全 文 ：中国农学通报 2010,26(21):54-58
Chinese Agricultural Science Bulletin
0 引言
硫 代 葡 糖 苷 酶 又 称 芥 子 酶（myrosinase，
EC3.2.3.147），广泛存在于油菜、甘蓝、白菜、萝卜等十
字花科植物中，芥子酶与底物硫代葡糖苷共同组成了
该类植物特有的防御系统。芥子酶是一种比较稳定
的酶，与硫代葡糖苷分别储存在植株不同的细胞中，
当植物体受到害虫或病菌侵害时，细胞受损伤，使芥
子酶与底物相遇，并将底物降解为有毒化合物，抵御病
虫侵害[1-2]，人们称之为“芥子炸弹”。研究表明，硫代葡
糖苷经由芥子酶水解后，产生D-葡萄糖、硫酸盐以及
一系列有生物活性的水解产物，如异硫氰酸酯
（isothiocyanates）、腈（nitriles）、硫 氰 化 物
（thiocyanates）、上皮硫烷烃（epithioalkanes）等。这些
不同的硫代葡糖苷水解产物在抗癌、植物防御、风味形
基金项目：国家自然科学基金项目“新型芥子酶基因TGG4和TGG5的表达调控及生物学功能研究”（30571064）。
第一作者简介：张盛敏，男，1978年出生，硕士研究生，主要从事基因工程应用的研究。通信地址：570228海南省海口市人民大道58号海南大学农学
院，Tel：0898-66293351，E-mail：zsm1213@sina.com。
通讯作者：张家明，男，1966年出生，研究员，博士生导师，主要从事分子生物学研究。Tel：0898-66984866，E-mail：jmzhang@vip.163.com。
收稿日期：2010-04-14，修回日期：2010-07-19。
拟南芥硫代葡糖苷酶基因TGG1的
克隆、表达和酶学特性
张盛敏 1,2，孙雪飘 2，张家明 1,2
（1海南大学农学院，海口 570228；2中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海口 571101）
摘 要：采用RT-PCR方法克隆拟南芥硫代葡糖苷酶基因TGG1，利用毕氏酵母表达。重组蛋白用镍亲和
柱纯化，获得高纯度芥子酶。重组蛋白分子量78 kD，与天然TGG1分子量接近，为糖基化蛋白。TGG1信
号肽在酵母中具有分泌功能，约25%芥子酶分泌到培养基中。TGG1重组蛋白具有广泛的pH适应性，最
适反应温度40℃左右。其活性被低浓度Vc激活，被高浓度Vc抑制。用Hanes plot方法计算TGG1重组
蛋白，以Sinigrin为底物时，Km为65 μmol/L，最大反应速率Vmax为3.28 μmol/(min·mg)。
关键词：拟南芥；芥子酶；硫代葡糖苷；重组蛋白
中图分类号：Q946 文献标志码：A 论文编号：2010-1117
Cloning and Overexpression of Myrosinase Gene TGG1 from Arabidopsis thaliana and
Characterization of its Recombinant Protein
Zhang Shengmin1,2, Sun Xuepiao2, Zhang Jiaming1,2
（1College of Agriculture, Hainan University, Haikou 570228;
2Institute of Tropical Biotechnology, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou 571101)
Abstract: Myrosinase gene TGG1 of Arabidopsis thaliana was cloned by RT-PCR and over expressed in Pichia
pastoris. The recombinant protein of TGG1 was purified with Ni-NTA. The recombinant protein had a
molecular weight of 78 kD, larger than the deduced naked protein (58 kD), but similar to the molecular weight
of the natural TGG1 protein. The TGG1 signal peptide has some secretion function in yeast, resulted in
approximately 25% myrosinases in the culture medium. The TGG1 recombinant protein was active in a wide pH
and temperature range. The optimal reaction temperature was around 40℃ , and the pH between 6 and 9.
Myrosinase activity was activated by low concentrations of ascorbic acid, and suppressed by high
concentrations. The apparent Km and Vmax were 65 μmol/L and 3.28 μmol/(min·mg), respectively when sinigrin
was the substrate.
Key words: Arabidopsis thaliana; myrosinase; glucosinolate; recombinant protein
张盛敏等：拟南芥硫代葡糖苷酶基因TGG1的克隆、表达和酶学特性
成等方面具有重要作用[3]。
芥子酶由一个数量庞大的基因家族编码。油菜
（B. napus）就有 20~25个这样的基因，其基因家族由 3
个亚家族MA、MB、MC组成，基因数量分别为 5个
MA，10~15个MB，5个MC[4-6]。拟南芥（Arabidopsis
thaliana）为十字花科植物，具有较小的基因组，前人研
究发现，3个拟南芥芥子酶基因，分别是TGG1、TGG2和
TGG3[7-8]。研究表明，TGG1、TGG2在拟南芥子叶、茎、叶
片和花中表达，在根和种子中不表达[6]。而TGG3是不
能编码完整芥子酶的假基因，在雄蕾和花瓣中特异表
达[9]。最近研究又发现一个新的芥子酶基因家族，由3
个基因组成，分别定名为 TGG4、TGG5和 TGG6，其中
TGG4和TGG5在酵母中表达的重组蛋白具有很强芥子
酶活性[9-10]，而TGG6与TGG3类似，被证实为花特异表
达的假基因[11]。
笔者克隆了TGG1基因全长cDNA序列，构建酵母
表达载体，转化毕氏酵母，初步研究了重组蛋白的酶学
特性。
1 材料与方法
1.1 拟南芥种子和栽培条件
拟南芥生态型Col-0的种子购自英国Nottingham
Arabidopsis Stock Centre。采用营养土栽培，培养室温
度20~22℃，光周期16 h/8 h，光照强度200 μmol/（m2·s）。
1.2 mRNA提取和TGG1 cDNA的克隆
拟南芥叶片用液氮研磨，采用上海博彩生物科技
有限公司的 3S Trizol RNA提取试剂盒提取总RNA。
然后采用Oligotex Direct mRNA纯化试剂盒（Qiagen
GmbH，Hilden，Germany）提取mRNA。M-MuLV反转
录酶和LA Taq酶购自上海宝生物公司。用基因特异
引物 TGG1F（5’ATA TAT GGA TCC ACC ATG AAG
CTT CTT ATG CTC GCC 3’，带 BamHI 位点）和
TGG1R（5’AAT TAA GCG GCC GCT CAA ATG GTG
ATG GTG ATG GTG TGC ATC TGC AAG ACT CTC
CC 3’，带NotI位点和6个组氨酸密码子）扩增TGG1基
因 cDNA，扩增产物克隆到 pMD19-T载体（上海宝生
物公司）上。挑若干克隆测序，选择与GenBank数据
库中cDNA序列完全一致的克隆进入下一步工作。
1.3 酵母表达载体的构建和酵母转化
用Bam HI和Not I酶切TGG1 cDNA克隆，电泳回
收基因片段。纯化后与酵母表达载体 pPic3.5K（已用
Bam HI和Not I酶切）连接。pPIC3.5K是一个细胞内
表达载体（Invitrogen，San Diego，CA，USA），连接产物
转化大肠杆菌感受态细胞，用添加氨苄青霉素的LB
平板筛选转化菌落。挑阳性克隆培养提取质粒，酶切
鉴定，选择插入片断正确的克隆测序。
选择序列正确的克隆提取质粒，用Sal I酶切线形
化后，用电击法转化酵母。电转化参数为 200 Ω，
25 μF，1.5 kV。转化细胞涂布在MD平板上筛选阳性
克隆。
1.4 TGG1基因的酵母表达和酶蛋白的纯化
随机挑取克隆，按照 Invitrogen的Pichia表达外源
基因的操作手册进行基因表达。挑取的阳性克隆，经
甲醇诱导 3天后，3500 r/min离心收集酵母菌体，用
Breaking buffer（20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5）将菌体
重悬后，每毫升菌体加入 Protease Inhibitor Cocktail
（上海生工）10 μL，用玻璃珠法破碎细胞，离心收集上
清，即为酶蛋白的粗提液。
酶蛋白粗提液经0.45 μm滤膜过滤，收集滤液，用
HisTrapTM HP（GE Healthcare Bio-Sciences AB）纯化。
纯化蛋白时，先用 Binding buffer（20 mmol/L sodium
phosphate，500 mmol/L NaCl，30 mmol/L Imidazole，
pH 7.4）平衡柱子后，再上样，然后分别用 Elution A
（20 mmol/L sodium phosphate，500 mmol/L NaCl，
60 mmol/L Imidazole，pH 7.4）和 Elution B（20 mmol/L
sodium phosphate，500 mmol/L NaCl，500 mmol/L
Imidazole，pH 7.4）洗脱目的蛋白。用1.5 mL的离心管
收集洗脱液，每管收集 500 μL，检测各组分的芥子酶
活性。
1.5 芥子酶活性测定和TGG1酶学特性
通过检测芥子酶水解底物 sinigrin（Sigma）所释放
的葡萄糖的量来确定芥子酶的活性。芥子酶活性测定
的反应体系是：10 μL Phosphate Buffer（50 mmol/L，
pH 6.0），2 μL sinigrin（100 mmol/L），2 μL myrosinase
solution，2 μL ascorbate（3.0 mmol/L），蒸馏水定容至
20 μL，混匀后置37℃反应30 min，95℃灭活5 min。加
入葡萄糖测定试剂（Randox）37℃反应10 min，用分光
光度计（美国贝特曼 800）测定 505 nm消光值。根据
Randox 试剂的使用方法计算芥子酶活性，根据
Bradford蛋白质测定试剂盒的操作方法进行酶蛋白的
定量测定。
2 结果与分析
2.1 TGG1基因的克隆和表达载体构建
用RT-PCR方法扩增到TGG1基因完整编码区（图
1A）。纯化后，与pMD19-T载体连接，转化大肠杆菌，
在选择培养基上筛选阳性克隆。随机挑选6个克隆提
取质粒，用EcoRI酶切，结果表明6个克隆都含有TGG1
基因插入片段（图1B）。挑5个克隆测序，尽管LA Taq
是高保真的DNA聚合酶，仍然具有PCR错误。在5个
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克隆中，仅1个克隆在TGG1编码区与GenBank数据库
中的序列完全相同。该克隆含 TGG1编码区 1533碱
基，编码 511个氨基酸，下游含 6个组氨酸密码子和 1
个终止密码子，与预期一致。
选取序列正确的克隆提取质粒，用Bam HI和Not
I酶切，回收 TGG1基因片段，连接到酵母表达载体
pPIC3.5K。用Bam HI和Not I酶切，电泳证明重组质
粒有正确的插入片段（图1C）。将质粒测序确认，获得
与预期完全一致的酵母表达载体。
2.2 TGG1酶蛋白的表达和纯化
将TGG1表达载体质粒用SalI线型化后电击转化
酵母菌株GS115。选择表达量高的克隆规模化培养提
取芥子酶。芥子酶用镍亲和层析柱纯化，获得高纯度
的芥子酶，在点样量过量的情况下，银染后几乎看不到
杂带（图 2）。TGG1编码蛋白的计算分子量为 61 kD，
加上6个组氨酸，计算分子量为62 kD。SDS-PAGE实
际测算分子量为 78 kD，略大于拟南芥天然 TGG1的
75 kD，说明酵母表达的 TGG1可能与天然 TGG1具有
类似的翻译后加工，包括信号肽的剪切和糖基化。
笔者在培养基中也检测到芥子酶活性，大约有
25%的芥子酶分泌到培养基中。分泌到培养基中的芥
子酶可以用相同的镍亲和层析柱纯化，获得高纯度的
芥子酶（图 2）。SDS-PAGE表明培养基中的芥子酶与
细胞裂解液中的芥子酶有相同的分子量（图 2），芥子
酶活性特征也相同。说明TGG1信号肽在酵母中具有
分泌功能。
2.3 TGG1重组蛋白的酶学特性
用毕氏酵母表达的TGG1重组蛋白具有较强的芥
子酶活性。纯化的芥子酶具有较好的稳定性，可以在
4℃条件下保存数月。
TGG1重组蛋白在 20℃时具有 65%左右的酶活
性，30~50℃范围内酶活性都较强，40℃左右酶活性达
到最高，60℃时还有40%左右的酶活性，80℃时还维持
弱的酶活性（图3），90℃时完全失活。说明TGG1具有
一定的耐热性。
TGG1重组蛋白具有广泛的 pH适应性，在 pH5.0~
10.5范围内具有80%以上的酶活力（图4）。最适pH在
6.0~9.5之间。TGG1对碱性条件的适应性强于酸性条
A：TGG1基因的RT-PCR扩增；B：pMD19-TGG1克隆的酶切鉴定；M2为TaKaRa分子量标准（D519A）；泳道1~6：经Eco RI酶切的含TGG1序列的质
粒；C：pPic3.5K-TGG1重组质粒的酶切鉴定；M1：TIANGEN分子量标准（MD116）；泳道1：BamHI和NotI双酶切的pPic3.5K-TGG1。
图1 TGG1基因的扩增、克隆和酵母表达载体构建
1：分子量标准；2：从酵母裂解液纯化获得的TGG1蛋白；3：从培养基中
纯化获得的TGG1蛋白
图2 纯化TGG1重组蛋白的SDS-PAGE
0
20
40
60
80
100
20 30 40 50 60 70 80
温度/℃
相
对
酶
活
性
/%
图3 温度对TGG1重组蛋白酶活力的影响
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张盛敏等：拟南芥硫代葡糖苷酶基因TGG1的克隆、表达和酶学特性
件，在 pH为 11时，仍维持 70%左右的酶活性。而 pH
3.0时，该酶完全失活（图4）。
植物芥子酶一般被低浓度的Vc激活，被高浓度的
Vc抑制。Vc浓度对 TGG1重组蛋白活性的影响呈典
型的芥子酶特征（图5）。当反应体系中不加Vc时，酶
活性较低，添加 0.3 mmol/L的 Vc使 TGG1活性提高
5倍。当Vc浓度达到 1.5 mmol/L时，芥子酶活性最
高。当抗坏血酸高于此浓度时，酶活性迅速下降，至
5.0 mmol/L时，酶活性被完全抑制（图5）。
2.4 TGG1的动力学常数
以Sinigrin为底物研究了TGG1重组蛋白的酶促动
力学特性。TGG1饱和底物浓度较低，底物浓度为
0.2 mmol/L时，就达到饱和。采用Hanes plot，以底物
浓度[S]为横坐标，以反应速率V除[S]为纵坐标作图
（图 6）。计算得TGG1重组蛋白的Km为 65 μmol/L，最
大反应速率Vmax为3.28 μmol/(min·mg)。
3 讨论
根据油菜（B. napus）和拟南芥（A. thaliana）芥子酶
cDNA推断，芥子酶单体的分子量为 59 kD左右。然
而，所有植物芥子酶都有不同程度糖基化，使芥子酶单
体分子量达到 65~75 kD[8,12-13]。笔者得到的重组蛋白
分子量为 78 kD，与天然 TGG1分子量接近，为糖基化
蛋白。
到目前为止，所有芥子酶多肽187位（以S. alba结
晶芥子酶为参照）都是谷氨酰氨，其酶活性需要低浓
度的抗坏血酸来激活，以抗坏血酸作为质子供体。这
种结构可能增加了植物对酶活性的时空调控。对芥子
酶的晶体结构分析结果表明，抗坏血酸位于芥子酶的
活性中心[14]。然而，当抗坏血酸浓度较高时，反而抑制
芥子酶的活性[11-12]。研究结果显示，拟南芥TGG1所编
码的蛋白质具有芥子酶活性功能，其活性被低浓度Vc
激活，被高浓度Vc抑制，具有植物芥子酶的活性特点。
TGG1~TGG6基因构成了拟南芥芥子酶基因家族，
并在表达调控上分工明确，深入研究TGG1~TGG6基因
将对植物硫代葡糖苷/芥子酶防御系统起源进化、植
物-昆虫互作和硫代葡糖苷代谢的作用以及植物芥子
0
20
40
60
80
100
3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10 10.5 11pH
相
对
酶
活
性
/%
图4 pH对TGG1重组蛋白酶活性的影响
0
10
20
30
40
50
60
70
0 2 4 6Vc浓度/(mmol/L)
芥
子
酶
活
力
/(
μm
ol
/(
m
in·m
g)
)
0
30
60
90
120
150
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5[S]
[S]/V
图5 抗坏血酸浓度对芥子酶活力的影响 图6 TGG1重组蛋白的Hanes-Plot
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酶可能的功能具有重要意义。研究表明，拟南芥和甘
蓝型油菜中，TGG1在地面组织如气孔保卫细胞表达和
韧皮部细胞中表达，可能提供比TGG2更多的活性，两
者表现为不同酶活性和截然不同的表达模式，表现出
复杂的互作关系[15]。在拟南芥叶片中表达的2个芥子
酶基因TGG1和TGG2同时被T-DNA插入失活时，兼性
昆虫粉纹夜蛾（Trichoplusia ni）和烟草天蛾（Manduca
sexta）的取食量显著增加，但专性昆虫小菜蛾（Plutella
xylostella）却不受影响[15]。因此，对拟南芥TGG1、TGG2
基因及其突变体的分析，对进一步了解芥子酶基因
TGG1、TGG2的生物学功能和两者的互作问题具有重
要意义。
4 结论
试验克隆了拟南芥硫代葡糖苷酶基因TGG1，利用
毕氏酵母表达，重组蛋白用镍亲和柱纯化，获得高纯度
芥子酶。通过对 TGG1纯化蛋白进行酶学特性分析，
结果表明：TGG1重组蛋白分子量 78 kD，与天然TGG1
分子量接近，为糖基化蛋白。TGG1信号肽在酵母中具
有分泌功能，约25%芥子酶分泌到培养基中。TGG1重
组蛋白具有广泛的 pH适应性，最适反应温度 40℃左
右。TGG1重组蛋白的活性被低浓度Vc激活，被高浓
度Vc抑制。用Hanes plot方法计算TGG1重组蛋白以
Sinigrin为底物时，Km为 65 μmol/L，最大反应速率Vmax
为3.28 μmol/(min·mg)。
参考文献
[1] Hoglund A S, Lenman M, Falk A, et al. Distribution of Myrosinase
in Rapeseed Tissues[J].Plant Physiol,1991,95(1):213-221.
[2] Kelly P J, Bones A, Rossiter J T. Sub-cellular immunolocalization
of the glucosinolate sinigrin in seedlings of Brassica juncea[J].
Planta,1998,206(3):370-377.
[3] 李鲜,陈昆松,张明方,等.十字花科植物中硫代葡萄糖苷的研究进
展[J].园艺学报,2006,33(3):675-679.
[4] Xue J P, Lenman M, Falk A, et al. The glucosinolate-degrading
enzyme myrosinase in Brassicaceae is encoded by a gene family[J].
Plant Mol Biol,1992,18(2):387-398.
[5] Thangstad O P, Winge P, Husebye H, et al. The myrosinase
(thioglucoside glucohydrolase) gene family in Brassicaceae[J].
Plant Mol Biol,1993,23(3):511-24.
[6] Rask L, Andréasson E, Ekbom B, et al. Myrosinase: gene family
evolution and herbivoredefense in Brassicaceae[J]. Plant Mol Biol,
2000,42(1):93-114.
[7] Chadchawan S. Beta-thioglucoside glucohydrolase (myrosinase)
gene organization and expression in Arabidopsis thaliana L. ecotype
Columbia[D]. USA: University of Washiongton,1995.
[8] Xue J, Jrgensen M, Philgren U, et al. The myrosinase gene family
in Arabidopsis thaliana: gene organisation, expression and evolution
[J].Plant Mol Biol,1995,27:911-922.
[9] Zhang J M, Bo P, Xue J, et al. The third myrosinase gene TGG3 in
Arabidopsis thaliana is a pseudogene specifically expressed in
stamen and petal[J]. Physiologia Plantarum,2002,115(1):25-34.
[10] 伍祚斌,孙雪飘,汪萌,等.拟南芥芥子酶基因TGG4的克隆、表达和
酶活性鉴定[J].分子植物育种,2008,6(4):770-774.
[11] 汪萌,伍祚斌,李定琴,等.拟南芥芥子酶基因 TGG6是花特异表达
的假基因[J].生命科学研究,2007,11(4):316-322.
[12] Chen S X, Halkier B A. Functional expression and
characterizationof the myrosinase MYR1 from Brassica napus in
Saccharomyces cerevisiae[J]. Prot Expr Pur,1999,17:414-420.
[13] Falk A, Taipalensuu J, Bo Ek, et al. Characterization of rapeseed
myrosinase-binding protein[J].Planta,1995,195(3):387-95.
[14] Burmeister W P, Cottaz S, Driguez H, et al. The crystal structures of
Sinapis alba myrosinase and a covalent glycosyl-enzyme
intermediate provide insights into the substrate recognition and
active-site machinery of an S-glycosidase[J]. Structure,1997,5:
663-675.
[15] Barth C, Jander G. Arabidopsis myrosinases TGG1 and TGG2 have
redundant function in glucosinolate breakdown and insect defense
[J]. Plant J,2006,46(4):549-562.
·· 58