全 文 ：多肽信号分子参与了细胞生长、发育、免疫和
再生等多个过程[1~5]。迄今为止, 在植物中已发现
多种多肽信号分子, 如系统素(systemin)、植物磺
化激动素(plant sulfonated kinetin, PSF)、快速碱化
因子(rapid alkalinization factor, RALF)、早期结瘤
蛋白 (ENOD40)、多肽配基 CLAVATA3 (CLV3)、S
拟南芥信号肽 AtRALF1的表达、纯化及活性分析
李 斌1, 张小波1, 于 峰2, 李 兰2, 李秀山2*, 杜长青2, 肖浪涛1, 刘选明2
(1. 湖南农业大学 生物科学技术学院，中国湖南 长沙 410128；2. 湖南大学 生物学院，中国湖南 长沙 410082)
摘 要: 利用 RT-PCR 扩增获得拟南芥 AtRALF1 基因的全长 cDNA 序列, 将其构建入携带 His 标签的原核表
达载体 pET28b 中, 获得重组表达载体 pET28b-AtRALF1, 并将其转入到大肠杆菌 BL21 (DE3)中。 随后在不同
的 IPTG 浓度、 温度和诱导时间条件下, 进行 AtRALF1 蛋白的表达研究, 建立了 AtRALF1 融合蛋白的高效表
达体系。 结果表明, 在 30℃、1 mmol/L IPTG 的条件下诱导 4 h, AtRALF1 融合蛋白的表达量最大。 进一步用获
得的 AtRALF1 融合蛋白处理苗龄 5 d 的野生型拟南芥(Col-0)植株, 发现其根的生长受到了抑制, 表明我们获
得了具有活性的 AtRALF1 小肽, 为进一步研究该小肽奠定了基础。
关键词: 拟南芥; 信号肽; 快速碱化因子(RALF);原核表达; 蛋白质纯化; 活性检测
中图分类号： Q945.3 文献标识码：A 文章编号：1007-7847(2016)04-0320-05
Expression, Purification and Activity Analysis of Signaling Peptide
AtRALF1 in Arabidopsis thaliana
LI Bin1, ZHANG Xiao-bo1, YU Feng2, LI Lan2, LI Xiu-shan2*, DU Chang-qing2,
XIAO Lang-tao1, LIU Xuan-ming2
(1. College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, Hunan, China; 2. College of
Biology, Hunan University, Changsha 410082, Hunan, China)
Abstract: The full-length cDNA sequence of AtRALF1 was amplified from Arabidopsis thaliana by RT-
PCR. The verified sequence of AtRALF1 was inserted into the corresponding region of pET28b vector to
construct the recombinant plasmid pET28b-AtRALF1. The plasmid pET28b-AtRALF1 was then introduced
into the bacterial host E.coli BL21 (DE3) to analyze the expression of AtRALF1. Through the analysis of dif－
ferent concentration of IPTG, temperature and time course, the expression conditions were optimized, and
30 ℃ for 4 h with 1 mmol/L IPTG induction was found to be the optimal condition for prokaryotic expres－
sion. The AtRALF1 protein was then purified for further research. When the purified AtRALF1 protein was
added to 5-day-old seedlings (Col-0), the growth of the seedling root was obviously inhibited in Arabidop－
sis thaliana. It is suggested that the recombinant AtRALF1 protein has the inhibition activity of signaling
peptides, which can be used for further study.
Key words: Arabidopsis; signaling peptides; rapid alkalinization factor (RALF); prokaryotic expression; pro－
tein purification; activity identification
（Life Science Research，2016，20（4）：320～324）
收稿日期: 2015-11-09; 修回日期: 2015-12-24
基金项目: 湖南大学中央高校专项基金(531107040814)
作者简介: 李斌 (1990-), 男, 湖南新宁人, 硕士研究生, 主要从事植物生理发育学研究; 李斌和张小波对本文的贡献相同, 为本文共同第
一作者; *通讯作者: 李秀山 (1979-), 男, 湖南郴州人, 湖南大学生物学院工程师, 博士, 主要从事植物分子生物学及遗传学研究, Tel:
0731-88821595, E-mail: 290048903@qq.com。
第 20 卷 第 4 期 生命科学研究 Vol．20 No．4
2016 年 8 月 Life Science Research Aug. 2016
DOI：10.16605/j.cnki.1007-7847.2016.04.007
第 4 期 李 斌等：拟南芥信号肽 AtRALF1的表达、纯化及活性分析
位点富含半胱氨酸蛋白(SCR)等[6~9]。它们与植物中
非蛋白质类的信号分子(生长素、赤霉素、细胞分
裂素、乙烯、脱落酸、芸薹素、茉莉酸等)共同形成
信号网络, 调节植物的生长发育[10, 11]。
RALF 小肽是一种相对分子质量约为 5 kD
的分泌信号分子, 首先由 Pearce等[12]从烟草叶片
中分离出来。RALF属于多基因家族, 拟南芥中含
有 37种 RALF亚型(AtRALFs)[13]。RALF可抑制质
膜上质子泵的活性, 从而阻碍 H+从胞内运输至胞
外, 导致培养基 pH升高[14]。在拟南芥根细胞中发
现 RALF和第二信使 Ca2+也有关联, AtRALF能激
发大量的 Ca2+信号反应[15]。由于拟南芥中小肽含
量少, 且不易获得比较纯的 RALF 小肽, 所以本
研究致力于利用原核表达系统体外表达拟南芥
RALF的重组蛋白。
本研究拟从拟南芥中提取植物总 RNA, 利用
简并性引物和 RT-PCR方法克隆 AtRALF1基因
并构建入原核表达载体 pET28b, 转化大肠杆菌
BL21 (DE3)后, 对其诱导条件进行优化, 建立 At-
RALF1的高效表达及纯化系统, 以期为后续拟南
芥中 AtRALF1生理生化功能的研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 实验材料
拟南芥(Arabidopsis thaliana)野生型种子由湖
南大学生物学院李秀山老师提供。大肠杆菌
Top10和 BL21由本实验室保存。Ni-NTA Agarose
亲和树脂、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、卡
那霉素以及氨苄青霉素均购自生工生物工程上海
(股份)有限公司。T4连接酶、高保真 GXL酶等相
关试剂均购自上海赛默生物科技发展有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 工程菌的获得
取 2~5 片拟南芥叶片 , 在液氮中研磨成粉
末，用 Trizol试剂盒(美国 Invitrogen 公司)提取总
RNA, 然后用 RT-PCR试剂盒(日本 TaKaRa公司)
逆转录获得相应的 cDNA。从 TAIR网上查询 At-
RALF1 (At1g02900)基因的保守区域, 利用 Primer
Premier 5.0 软件对 AtRALF1 序列中保守性 CDS
序列进行引物设计 , 其简并性引物序列分别为
AtRALF1-F (5′-TCCATGGCGACCACCAAATAC-
ATTAGCTATCAGTCTTTGAAACGTAACAGTGTG-
CCGTGTTACCGCCGCGGTGCGTCTT-3′)和 AtRA-
LF1-R (5′-TTGCTCGTTGCCGCAGTTAAAAGCT－
TAT-3′), 其中下划线为简并性更改的碱基。引物
由生工生物工程上海(股份)有限公司合成。PCR
反应后的胶回收产物用 Xho I 与 Nde I 双酶切,
并与同样双酶切后的 pET28b 载体用 T4 连接酶
连接过夜。连接产物转化入大肠杆菌 Top10感受
态细胞中, 通过 100 mg/L卡那霉素筛选得到阳性
克隆菌, 以引物 AtRALF1-F与 AtRALF1-R做菌
落 PCR鉴定后, 提取质粒进行酶切鉴定。测序正
确的重组质粒命名为 pET28b-AtRALF1。
1.2.2 AtRALF1重组蛋白的诱导
将空白质粒 pET28b与 pET28b-AtRALF1分
别转入大肠杆菌 BL21 (DE3), 涂布于含 100 mg/L
卡那霉素的 LB固体筛选培养基上, 培养 12 h后,
挑取单菌落接种于 5 mL含 100 mg/L卡那霉素的
LB液体培养基中 37 ℃活化 10 h。将活化的菌液
按 1︰200的比例接种于 100 mL 含 100 mg/L 卡
那霉素的液体 LB培养基中, 37 ℃培养 2 h左右
至 OD600=0.7, 得到 OD600=0.7的菌液。在不同的温
度下诱导(28 ℃、30 ℃、34 ℃、37 ℃), 加入不同浓度
的 IPTG (0.5 mmol/L、1 mmol/L、1.5 mmol/L、2 mmol/L)，
诱导不同的时间(2 h、4 h、6 h、8 h)后各取 1.5 mL
于 EP管中 10 000 r/min离心收集菌体, 去上清后
依次加入 30 μL 10 mmol/L的 PBS、10 μL 4× SDS
上样缓冲液, 煮沸后室温 8 000 r/min离心 1 min,
收集上清液, 取 10 μL进行 15% SDS-PAGE凝胶
电泳, 100 V电压 6 h。取出凝胶, 考马斯亮蓝染色
观察。
1.2.3 His-AtRALF1蛋白的纯化及检测
选择最优诱导条件, 大量表达 His-AtRALF1
蛋白, 4 ℃下 8 000 r/min离心 5 min后去上清,得到
菌体。将菌体重悬于 10 mL裂解缓冲液(50 mmol/L
Tris-base, 300 mmol/L NaCl, 10 mmol/L 咪唑 , pH
8.0)中,依次加入 100 μL 100 mg/L的溶菌酶、10 μL
100 mmol/L PMSF、0.1% TritonX-100, 置于冰上
20 kHz超声破碎。4 ℃下 8 000 r/min离心 5 min,
收集上清, 0.45 μm过滤器过滤后加入 1 mL Ni-
NTA Agarose, 4 ℃孵育 6 h。 4 ℃下 800 r/min离心
1 min后去上清,加入 4 mL清洗缓冲液(50 mmol/L
Tris-base, 300 mmol/L NaCl, 20 mmol/L咪唑, pH 8.0),
4 ℃下孵育 10 min, 重复清洗 3次后去上清。加入
5 mL洗脱缓冲液 (50 mmol/L Tris-base, 300 mmol/L
NaCl, 50 mmol/L、150 mmol/L、250 mmol/L 咪唑 ,
pH 8.0), 4 ℃孵育 1 h。4 ℃下 800 r/min离心 2 min,
收集上清, 即所得 AtRALF1蛋白。取少量纯化重
321
生 命 科 学 研 究 2016 年
图 2 pET28b-AtRALF1 重组质粒的 Xho I 和 Nde I 双
酶切鉴定
M：DNA marker；1、2：pET28b-AtRALF1 的 Xho I 和 Nde I
双酶切。
Fig.2 Double digestion of pET28b-AtRALF1 recombi－
nant plasmid with restriction enzymes Xho I and Nde I
M: DNA marker; 1 and 2: Double digestion of pET28b-At-
RALF1 with restriction enzymes Xho I and Nde I.
图 1 AtRALF1 cDNA序列的 PCR扩增
M：DNA marker 3；1、2： AtRALF1 的 cDNA；3：引物二聚体
(阴性对照)。
Fig.1 PCR amplification of AtRALF1 cDNA
M: DNA marker 3; 1 and 2: cDNA of AtRALF1; 3: Primer
dimer (negative control).
组蛋白, 15% SDS-PAGE 凝胶电泳, 考马斯亮蓝
染色观察。
为了进一步验证 His-AtRALF1, 取一定量的
纯化目的蛋白进行 SDS-PAGE凝胶电泳后, 利用
JUNYI-SCZ2半干转膜仪(北京君意东方电泳设备
有限公司) 将电泳后的分离胶上的蛋白质转移到
PVDF膜上。5.0 %的脱脂奶粉封闭 2 h,加入 2 000
倍稀释的鼠源 His一抗, 4 ℃孵育过夜, TBST 洗
涤 3次, 每次 5 min。加入 4 000倍稀释的辣根过
氧化物酶标记的鼠源二抗, 温室孵育 2 h后 TBST
洗 3次, 每次 5 min。在 PVDF上加入发光显色液
100 μL (A、B液各 50 μL，混匀), 进行显色观察。
1.2.4 AtRALF1的生物活性检测
野生型 Col-0 的拟南芥种子春化后点种到
MS固体培养基上, 长日照 22 ℃条件下培养 5 d。
然后将拟南芥幼苗分别等量移栽到 MS 板和含
1 μmol/L His-AtRALF1的 MS板上,继续培养 2 d,
观察比较拟南芥根长。
2 结果与分析
2.1 AtRALF1原核表达载体的构建及工程菌的
获得
以拟南芥的 cDNA 为模板 , 利用引物 At-
RALF1-F、AtRALF1-R 扩增得到大小为 160 bp
左右的特异性条带(图 1)。将该克隆片段用 Xho I
和 Nde I 双酶切后连接入同样经 Xho I 和 Nde I
双酶切的 pET28b载体, 转化大肠杆菌。挑取转化
的阳性克隆, 抽提质粒后用 Xho I 和 Nde I 进行
双酶切分析, 结果表明重组质粒含有目的片段(图
2), 且插入片段为 160 bp左右, 说明已经成功获
得了含有重组质粒 pET28b-AtRALF1的工程菌。
将菌液送测序进一步验证, 测序结果匹配。
2.2 His-AtRALF1蛋白原核表达条件优化
为了更高效地得到 pET28b-AtRALF1 表达
的 His-AtRALF1 蛋白, 对其表达条件进行了优
化。考虑到 IPTG对工程菌具有一定毒害性, 初选
1 mmol/L IPTG浓度, 在 30 ℃，分别诱导 2 h、4 h、
6 h、8 h, SDS-PAGE凝胶电泳结果表明, 诱导 2 h
后开始出现目的蛋白富集, 在 4 h时达到比较高
的浓度(图 3A)。随后本研究比较不同浓度的 IPTG
诱导的产量变化, 结果发现在 1 mmol/L 的 IPTG
浓度下诱导产量比较高(图 3B)。
尽管大肠杆菌的最适生长温度是 37 ℃, 但
低温诱导有利于体外表达重组蛋白的可溶性, 因
此本研究也考虑了温度对诱导重组蛋白的影响。
结果表明在 30 ℃下, 1 mmol/L IPTG 诱导 4 h为
图 3 原核表达条件的优化结果
(A)诱导时间的优化。 M：蛋白 marker；1~5：30 ℃、1 mmol/L
IPTG 下分别诱导 0 h、2 h、4 h、6 h、8 h。 (B) IPTG 浓度的优
化。 M：蛋白 marker；1~5：分别在 0 mmol/L、0.5 mmol/L、
1 mmol/L、1.5 mmol/L、2 mmol/L IPTG浓度下 30℃诱导 4 h。
Fig.3 Results of prokaryotic expression optimization
(A) Optimization of induction time. M: Protein marker; 1~5: 0 h,
2 h, 4 h, 6 h and 8 h, respectively, under 30 ℃ with 1 mmol/L
IPTG. (B) Optimization of IPTG concentration. M: Protein
marker; 1~5: 0 mmol/L, 0.5 mmol/L, 1 mmol/L, 1.5 mmol/L and
2 mmol/L of IPTG, respectively, under 30 ℃ for 4 h.
M 1 2bp
4 000
1 200
200
M 1 2 3bp
4 000
1 200
200
M 1kD 2 3 4 5 M 1kD 2 3 4 5
75
15
10
75
15
10
(A) (B)
322
第 4 期
最优诱导条件。
2.3 His-AtRALF蛋白可溶性分析及纯化
为了确定目的蛋白的表达形式 , 利用 Ex－
PASy的 ProtScale程序分析 AtRALF的编码序列,
结果显示, 该蛋白质含有 14种氨基酸, 其中非极
性氨基酸占 22.45%, 酸性氨基酸占 18.37%, 非解
离的极性氨基酸占 59.18% (表 1)。采取上述最优
条件诱导, 诱导后收集菌液进行超声破碎、离心,
分上清和包涵体两部分 SDS-PAGE凝胶电泳, 考
马斯亮蓝染色观察。结果表明, 绝大部分目的蛋
白存在于上清液，仅有少部分存在于包涵体中。
蛋白质纯化过程中 , 将上清与 Ni-NTA A－
garose 亲和树脂结合, 再用 20 mmol/L 咪唑洗涤
缓冲液洗去非特异性结合杂蛋白, 最后分别用不
同浓度咪唑洗脱缓冲液(50 mmol/L、150 mmol/L、
250 mmol/L)洗脱目的蛋白。取少量纯化蛋白进行
SDS-PAGE凝胶电泳, 结果显示纯化的蛋白质浓
度高达 95%以上,同时相对分子质量大小在 11 kD
左右, 与预期结果保持一致(图 4)。
2.4 His-AtRALF1蛋白的Western-blot验证
为了进一步验证纯化所得蛋白质是否为目的
蛋白, 将目的蛋白进行 SDS-PAGE凝胶电泳, 用
HRP 标记的 His 抗体进行 Western-blot 检测。
Western-blot结果表明, 纯化前、后的目的蛋白均
在 11 kD左右出现特异性目的条带(图 5), 说明纯
化所得目的蛋白确实为 His-AtRALF1蛋白。
2.5 His-AtRALF1重组蛋白的活性分析
多肽信号分子 RALF具有一定的生物活性,
为了验证纯化所得 His-AtRALF1的生物学活性,
本研究将纯化所得的 His-AtRALF1 蛋白添加到
培养 5 d后野生型拟南芥(Col-0)的 MS培养基中,
并以不加 His-AtRALF1 的 MS 培养基作为空白
对照。通过比较两组拟南芥的根长发现, 培养 2 d
以后, 1 μmol/L的 His-AtRALF1能明显抑制拟南
表 1 AtRALF1蛋白的氨基酸组成
Table 1 Amino acid composition of the AtRALF1 protein
Amino acid
Ala(A)
Arg(R)
Asn(N)
Asp(D)
Cys(C)
Gln(Q)
Glu(E)
Gly(G)
Number
5
6
4
0
4
3
0
3
Proportion/(%)
10.2
12.2
8.2
0
8.2
6.1
0
6.1
Amino acid
His(H)
Ile(I)
Leu(L)
Lys(K)
Met(M)
Phe(F)
Pro(P)
Ser(S)
Number
0
2
1
3
0
0
2
8
Proportion/(%)
0
4.1
2.0
6.1
0
0
4.1
16.3
Amino acid
Thr(T)
Trp(W)
Tyr(Y)
Val(V)
Pyl(O)
Sec(U)
Number
2
0
5
1
0
0
Proportion/(%)
4.1
0
10.2
2.0
0
0
图 4 His-AtRALF1蛋白的纯化
M：蛋白 marker；1~3：分别用浓度为 50 mmol/L、150 mmol/L、
250 mmol/L 咪唑洗脱缓冲液洗脱。
Fig.4 Purification of His-AtRALF1 protein
M: Protein marker; 1~3: Elution with 50 mmol/L, 150 mmol/L
and 250 mmol/L of imidazole elution buffer, respectively.
图 5 His-AtRALF1蛋白的Western-blot鉴定
1：诱导后提取的总蛋白 (阳性对照 )；2：纯化后的 His-At-
RALF1 蛋白。
Fig.5 Identification of His-AtRALF1 protein by West－
ern-blot
1: Total protein (positive control); 2: Purified protein of His-
AtRALF1.
图 6 His-AtRALF1的活性检测
1： 正常 MS 培养 5 d、7 d 的植物； 2： 正常 MS 培养至 5 d
后，加入 His-AtRALF1 培养到 7 d 的植物。
Fig.6 Activity analysis of His-AtRALF1
1: Cultivated on normal MS on day 5 and day 7; 2: Cultivat-
ed on normal MS on day 5, and then added with His-AtRALF1
till day 7.
MkD 1 2 3
75
15
10
1 2
5 d
7 d
1 2 kD
15
10
李 斌等：拟南芥信号肽 AtRALF1的表达、纯化及活性分析 323
生 命 科 学 研 究 2016 年
芥根的生长(图 6)。
3 讨论
分离纯化基因工程重组蛋白是研究基因功
能、蛋白质结构、抗体制备、育苗的基础。大肠杆
菌是一种生长快、可快速表达外源蛋白的宿主菌,
便于大量获得重组蛋白[16, 17]。考虑到真核生物与
大肠杆菌密码子的差异, 研究中使用简并性引物
构建了基于 pET28b载体的 AtRALF1高效表达系
统。研究表明 IPTG浓度、温度、诱导时间对 His-
AtRALF1蛋白的表达量有较大的影响。0.5 mmol/L
的 IPTG即可诱导目的蛋白表达, 而基于 IPTG对
菌体有一定的毒性, 在诱导蛋白质表达时不能高
于 5 mmol/L[18],本实验通过不同梯度比较得到最经
济有效的 IPTG浓度为 1 mmol/L。蛋白质诱导表达
后会存在降解现象, 所以诱导时间不宜太长, 本研
究发现诱导 6 h与 4 h无明显的蛋白质表达差异。
外源基因在大肠杆菌中的高通量表达大多存
在于难溶包涵体中。本研究中首先采用了 37 ℃诱
导蛋白质表达, 检测到 AtRALF1蛋白在上清中的
表达量极少, 大部分表达在包涵体中。基于尿素
溶解包涵体使其变性的弊端[17], 而低温诱导有益于
原核表达蛋白质的可溶性, 通过对诱导温度进行
考察, 研究中选择用 30 ℃来诱导蛋白质表达, 配
合 0.1%TritonX-100 这种温和的去污剂, 使蛋白
质从膜结构上解离下来, 从一定程度上对纯化出
来的蛋白质活性进行保护。为了进一步测定这个
蛋白质的活性, 用纯化得到的 His-AtRALF1对野
生型的拟南芥幼苗进行处理, 发现处理后的幼苗
根长受到了抑制。而将处理过的植物移种于不加
His-AtRALF1 蛋白的 MS 培养基培养一段时间
后, 这个被抑制的表型又会恢复, 表明纯化得到
的 His-AtRALF1重组蛋白具有信号多肽活性, 可
用于拟南芥中 AtRALF1的后续研究。
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