全 文 ：分子植物育种，2005年，第 3卷，第 1期，第 26-30页
M olecularPlantBreeding,2005,Vol.3,No.1,26-30
研究报告
RESEARCH REPORT
拟南芥花组织高表达 TCP家族转录因子 !#$%&’#&的克隆与转录激活
活性鉴定
苏力坦·阿巴白克力 1,2* 魏刚 2 雷娟 2 朱玉贤 2
1新疆大学生命科学与技术学院，乌鲁木齐，830046;2北京大学蛋白质工程与植物基因工程国家重点实验室，北京，100871
*通讯作者，sultan816@ 163.com
本文从拟南芥中克隆到基因 !#$%&’#&的全长读码框。多序列比对结果表明，在推导的氨基酸水
平上，该基因编码的蛋白含有特征性的 TCP保守结构域，与已知的玉米、金鱼草和水稻的 TCP家族基因中
都存在显著性的保守性。另外通过酵母单杂交实验证明该基因编码的蛋白在酵母体内具有转录激活功能。
同时 RT-PCR 实验结果表明，该基因在拟南芥花组织中表达量相对较高，具有明显的组织表达特异性。花
器官高表达转录因子的克隆将为研究 TCP基因调控植物花发育和花形态建成提供新的物质基础。
拟南芥，转录因子，TCP家族，酵母单杂交，转录激活活性
Cloning and Transactivation Identification of!#$%&’#&,a New M em ber
ofTCP FamilyHighExpressedinFlowerin!()*+,-./+/
SultanAbabakeli1,2* W eiGang2 LeiJuan2 ZhuYuxian2
1 CollegeofLifeScienceand Technology,Xinjiang University,Urumchi,830046;2 NationalLaboratory ofProtein Engineering and PlantGenetic
Engineering,PekingUniversity,Beijing,100871
*Correspondingauthor,sultan816@ 163.com
W ecloned thefull-length open readingfram eofgene!#$%&’#& from !()*+,-./+/.M ultiplese-
quencesalignm entresultshowed thatthegeneencoded aprotein containing theTCP conserved dom ain,which
shared thehigh similarity in amino acid sequencewith formerly reported TCP fam ily transcription factorsfrom
m aize,Antirrhinum andrice.Bytheyeastone-hybridtechnique,theproteinencodedby!#$%&’#& exhibitedthe
function oftranscription activation in yeast.FurtherexperimentofRT-PCR showed that!#$%&’#& was ex-
pressed relatively higherin flowersthan othertissuesin !()*+,-./+/.The cloning ofthe new memberofTCP
transcriptionfactorfam ilywillprovidenew baseofm aterialfortheresearch ofplantflowerdevelopmentregula-
tionandflowertissueform ing.
!()*+,-./+/,Transcriptionfactor,TCP fam ily,Yeastone-hybrid,Transcriptionactivation
TCP家族转录因子是植物所特有的转录因子
家族（ Riechmann etal.,2000;Riechm ann and Rat-
cliffe,2000）。该家族最早发现于金鱼草中的基因
0102-+,3) (010)和玉米中的基因 3-/+43 *()4053, #
(*#)编码结构相似的蛋白，它们都形成非典型的螺
旋—环—螺旋结构，后来在水稻 PCF DNA 结合蛋
白中也发现这种蛋白结构的存在(Cubasetal.,1999;
Doebleyetal.,1997;KosugiandOhashi,1997;Luoet
al.,1996;1999)。TCP家族的蛋白具有结合 DNA 和
二聚化的特性。利用 CYC，TB1 和水稻 PCF1，
2，3，5，6蛋白研究发现，TCP结构域组成的 baisic
helix-loop-helix (bHLH)结构是二聚化和结合 DNA
所必需的(KosugiandOhashi,2002)。已进行功能研
究的 TCP家族的基因大多与植物发育有关。金鱼草
中的 TCP家族基因 010与 ,+05对花的发育有影响
很大，这两个基因的同时突变会使原本两侧对称的
花 S的结构变为半辐射对称(Coen,1996;Luoetal.,
1996)。玉米中 *#基因有抑制侧枝生长和雄花形成
的功能，!#突变株具有显性表型，侧旁的初生茎成
倍增长并且末端产生穗状的雄花，而野生型的侧枝
带有停止发育的芽或是正在形成的雌花(Doebleyet
al., 1995; W ang et al., 1999; W hite and Doebley,
1998)。水稻中 PCF1，PCF2转录因子是促使分生组
织中 PCAN 启动子的组织特异性表达所必需的，以
产生 DNA 复制和修复机器所需的一个组件(Kosugi
andOhashi,1997;Kosugietal.,1995)。根据 TCP结
构域预测，拟南芥基因组编码了 24个 TCP转录因
子(KosugiandOhashi,2002)。我们克隆了该家族的
一个成员 $!%&’()#(的全长 ORF，并研究了该基因
的转录激活活性与组织表达特异性。
1材料与方法
1.1植物材料，菌株，质粒载体
哥伦比亚野生型拟南芥（ *+,-./01-1 !2,3-,4,）
植株，为本实验室保存；酿酒酵母 EGY48(M AT!,
his3 trp1 ura3-25 leu::pleu2-lexAop6)，质粒 pG221，
pYF503为薛红卫研究员惠赠。
1.2拟南芥总 RNA 的提取
使用 QIAGEN RNeasyPlantM iniKit提取拟南
芥成体植株的总 RNA，方法参照 QIAGEN 公司产
品使用手册。
1.3目标基因的克隆
使用 Invitrogen公司的 SuperscriptFirst-strand
cDNA SynthesisSystem forRT-PCR 试剂盒，将拟南
芥总 RNA 反转录生成第一链 cDNA，方法参照 In-
vitrogen公司产品使用手册。并以此 cDNA 为模板，
使用引物 forward primer: 5’-GCGGAATTCATG-
GAGGTTGACGAAGACATTG-3’，reverseprimer:5’-
GCGGTCGACTCATCTCCTTTCCTTTGCCTTGT-
CA-3’进行 PCR 扩增，反应条件为 94!预变性 2
min，随之 94 30s，58# 30s，72$ 1min，循环 30
次，最后 72%延伸 5m in。PCR 产物经回收纯化后，
酶切并连接到质粒 pYF503中，送华诺公司测序。
1.4氨基酸序列推演与同源性比较
根据所克隆 ORF序列推演其可能的氨基酸序
列，使用 clustalx软件对该氨基酸序列与来自不同
物种带有 TCP保守区的蛋白进行同源性比较。
1.5RT-PCR
分别提取拟南芥根、茎、莲座叶、茎出叶、花及
果荚等不同组织的总 RNA，反转录合成第一链 cD-
NA，PCR 反应同上，同时设拟南芥 ubiquitin为对
照。
1.6酵母单杂交转录激活活性分析
实验采用改进的用于鉴定转录因子转录激活
活性的酵母单杂交体系（ Yeetal.,2004）。将含有
pG221质粒的酵母菌株 EGY48接进 50m lSC-ura
培养基中，30&，250r/min培养 16~18h，至平台期
（ OD600>1.5）。1:10转接使得终 OD600=0.2~0.3。30’，
230r/m in培养 3h，使得终 OD600=0.4~0.6。取菌液
50ml室温 2 890r/m in 离心 5min；弃上清，30m l
ddH2O 重悬，室温 2890r/min离心 5m in，弃上清，加
入 1.5ml预冷的 1!TE/LiAc重悬制得酵母感受态
细胞。将 0.1g待转化质粒及 0.1ml酵母感受态细
胞混匀；加入 0.6mlPEG/LiAc溶液，200r/min，30(
培养 30m in，加入 70#lDM SO，轻轻颠倒混匀；42)
热激 15s,冰上放置 1~2m in；14000r/min离心 5s，弃
上清，加入 0.5ml1!TE溶液重悬，取 100$l涂在
SC-Trp培养基上 30*培养 2~3d。将长出的酵母菌
落在 SC-Trp!X-gal显色平板上划线，30+培养过
夜，观察显色情况。
2实验结果
2.1*!#&5()#( ORF序列的克隆
根据 GenBank上预测的 *!#&5()#( ORF序列
设计两端引物，使用 PCR 方法扩增出 975bp大小的
片断，测序结果表明该片断序列与 GenBank所预测
的 ORF序列完全一致，该序列编码 1条含有 324个
氨基酸残基，分子量约为 36kD 的蛋白（ 图 1）。
2.2At1g30210所含 TCP保守结构域分析
序列同源性分析表明，At1g30210蛋白含有植物
TCP家族特征保守结构域，在该结构域中与几种带有
TCP保守区的典型蛋白具有较高的同源性（ 图 2）。
2.3At1g30210转录激活功能的鉴定
将表达 GAL4结合结构域与 At1g30210的融
合蛋白的质粒转入酵母中，能够使 GAL4顺式序列
调控下的报告基因 6,78得到表达，形成蓝色菌落
（ 图 3）。证明 At1g30210蛋白在酵母中具有转录激
活活性。
拟南芥花组织高表达 TCP家族转录因子 *!%&5()%(的克隆与转录激活活性鉴定
CloningandTransactivationIdentificationof*!%&5()%(,aNew M emberofTCP familyHighExpressed
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分子植物育种
M olecularPlantBreeding
图 1!#$%&’#& ORF序列及推测的编码蛋白序列
Figure1Nucleotideandinferredaminoacidsequencesof!#$%&’#& ORF
2.4RT-PCR 扩增结果
使用 !#$%&’#& ORF特异引物，分别以拟南芥
根、茎、莲座叶、茎出叶、花及果荚 6种不同组织作
为模板进行 PCR 扩增。电泳分析结果表明，该基因
在花组织中表达量明显高于其它组织，在茎和茎出
叶组织中表达量相对较少（ 图 4）。
3讨论
!#$%&’#&编码一条含有 324个氨基酸残基的
蛋白，该蛋白具有高度保守的 TCP结构域，并在酵
母体内表现出较强的转录激活功能，很有可能是拟
南芥 TCP家族中具有功能性的转录因子。
已报道的 TCP家族转录因子功能大多与细胞
增殖有关，如参与花瓣，雄蕊，侧芽的形态发生。
!#$%&’#& 基因在花组织中具有相对较高的表达
量，有可能具有相似的生理功能。
!#$%&’#&的克隆与转录激活活性研究为下一
步的功能研究提供了基础。一方面，我们将根据与
TCP结构域作用的 DNA 序列寻找 !#$%&’#&激活
的下游靶基因，确定转录因子的调控途径；另一方
面，我们将研究 !#$%&’#&基因缺失突变体和过表
达植株与野生型拟南芥在形态上是否存在显著差
异，特别是在该基因高表达的花组织的形态方面是
否受到 !#$%&’#&基因表达的影响。我们实验室近
年来已克隆了包括 !#$%&’#&在内的 19个拟南芥
TCP家族转录因子（ Gong etal.,2004;梅文倩等,
2004），这些工作对于研究植物 TCP家族转录因子
的生理功能提供了有力的帮助。
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图 2At1g30210编码蛋白的保守结构域同源性比对分析
注：CYC 蛋白来自于金鱼草，TB1蛋白来自于玉米，PCF5蛋白来自于水稻。黑色表示相似度为 100!，深灰色表示相似度!
75，浅灰色表示相似度!50#。
Figure2AlignmentofAt1g30210encodingproteinwithseveraltypicalproteinscontainingTCP conservedomain
Note:CYC from Antirrhinum,TB1 from maize,and PCF5 from rice.Dark showssimilarityis100$,dark grey showssimilarity!
75%,lightgreyshowssimilarity!50&.
图 3酵母单杂交实验验证 At1g30210的转录激活活性
注：分别将图中所示的基因克隆到 pYF503中（ GAL4AD 为 GAL4激活结构域，Noinsertion表示无基因克隆到 pYF503中），
转入酵母中可表达 N 段带有 GAL4DNA 结合结构域的融合蛋白。
Figure3Yeastone-hybridassayfortranscriptionactivationpropertyofAt1g30210
Note:Clonethegenesshowed in themap into pYF503 (GAL4 AD:activationdomainofGAL4,No insertion:No genecloned into
pYF503)respectively,andtransform theyeastcellstoexpressfusedpeptidescontainingGAL4DNA bindingdomaininN terminus.
拟南芥花组织高表达 TCP家族转录因子 !#$%&’#&的克隆与转录激活活性鉴定
CloningandTransactivationIdentificationof!#$%&’#&,aNew M emberofTCP familyHighExpressed
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致谢
本研究由国家自然科学基金委员会重大国际
合作项目（ 30221120261）资助。
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图 4-*./01231在拟南芥各组织中的 RT-PCR 实验
注：从不同组织中分离总 RNA，定量后经反转录合成第一链
cDNA,PCR 扩增 30个循环后用 1.2!琼脂糖凝胶电泳检测。
Figure 4 RT-PCR assay forexpression levelof-*./415.1 in
several-#$%&’()%) tissues
Note:TotalRNA were separated from differenttissuesand re-
verse transcribed into the first-strand cDNA respectively.The
PCR products after 30 cycles amplifying were separated by
1.2% agarosegelelectrophoresis
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通讯作者简介
苏力坦·阿巴白克力（ 1958年出生），男，新疆大学生命科
学与技术学院副院长，副教授，硕士生导师。研究方向为植物
生物化学。Email:sultan816@ 163.com
分子植物育种
M olecularPlantBreeding30