全 文 ：第３２卷第２期
２０１４年４月
上 海 交 通 大 学 学 报 （农 业 科 学 版）
ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＳＨＡＮＧＨＡＩ　ＪＩＡＯＴＯＮＧ　ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ（ＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＡＬ　ＳＣＩＥＮＣＥ）
Ｖｏｌ．３２Ｎｏ．２
　Ａｐｒ．２０１４
文章编号：１６７１－９９６４（２０１４）０２－００５５－０７　 ＤＯＩ：１０．３９６９／Ｊ．ＩＳＳＮ．１６７１－９９６４．２０１４．０２．０１１
收稿日期：２０１３－０６－１８
基金项目：上海市科委项目（０９３９１１９００）
作者简介：褚云霞（１９７５－），女，在职博士生，副研究员，研究方向：花卉分子生物学及新品种ＤＵＳ检测，Ｅ－ｍａｉｌ：ｃｈｕｙｘ＠１８９．ｃｎ；
吴爱忠（１９５６－）为本文通讯作者，男，博士，教授，博士生导师，研究方向：作物遗传育种、植物生物技术，Ｅ－ｍａｉｌ：ｗｕａｉｚｈｏｎｇ＠
ｓａａｓ．ｓｈ．ｃｎ
超高效液相色谱法测定矮牵牛中花青苷含量
褚云霞１，２，饶钦雄２，陈海荣２，吴爱忠１，２
（１．上海交通大学 农业与生物学院，上海　２００２４０；
２．上海市农业科学院 农产品质量标准与检测技术研究所，上海　２０１４０３）
摘　要：在参考 ＨＰＬＣ条件的基础上，探讨了不同溶剂、洗脱条件、检测波长等对花青苷ＵＰＬＣ定
量检测的影响，并对试验方法进行选择，确定植物花青苷快速检测方法。研究表明矮牵牛中花青苷
经０．１ｍｏｌ／Ｌ盐酸甲醇提取，加入等体积１０％甲酸水经０．４５μｍ滤膜过滤后即可进行 ＵＰＬＣ测
定。通过洗脱条件的优化可在８ｍｉｎ内实现３种花青苷的分离，此方法矢车菊素－３－葡萄糖苷和天
竺葵素－３－葡萄糖苷在０．６２５～２５ｍｇ／Ｌ的范围内具有良好的线性关系，相关性好（ｒ＞０．９９９），相对
标准偏差为１．９８４％～３．８５０％，样品加标回收率为６２．１％～１００．３％，最低检出限可达０．２ｍｇ／Ｌ；
飞燕草素在２．５～５０ｍｇ／Ｌ范围内具有良好的线性关系，相关系数为０．９９８，最低检出限为０．９
ｍｇ／Ｌ。矮牵牛红色品系‘９７０２’中（鲜重）的花青苷含量可达５３０．５２７ｍｇ／ｋｇ。
关键词：矢车菊素－３－葡萄糖苷；天竺葵素－３－葡萄糖苷；飞燕草素；超高效液相
中图分类号：Ｓ６８１．６　　　　文献标识码：Ａ
Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎｓ　ｉｎ　Ｐｅｔｕｎｉａ　ｂｙ　ＵＰＬＣ
ＣＨＵ　Ｙｕｎ－ｘｉａ１，２，ＲＡＯ　Ｑｉｎ－ｘｉｏｎｇ２，ＣＨＥＮ　Ｈａｉ－ｒｏｎｇ２，ＷＵ　Ａｉ－ｚｈｏｎｇ　１，２
（１．Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ｊｉａｏｔｏｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　２００２４０，Ｃｈｉｎａ；
２．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｆｏｒ　Ａｇｒｉ－Ｆｏｏｄ　Ｓｔａｎｄａｒｄｓ　ａｎｄ　Ｔｅｓｔｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ
Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　２０１４０３，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｂｙ　ＵＰＬＣ　ｗａｓ　ｓｔｕｄｉｅｄ．Ｔｈｅ　ｓｏｌｖｅｎｔ，ｅｌｕｔｉｏｎ　ｐｒｏｇｒａｍ　ａｎｄ
ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ　ｗｅｒｅ　ｓｃｒｅｅｎｅｄ　ｔｏ　ｂｕｉｌｄ　ａ　ｆａｓｔ　ａｎｄ　ｅａｓｙ　ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ　ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｐｅｔｕｎｉａ．Ａｓ
ａ　ｒｅｓｕｌｔ，ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ　ｆｒｏｍ　ｐｅｔａｌｓ　ｗｅｒｅ　ｐｕｌｖｅｒｉｚｅｄ　ａｎｄ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ａｔ　ｒｏｏｍ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｗｉｔｈ　ａ　ｍｉｘｔｕｒｅ
ｃｏｍｐｏｓｅｄ　ｏｆ　ｍｅｔｈａｎｏｌ：ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｃ　ａｃｉｄ（１　０００：８．６），ｔｈｅｎ　ｂｅｉｎｇ　ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ａ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｗａｔｅｒ：ｆｏｒｍｉｃ
ａｃｉｄ（９０：１０），ａｎｄ　ｆｉｎａｌｙ　ｍｅａｓｕｒｅｄ　ｂｙ　ＵＰＬＣ．Ｂｏｔｈ　ｐｅｌａｒｇｏｎｉｄｉｎ　３－Ｏ－ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ　ａｎｄ　ｃｙａｎｉｄｉｎ　３－Ｏ－ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ
ｓｈｏｗｅｄ　ａ　ｇｏｏｄ　ｌｉｎｅａｒｉｔｙ（ｒ＞０．９９９ ）ｂｅｔｗｅｅｎ　ｐｅａｋ　ａｒｅａ　ａｎｄ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ｗｉｔｈ　ｌｉｍｉｔｓ　ｏｆ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ
（ＬＯＱ）ｒａｎｇｉｎｇ　ｆｒｏｍ　０．６２５ｔｏ　２５ｍｇ／Ｌ，１．９８４％－３．８５０％ｏｆ　ＲＳＤ，６２．１％－１００．３％ｏｆ　ｒｅｃｏｖｅｒｙ，ａｎｄ　ｔｈｅ
ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｌｉｍｉｔ　ｗａｓ　０．２ｍｇ／Ｌ．Ｔｈｅ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｏｆ　ｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ　ｓｈｏｗｅｄ　ａ　ｇｏｏｄ　ｌｉｎｅａｒ　ｒｅｌａｔｉｏｎ　ａｔ　ｔｈｅ　ｒａｎｇｅ　ｏｆ　２．５
－５０ｍｇ／Ｌ　ｗｉｔｈ　０．９９８ｏｆ　ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ．Ｔｈｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｌｉｍｉｔ　ｆｏｒ　ｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ　ｗａｓ　０．９ｍｇ／Ｌ．Ｔｈｅ
ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｉｎ　ｆｒｅｓｈ　ｐｅｔｕｎｉａ　ｒｅｄ　ｓｔｒａｉｎ＇９７０２＇ｗａｓ　ａｓ　ｍｕｃｈ　ａｓ　５３０．５２７ｍｇ／ｋｇ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｐｅｌａｒｇｏｎｉｄｉｎ　３－Ｏ－ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ；ｃｙａｎｉｄｉｎ　３－Ｏ－ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ；ｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ；ｕｌｔｒａ　ｈｉｇｈ　ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｌｉｑｕｉｄ
上 海 交 通 大 学 学 报 （农 业 科 学 版） 第３２卷
ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＵＰＬＣ）
　　花青苷是花青素与葡萄糖等通过糖苷键结合而
形成的一类化合物［１］，广泛存在于植物的茎、叶、花、
果和种子中，是水溶性天然色素，属于黄酮多酚类化
合物，是植物中绝大多数品种的红色、黄色、蓝色和
紫色等颜色的主要成分。花青苷不但具有很强的着
色能力，还在吸引昆虫传粉、生长素运输、保护叶片
免受紫外线伤害［２］、抑制病虫害［３］等方面具有重要
作用，同时还具有很强的清除氧自由基的能力，有美
容养颜、增加视力、降脂减肥、抗衰抗癌等多种重要
的生理功能和药用功能［４］，可应用于食品、药品、化
妆品等领域。
在植物中常见的花青苷有６种［２］，即天竺葵素
（Ｐｅｌａｒｇｏｎｉｄｉｎ）、飞燕草素（Ｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ）和矢车菊素
（Ｃｙａｎｉｄｉｎ），矢 车 菊 素 衍 生 成 的 芍 药 色 素
（Ｐｅｏｎｉｄｉｎ），飞 燕 草 素 衍 生 成 的 牵 牛 花 色 素
（Ｐｅｔｕｎｉｄｉｎ）和锦葵色素（Ｍａｌｖｉｄｉｎ）。目前花青苷常
用的检测方法有单一ｐＨ 法［５］、ｐＨ 示差法［６］、差减
法［７］和高效液相色谱法等［８］。超高效液相色谱
（ＵＰＬＣ）是以１．７μｍ 的超细色谱柱填料为核心技
术的新型色谱分离分析技术［９］，增加了分析的通量、
灵敏度及色谱峰容量，弥补传统 ＨＰＬＣ系统的不
足。利用 ＵＰＬＣ分离与测定花青苷的研究相对较
少，Ｓｉｎｉｌａｌ等［１０］用ＵＰＬＣ对葡萄悬浮培养细胞中的
花青苷进行了相对定量测定，２０１３年高玥等利用
ＵＰＬＣ对花青苷的进行了定性测定［１１］，杨智勇等以
牵牛花素－３－葡萄糖苷标准品建立标准曲线定量测
定了紫色马铃薯花青苷含量［１２］，但未对检测方法进
行优化，不能体现ＵＰＬＣ的优势。本实验以矮牵牛
花瓣为实验材料，建立花青苷ＵＰＬＣ快速定量测定
方法，旨在为植物花青苷的定量分析检测提供新的
方法。
１　材料与方法
１．１　试剂与仪器
超纯水、乙腈、甲醇为色谱纯，甲酸和浓盐酸为
分析纯。
花青苷标准品：矢车菊素－３－葡萄糖苷（Ｃｙａｎｉｄｉｎ
３－Ｏ－ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ），Ｃ２１ Ｈ２１ ＣｌＯ１１，相 对 分 子 质 量
４８４．８４，含 量 ９５％，Ｓｉｇｍａ 公 司； 飞 燕 草 素
（Ｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ），Ｃ１５Ｈ１１ＣｌＯ７，相对分子质量３３８．７，
含量 ９５％，Ｓｉｇｍａ公司。天竺葵素－３－葡萄糖苷
（Ｐｅｌａｒｇｏｎｉｄｉｎ　３－Ｏ－ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ），Ｃ２１Ｈ２１ＣｌＯ１０，相对分
子质量４６８．８４，含量９７％，Ｓｉｇｍａ公司。
Ｗａｔｅｒｓ超高效液相色谱仪（Ａｃｑｕｉｔｙ　ＵＰＬＣ）；
ＭＭ３０型研磨机；ＥＬＧＡ　ＰＵＲＥＬＡＢ　Ｕｌｔｒａ实验室
超纯水系统。
１．２　溶液配制
０．１ｍｏｌ／Ｌ盐酸甲醇：１　０００ｍＬ甲醇中加入
８．６ｍＬ盐酸，混匀。流动相Ａ，甲醇∶乙腈∶水∶甲酸
＝２２．５∶２２．５∶４５∶１０；流动相Ｂ（１０％甲酸水），甲酸
∶水＝１∶９（Ｖ／Ｖ）混匀配制。以上试剂配制后均需经
０．４５μｍ滤膜过滤后超声波脱气３ｍｉｎ才能用于
ＵＰＬＣ上样。
１．３　色谱条件和色谱柱
Ａｃｑｕｉｔｙ　ＵＰＬＣ　ＢＥＨ　Ｃ１８柱（１００ｍｍ×２．１ｍｍ
×１．７μｍ）；柱温：４０℃；流动相Ａ与Ｂ按一定比例
进行梯度洗脱；流速：０．４ｍＬ／ｍｉｎ；检测器波长：５３０
ｎｍ；进样量：５μＬ。
１．４　测定方法
１．４．１　标准品母液的配制
将１ｍｇ花青苷标准品，用甲醇溶解并定容至
１０ｍＬ，即为１００ｍｇ／Ｌ的花青苷标准品母液，贮于
棕色容量瓶中。
１．４．２　溶剂的优化
分别用甲醇、５０％甲醇水、甲醇∶１０％甲酸水
（１∶１）、１０％甲酸水溶液配制花青苷标准溶液，在最
佳的色谱条件下进行检测，比较不同溶剂对检测效
果的影响。
１．４．３　洗脱条件对标准品检测影响
梯度洗脱条件按以下４种进行：
条件１：流速０．３５ｍＬ／ｍｉｎ，运行时间１８ｍｉｎ，０～
１０ｍｉｎ：Ａ由０变为５０％，Ｂ由１００％变为５０％；１０～
１８ｍｉｎ：Ａ由５０％变为０，Ｂ由５０％变为１００％。
条件２：流速０．３５ｍＬ／ｍｉｎ，运行时间１２ｍｉｎ，０
～１０ｍｉｎ：Ａ由０变为５０％，Ｂ由１００％变为５０％；
１０．０～１０．１ｍｉｎ：Ａ由５０％变为０，Ｂ由５０％变为
１００％；１０．１～１２ｍｉｎ：１００％Ｂ。
条件３：流速０．３５ｍＬ／ｍｉｎ，运行时间８ｍｉｎ，０
～６ｍｉｎ：Ａ由０变为５０％，Ｂ由１００％变为５０％；６
～６．１ｍｉｎ：Ａ由５０％变为０，Ｂ由５０％变为１００％；
６．１～８ｍｉｎ：１００％Ｂ。
６５
第２期 褚云霞，等：超高效液相色谱法测定矮牵牛中花青苷含量
条件４：流速０．４ｍＬ／ｍｉｎ，运行时间８ｍｉｎ，０～
６ｍｉｎ：Ａ由０变为３０％，Ｂ由１００％变为７０％；６～
６．１ｍｉｎ：Ａ由３０％变为０，Ｂ由７０％变为１００％；
６．１～８ｍｉｎ：１００％Ｂ。
１．４．４　单独进样与混合进样检测差异
１０ｍｇ／Ｌ三种标准品分别单独进行测定峰面积
与保留时间，与同浓度混合上样进行比对。
１．４．５　标准曲线的绘制
分别取矢车菊素－３－葡萄糖苷和天竺葵素－３－葡
萄糖苷标准品母液６．２５、１２．５、２５、５０、１００、２５０μＬ
用１０％甲酸水稀释至１ｍＬ，即为０．６２５、１．２５、２．５、
５、１０、２５ｍｇ／Ｌ的标准品工作液，取飞燕草素２５、
５０、１００、２５０、５００μＬ用１０％甲酸水稀释至１ｍＬ，即
为２．５、５、１０、２５、５０ｍｇ／Ｌ的标准品工作液。所测
数据用ＥＸＣＥＬ进行分析，以峰面积为纵坐标，花青
苷的浓度为横坐标，绘制花青苷标准曲线。
１．４．６　样品的提取
准确称取矮牵牛品系‘Ｌｘ’（紫色）、‘Ｗ１１５’（白
色）、‘９７０２’（红色）及小花矮牵牛ＤＦＲ 基因转入
‘９７０２’的转化子‘９Ｈ３３’（深红色）即将开放花蕾
（花发育期３［１３］，花的喉部不可见）的花瓣１００ｍｇ，
放入２ｍＬ离心管，加入１．５ｍＬ盐酸甲醇，用研磨
机磨碎，浸泡３０ｍｉｎ，１２　０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，吸
取上清液０．５ｍＬ加入等体积的１０％甲酸水，混匀
后用０．４５μｍ滤膜过滤，即可上样检测，同时做空
白对照实验。
１．４．７　加标回收率与精密度
在本实验条件下，分别往３个品系各２份样品
中加入矢车菊素－３－葡萄糖苷和天竺葵素－３－葡萄糖
苷１．２５、２．５、５ｍｇ／Ｌ进行测定，方法同样品提取。
２．５ｍｇ／Ｌ标准品混合物连续测定６次，计算精密
度，另外１．２５ｍｇ／Ｌ标准品混合物每２ｈ测定１次，
共测定６次，比较花青苷的稳定性。
２　结果与分析
２．１　花青苷ＵＰＬＣ检测适宜波长
花青苷对光吸收的特征性吸收峰波长范围包
括波长为２７０～２８０ｎｍ的紫外光区和波长为４６５
～５６０ｎｍ的可见光区［１４］。２８０ｎｍ和５３０ｎｍ两
个检测波长在相同的保留时间均出现了最大吸收
峰，但在２８０ｎｍ存在较多的干扰峰，而且基线也
随着水比例的上升而逐渐上升，信号峰也较５３０
ｎｍ波长弱，因此不适于做为花青苷 ＵＰＬＣ的检测
波长。
图１　不同检测波长下的ＵＰＬＣ色谱图
下为５３０ｎｍ色谱图；上为２８０ｎｍ色谱图
Ｆｉｇ．１　Ｔｈｅ　ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ　ｉｎ　ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ　２８０ｎｍ　ａｎｄ　５３０ｎｍ
Ｔｈｅ　ｄｏｗｎ　ｌｉｎｅ　ｉｓ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ　ｉｎ　ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ　５３０ｎｍ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｕｐ　ｏｎｅ　ｉｓ　ｉｎ　ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ　２８０ｎｍ
２．２　溶剂对花青苷检测的影响
甲醇溶解标准品由于溶剂峰的干扰，峰型呈２
叉形，而其他溶剂的峰型均相似，但５０％甲醇水做
溶剂时，飞燕草色素的信号峰更弱，而且不存在线性
关系，１０％的甲酸水溶液配制的标准溶液，响应值最
高，峰形最好，而甲醇∶１０％甲酸水（１∶１）效果与１０％
的甲酸水溶液相似，均可作为标准品的稀释液（图
２）。
７５
上 海 交 通 大 学 学 报 （农 业 科 学 版） 第３２卷
图２　不同溶剂溶解的标准品色谱图
ａ，甲醇；ｂ，１０％甲酸水；ｃ，甲醇：１０％甲酸水（１∶１）
Ｆｉｇ．２　Ｔｈｅ　ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ　ｏｆ　ｓｔａｎｄａｒｄ　ｉｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ
ａ，ｍｅｔｈａｎｏｌ；ｂ，１０％ｆｏｒｍｉｃ　ａｃｉｄ；ｃ，ｍｉｘｔｕｒｅ　ｏｆ　ｍｅｔｈａｎｏｌ：１０％ｆｏｒｍｉｃ　ａｃｉｄ（１∶１）
２．３　洗脱条件对标准品检测影响
ＨＰＬＣ的色谱条件经过转换可以应用于 ＵＰＬＣ
的实验中，Ｗａｔｅｒｓ随 ＵＰＬＣ仪器提供了“ＨＰＬＣ－
ＵＰＬＣ方法转换计算器”软件，此计算器对于等度的
ＨＰＬＣ，不会改变流动相的组成和配比，仅对进样量
和流速进行换算，但不能完全解决方法转换的问题，
最佳色谱条件仍需优化［１５］。为确立可在较短时间
进行花青苷有效分离的条件，在参考文献［１６］的基础
上设置了４种分离条件，主要对洗脱溶剂的比例、梯
度变化速度、流速３方面进行调整。条件１可以将
３种物质分开，但检测时间较长，需１８ｍｉｎ，条件２
将时间缩短至１２ｍｉｎ，而不影响分离效果，进一步
缩短时间则使飞燕草素与天竺葵素－３－葡萄糖苷峰
连在一起，分离效果不好（条件３），通过提高流速，
降低流动相Ａ比例，可以在８ｍｉｎ内实现３种物质
的分离（条件４），缩短检测时间，提高检测效率。
图３　不同分离条件下的色谱图
ａ，条件１；ｂ，条件２；ｃ，条件３；ｄ，条件４
Ｆｉｇ．３　Ｔｈｅ　ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ　ｏｆ　ｓｔａｎｄａｒｄ　ｂｙ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｅｌｕｔｉｏｎ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ
ａ，ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　１；ｂ，ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　２；ｃ，ｔｒｅａｔｍｅｍｔ　３；ｄ，ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　４
８５
第２期 褚云霞，等：超高效液相色谱法测定矮牵牛中花青苷含量
２．４　单独进样与混合进样检测差异
１０ｍｇ／Ｌ矢车菊素－３－葡萄糖苷、天竺葵素－３－葡萄
糖苷和飞燕草素单独稀释测定，峰面积分别为：
３１６　３９４、３９１　５７９和６５　０７４，保留时间分别为４．４５２、
５．２７７和５．０３４ｍｉｎ；同浓度３种标准品混合上样，保留
时间不变，峰面积分别为２７０　４１２、３３９　３７９和６５　８９０，可
见混合上样会影响花青苷的信号峰强弱，但对保留时
间没影响，可一次上样同时检测以上３种花青苷。
２．５　标准曲线的绘制
仪器噪音峰为０．０００　５，以３倍信噪比为仪器检
出限，天竺葵素－３－葡萄糖苷及矢车菊素－３－葡萄糖苷
检出限为０．２ｍｇ／Ｌ，以１０倍信噪比为仪器的定量
限，天竺葵素－３－葡萄糖苷及矢车菊素－３－葡萄糖苷定
量限为０．６２５ｍｇ／Ｌ，而飞燕草素信号峰较弱，２．５
ｍｇ／Ｌ为其定量限，０．９ｍｇ／Ｌ为其检出限。根据测
定结果，矢车菊素－３－葡萄糖苷回归方程为Ｙ＝
３１　２２５　Ｘ－３６８．５４，相关系数为０．９９９　３；天竺葵素－
３－葡萄糖苷回归方程为Ｙ＝３４　２９０　Ｘ＋５８４．２６，相关
系数为 ０．９９９　６；飞燕草素的回归方程为Ｙ＝
７　００３．３　Ｘ＋３２９．４５，相关系数为０．９９８（图４）。
图４　花青苷浓度标准曲线
Ｆｉｇ．４　Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ＵＰＬＣ　ｐｅａｋ　ａｒｅａ　ａｎｄ
ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎｓ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
２．６　加标回收率与精密度
实验表明，在选定的实验条件下，矢车菊素－３－
葡萄糖苷的加标回收率在６２．１％～８６．６％（表１），
天竺葵素－３－葡萄糖苷加标回收率在 ８０．３％ ～
１００．３％（表２）。６次重复测定相对标准偏差为
１．８２２％～２．７０８％（表３）。
稳定性实验结果表明（图５）：矢车菊素－３－葡萄
糖苷和天竺葵素－３－葡萄糖苷１０ｈ内峰面积的ＲＳＤ
为３．０％～３．３％，表明供试品溶液在１０ｈ内相对稳
定，但飞燕草素的含量一直呈下降趋势，到１０ｈ测
定时仅为初始浓度的３７％，说明飞燕草素不稳定，
需尽快测定，长时间放置对结果影响很大。
表１　矢车菊素－３－葡萄糖苷加标回收率
Ｔａｂ．１　Ｔｈｅ　ｒｅｃｏｖｅｒｉｅｓ　ｏｆ　ｃｙａｎｉｄｉｎ　３－Ｏ－ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ
样品
Ｓａｍｐｌｅ
本底值／
（ｍｇ·Ｌ－１）
Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ
ｖａｌｕｅ
加入值／
（ｍｇ·Ｌ－１）
Ａｄｄｅｄ　ｖａｌｕｅ
实测值／
（ｍｇ·Ｌ－１）
Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ
ｖａｌｕｅ
回收率／％
Ｒｅｃｏｖｅｒｙ
Ｌｘ　 ０　 １．２５　 ０．７７６　 ６２．１
Ｌｘ　 ０　 １．２５　 ０．９５２　 ７６．１
Ｌｘ　 ０　 ２．５　 １．８９２　 ７５．７
Ｌｘ　 ０　 ２．５　 １．８０７　 ７２．３
Ｌｘ　 ０　 ５　 ３．８４４　 ７６．９
Ｌｘ　 ０　 ５　 ３．２４９　 ６５．０
Ｗ１１５　 ０　 １．２５　 ０．８６８　 ６９．４
Ｗ１１５　 ０　 １．２５　 １．０２７　 ８２．２
Ｗ１１５　 ０　 ２．５　 １．９２５　 ７７．０
Ｗ１１５　 ０　 ２．５　 １．９０７　 ７６．３
Ｗ１１５　 ０　 ５　 ３．４４３　 ６８．９
Ｗ１１５　 ０　 ５　 ３．５３２　 ７０．６
９７０２　 ０．０１４　 １．２５　 ０．９８２　 ７８．６
９７０２　 ０．０１１　 １．２５　 １．０８３　 ８６．６
９７０２　 ０．０１７　 ２．５　 １．６９２　 ６７．７
９７０２　 ０．０１７　 ２．５　 １．９２１　 ７６．９
９７０２　 ０．０１４　 ５　 ４．１０４　 ８２．１
９７０２　 ０．０１４　 ５　 ３．２２６　 ６４．５
表２　天竺葵素－３－葡萄糖苷加标回收率
Ｔａｂ．２　Ｔｈｅ　ｒｅｃｏｖｅｒｉｅｓ　ｏｆ　ｐｅｌａｒｇｏｎｉｄｉｎ　３－Ｏ－ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ
样品
Ｓａｍｐｌｅ
本底值／
（ｍｇ·Ｌ－１）
Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ
ｖａｌｕｅ
加入值／
（ｍｇ·Ｌ－１）
Ａｄｄｅｄ　ｖａｌｕｅ
实测值／
（ｍｇ·Ｌ－１）
Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ
ｖａｌｕｅ
回收率／％
Ｒｅｃｏｖｅｒｙ
Ｌｘ　 ０．０００　 １．２５　 １．０５１　 ８４．１
Ｌｘ　 ０．０００　 １．２５　 １．１６９　 ９３．５
Ｌｘ　 ０．０００　 ２．５　 ２．０１８　 ８０．７
Ｌｘ　 ０．０００　 ２．５　 １．９９７　 ７９．９
Ｌｘ　 ０．０００　 ５　 ４．１４０　 ８２．８
Ｌｘ　 ０．０００　 ５　 ４．０２１　 ８０．４
Ｗ１１５　 ０．０００　 １．２５　 １．２５４　 １００．３
Ｗ１１５　 ０．０００　 １．２５　 １．１３７　 ９０．９
Ｗ１１５　 ０．０００　 ２．５　 ２．１６０　 ８６．４
Ｗ１１５　 ０．０００　 ２．５　 ２．０８４　 ８３．４
Ｗ１１５　 ０．０００　 ５　 ４．０２３　 ８０．５
Ｗ１１５　 ０．０００　 ５　 ４．１７１　 ８３．４
９７０２　 ０．１５８　 １．２５　 １．２００　 ８３．４
９７０２　 ０．１９０　 １．２５　 １．２１２　 ８１．７
９７０２　 ０．２３８　 ２．５　 ２．４０６　 ８６．７
９７０２　 ０．２３１　 ２．５　 ２．４７２　 ８９．７
９７０２　 ０．１９８　 ５　 ４．２１１　 ８０．３
９７０２　 ０．２０１　 ５　 ４．３８１　 ８３．６
９５
上 海 交 通 大 学 学 报 （农 业 科 学 版） 第３２卷
表３　２．５ｍｇ／Ｌ标准品重复测定结果
Ｔａｂ．３　Ｔｈｅ　６ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ　ｏｆ　２．５ｍｇ／Ｌ　ｓｔａｎｄａｒｄ　 ｍｇ／Ｌ
标准品浓度
Ｓｔａｎｄａｒｄｓ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
１　 ２　 ３　 ４　 ５　 ６
平均值
Ａｖｅｒａｇｅ
相对标准偏差／％
Ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｓｔａｎｄａｒｄ
ｄｅｖｉａｔｉｏｎ
Ｃｙａｎｉｄｉｎ　 ２．４８２　 ２．４８３　 ２．４３９　 ２．５５２　 ２．５５９　 ２．４８２　 ２．４９９　 １．８６１
Ｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ　 ２．４９４　 ２．５９９　 ２．４２４　 ２．４１１　 ２．４８５　 ２．５０６　 ２．４８７　 ２．７０８
Ｐｅｌａｒｇｏｎｉｄｉｎ　 ２．４０５　 ２．４５８　 ２．５１２　 ２．４２７　 ２．５０２　 ２．５０３　 ２．４６８　 １．８２２
２．７　矮牵牛中花青苷测定结果
４份材料中，紫色品系‘Ｌｘ’及白色品系‘Ｗ１１５’
均未检出矢车菊素－３－葡萄糖苷、天竺葵素－３－葡萄糖
苷及飞燕草素，而红色品系‘９７０２’未检出天竺葵素－
３－葡萄糖苷，转入外源ＤＦＲ基因的转化子‘９Ｈ３３’
不仅检测出了天竺葵素－３－葡萄糖苷，矢车菊素－３－葡
萄糖苷的含量也大幅提高（表４）。
表４　矮牵牛花瓣中花青苷含量
Ｔａｂ．４　Ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｆｌｏｗｅｒｓ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ‘９７０２’ａｎｄ‘９Ｈ３３’ ｍｇ／ｋｇ
材料
Ｓａｍｐｌｅ
矢车菊素－３－葡萄糖苷
Ｃｙａｎｉｄｉｎ　３－Ｏ－ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ
飞燕草素
Ｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ
天竺葵素－３－葡萄糖苷
Ｐｅｌａｒｇｏｎｉｄｉｎ　３－Ｏ－ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ
合计
Ｔｏｔａｌ
９７０２　 ４６９．９１０（６５．６４３） ６０．６１７（８．６８３） ０　 ５３０．５２７
９Ｈ３３　 １　５１５．２２５（１０８．０７４） ６５．３３６（１０．４２１） ９９．６１２（５．１３８） １　６８０．１７３
　　注：表格中数值是３次重复的平均值，括号中数值是标准差。
Ｎｏｔｅ：Ｔｈｅ　ｎｕｍｂｅｒｓ　ｌｉｓｔｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｔａｂｌｅ　ｗｅｒｅ　ｔｈｅ　ａｖｅｒａｇｅ　ｏｆ　３ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｎｕｍｂｅｒｓ　ｉｎ　ｐａｒｅｎｔｈｅｓｅｓ　ｗｅｒｅ　ｔｈｅ　ｓｔａｎｄａｒｄ　ｄｅｖｉａｔｉｏｎ．
图５　花青苷标准品随时间变化趋势图
Ｆｉｇ．５　Ｔｈｅ　ｃｈａｎｇｅ　ｏｆ　ｓｔａｎｄａｒｄｓ　ｗｉｔｈ　ｔｉｍｅ
３　结论
本文选用０．１ｍｏｌ／Ｌ盐酸甲醇提取花瓣中的花
青苷，采用梯度洗脱同时测定矮牵牛中３种花青苷
的含量，适合于各种样品花青苷的分析，大大减少了
基体对检测物质出峰的干扰，操作简便、快捷，与
ＨＰＬＣ相比能大大缩短检测时间，提高检测效率。
并且该方法还能有效的提高花青苷的检测灵敏度和
准确性，降低假阳性结果的出现，适用于矮牵牛中花
青苷含量的测定。
４　讨论
ＨＰＬＣ测定花青苷的含量单个样品需测定２０
～６０ｍｉｎ［１７－１８］，孙翊等通过优化洗脱条件将单个样
品的检测时间缩短至１５ｍｉｎ［１９］，而本方法仅需８
ｍｉｎ，大大提高了检测效率。ＨＰＬＣ检测时定量限
为１ｍｇ／Ｌ［２０］，而本方法下可达０．６２５ｍｇ／Ｌ，灵敏
度更高。由于加标回收实验加入的是用甲醇溶解的
标准品，经空气吹干，可能造成了部分损耗，导致本
实验中回收率偏低。从稳定性结果看，游离的花色
素很不稳定，这与前人的报道一致［１４］，因此飞燕草
素未进行加标回收试验。
一般 ＨＰＬＣ进行花青苷定量测定时以矢车菊－
３－葡萄糖苷标准曲线进行浓度计算［２１］，本文中
‘９Ｈ３３’的 天 竺 葵 素－３－葡 萄 糖 苷 经 测 定 为
９９．６１２ｍｇ／ｋｇ鲜重，改为参照矢车菊－３－葡萄糖苷标
准曲线后计算的值为９９．８２１ｍｇ／ｋｇ鲜重，可见花
青苷ＵＰＬＣ定量测定时也可以矢车菊－３－葡萄糖苷
标准曲线计算其他花青苷含量。
由于矮牵牛ＤＦＲ主要催化二氢杨梅黄酮生成
无色飞燕草素，对二氢栎皮黄酮也有作用，而对二氢
山萘酚则无作用，致使不存在天竺葵素的积累，外源
０６
第２期 褚云霞，等：超高效液相色谱法测定矮牵牛中花青苷含量
花色素结构基因的转入，可以改变矮牵牛花色，产生
原不存在的天竺葵素［２２］，而花青苷成份及含量的测
定，可为外源基因在矮牵牛的表达提供直接证据，也
可为矮牵牛花色素结构基因、调控基因等的深入研
究奠定基础。
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