 mmol/LdATP和 DTT的体系中
22℃ 30min, 70℃ 20min(使 T4DNA聚合酶失活)。
同时用 PstⅠ酶切 pJG045,然后给以同样的反应体
系和反应条件 ,只是 dATP换成了 dTTP。将处理好
的 50 ngPCR产物和 pJG045载体混合 ,置于 65℃ 2
min, 22℃ 10 min。
取 5 μL混合物转化大肠杆菌 DH5α感受态细
胞 ,重组子经 PCR鉴定 , EcoRⅠ和 PstⅠ双酶切鉴定
后 ,送华大基因公司测序。 pre-miR399b重组子命名
为 pSDC2。
图 1　植物表达载体 pJG045的骨架图
Fig.1　PlasmidmapofpJG045
1.2.4　转化农杆菌 　将构建好的植物表达载体
pSDC2 采用冻融法 [ 12] 转入根 癌农杆菌菌株
EHA105,在含 Rif50 mg/L、Kam50 mg/L的 LB平
板上筛选阳性克隆 ,菌落 PCR检测验证 。
2　结果与分析
2.1　MiR399基因克隆与序列分析
以拟南芥基因组总 DNA为模板 ,扩增出 1个
429bp的特异性片段(图 2),将该序列与 htp://
www.mirbase.org/中的 miR399b序列进行 DANMAN
序列比较分析 , 结果显示:核苷酸一致性达到
100%,表明克隆到了 pre-miR399b(图 3)。
2.2　植物表达载体的构建与验证
本研究采用 LIC法直接将 pre-miR399b克隆到
pJG045载体的多克隆位点中 ,最终产生了 pSDC2。
菌落 PCR及 EcoRⅠ和 PstⅠ双酶切质粒 pSDC2验
证 ,电泳检测表明 ,重组质粒中插入了大小 429 bp
的片段(图 4, 5)。
M.Trans2KPlusDNAMarker;1.PCR扩增 pre-miR399b。
M.Trans2KPlusDNAMarker;1.Productofpre-miR399bbyPCR.
图 2　PCR扩增结果
Fig.2　TheresultofPCR
2.3　植物表达载体转化农杆菌
质粒采用冻融法转化农杆菌菌株 EHA105 ,在
含 Rif50mg/L、Kam50mg/L的 LB平板上筛选阳
32　 华　北　农　学　报 25卷
性克隆 , 随机挑取 1个单菌落为模板 , 采用 pre-
miR399b特异引物进行 PCR。电泳结果表明 ,重组
质粒 pSDC2已成功导入农杆菌细胞(图 6)。
CAACACAGTCTGTTCTATTCGGTCGAATTAATTATTGTCAAAAGAATACAAATCATATGTTAAAAGGAGACGAAGAGGAAGA
GTGTACGTACCTTTGATCTCTTCTCTCTTTCATGTGTTTAATTAAGCTGAACCAGTTTCAGGGCAACTCTCCTTTGGCAGGTCA
TTTATAAATCGATCATCGGAAATTTTCGATATTCATATATGTATGTGTATATTTGGAAGTAAAGGACCTGCCAATGGAGAGGCG
CCCTAAAACTAGTGAGTTTACATGTTTCTCTTCATCTCTATAAGATCCATATGAAGGCTTGTGTCTGTATTTATATATACATGCGT
GTGTGGACATATACATATTTAAAGATAGATAAAGAATTTTGGACAAGGAATATTAGGTTTTTCCATGATGTCTCTTCATAATGCT
GGACATCT
图 3　Pre-miR399b序列及相关引物(下划线)的位置
Fig.3　Positionsofpre-miR399bsequenceandprimers(underlined)
M.Trans2KPlusDNAMarker;1.重组子;2.水对照。
M.Trans2KPlusDNAMarker;1.PCRdetectionofrecombination;2.CK.
图 4　转化大肠杆菌 DH5αPCR检测
Fig.4　PCRdetectionoftransformed
EscherichiacoliDH5αcolony
M.Trans2KPlusDNAMarker;1.重组质粒经 EcoRⅠ和PstⅠ双酶切。
M.Trans2KPlusDNAMarker;
1.PlasmidpSDC2digestedbyEcoRⅠ andPstⅠ .
图 5　重组质粒的酶切鉴定
Fig.5　Cleavageanalysisofrecombination
M.Trans2KPlusDNAMarker;1.水对照;2.质粒转化 EHA105;
3.重组质粒。
M.Trans2KPlusDNAMarker;1.CK;2.TransformedEHA105;
3.Recombinationplasmid.
图 6　转化农杆菌 PCR检测
Fig.6　PCRdetectionoftransformedAgrobacteriumcolony
3　讨论
LIC[ 9]是 Navogen公司专门为其部分的 pET载
体而发明的一种克隆方法 。用 LIC法制备的载体有
不互补的 12 ～ 15碱基单链粘端 ,与目的插入片段上
相应粘端互补 。扩增目的插入片段的引物 5′序列
要与 LIC载体互补。 T4 DNA聚合酶的 3′※5′外切
活性经短时间即可在插入片段上形成单链粘端。由
于只能由制备好的插入片段和载体互相退火形成产
物 ,且省略了酶切连接等繁琐的试验步骤 ,这种方法
非常快速高效 ,而且为定向克隆。
肥料的吸收效率已经成为大豆产量提高的重要
限制因子之一 。培育各种矿物元素高吸收效率的品
种一直是大豆育种中的一个重要课题。而植物基因
工程的发展则为作物高效育种提供了一条崭新的途
径。 miRNA作为一种调控型的小 RNA,在植物生命
过程中发挥重要的作用 。研究者目前发现 ,拟南芥
中 miR399可提高磷的吸收效率 。 miR399其表达量
的增加将会抑制植物体内 UBC基因的表达 , UBC的
下调表达对主根的延长 、磷高亲和力转运子的表达
(如 AtPT1)具有重要的作用 ,因此对保持植物体内
磷的稳定十分重要 [ 8] 。Lin等 [ 13]研究发现 ,转化了
拟南芥 miR399的烟草茎中磷大量增加 ,表现为磷
中毒 。Pan等 [ 14]研究表明 ,低磷胁迫同时诱导油菜
和西葫芦韧皮液中 miR399表达 ,可见 miR399对磷
的高效吸收确实发挥着重要的作用 。
4　结论
本试验以拟南芥叶片为材料 ,成功地克隆了 pre-
miR399b基因 ,采用 LIC[ 14]法 ,构建了含 pre-miR399b
片段的植物表达载体 pSDC2,并将其导入到根癌农杆
菌 EHA105中 ,希望通过转基因技术 ,改善大豆耐低
磷胁迫的能力 ,培育出磷高效大豆新品种。
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