全 文 ：oJ
u nr a l of 尹al n t 月妙5 10 抽蔚 , a n d 乃劲 le e u扮 刀动劫吸护 2 00 7 , 3 (3) : 22 7一 2 34 22 7
A C a lc itn
·
d eP e n d e n t P r o t e i n 儿 n a s e I s I n v o lv e d i n lP a n t H o r m o n e S i g n a l
rT
a n s d u c t i o n i n A ar b记op s is
Y U A N x in ” , D E N G K e 一Q in ”
,
Z H A O X i a o
一
iY
n g ’
,
W U x i a n
一
J i n Z
,
Q IN uY
一
z h i ’
,
TA N G D
o n g
一
iY n g
’ ,
L lJ X
u a n
一
M i
n g l
` ’
, B io e n e卿 a n J 召i o m a r e r i a z尺 e s e a cr h ce n r e o nI s r i r u r e of 乙lfe s e ie n e e a n J B i o r e c人n o zo邪 万 u n a n 山 i v e sr i仅 c人a n g s入a 李2 0 0 5 2 , 。 sn a ; “ D印 a r mt e n t
of B i
o t e e h n o lo gy
,
OC ll
e g e of H
“ a ih u a , H u a i h u a 4 1 8 0 0 0 . C h in a
A b s t r a e t : A n u m b e r o f s i g n a l P a ht w a y s h a v e b e e n fo u
n d
t h r o u g h w h i e h ab u
n d a n t e a l e i u m
一
s t im u l at e d P r o t e i n k i
-
n a s e ac t i v i t y i n P l a n t 15 a s s o e i a t e d w i t h c a l c iu m
一
d e P e n
-
d e n t P r o te i n ik n a s e s ( C D P K s ) w h i c h ac t a s t h e e a l e i u m
s e n s o r s m e d i a t i n g n u m e r o u s r e s P o n s e s
,
i n e l u d i n g h o r
-
m o n e s i g n a li n g
.
B a s i n g o n P r e v i o u s s t u d i e s
,
w e m a d e
a d d i t i o n a l fu
n c t i o n a l a n a l y s i s o f t h e g e n e A tC P 3K O
e n -
e o d i n g a P r o t e i n ik n a s e i n A ar b i zi口P s i s
.
R e s u l t s o f s e m i
-
q u a n t i t at iV e r e v e r s e t r a n s e ir p t i o n p C R ( R-T p C R ) a n a l y
-
5 15 i n d i e a t e d t h a t A t C P 3K O w
a s hi g h l y e x Per s s e d i n r o o t
a n d i n d u e e d b y A B A
,
I A A
,
2
,
4
一
D
,
G A 3 an d 6
一
B A etr
a t
-
m e n t
.
T h e Ph y s i o l o g i e a l r o l e s o f A tC P K 3 0 w e r e s t u d ie d
u s in g a g a in
一 o -f fu n e t i o
n
ap Por a e h
.
S e e d l i n g s o f A t C P K了O
tr an s g e in e l i n e s h a d l o n g e r Pir m a yr or o t s th an ht o s e P lan t s
o f w i l d
一
ty P e a t th e e ar ly s t a g e s
.
In t e r e s t i n g ly
,
w h e n t h e s e
p l a n t s g r e w o n M S l a e k o f C a Z
+
i n c l u d i n g w i l d
一
ty p e a n d
tar
n s g e n i e l i n e s
,
ht e or o t s o f tr a n s g e n i e l i n e w e er m o er
s e n s i t i v e to e a le i u m
,
la c k o f C a Z
+
h a d le s s e fe
e t o n r o o t s
o f t r an
s g e n ic l i n e s th a n th o s e o f W i ld
一
t y P e
.
rT
e a t e d w i t h
s e v e ar l P lan t h
o r m o n e s
, s u c h a s A B A
,
IA A
,
G A 3 an d 6
-
B A
,
t h e r o o t s o f s e e d li n g s o f t r a n s g e n i e l i n e d e v e l o P e d
a b n o r m a l l y b e c a u s e t h e y w e r e m o r e s e n s i t i v e t o
h o mr
o n e s
.
F u r t h e r m o r e
,
N PA
r e l a t i v e l y l e s s i n h ib i t e d
e m e gr
e n c y o f l a t e r a l r o o t s o f t r a n s g e n i e l i n e t h a n t h o s e
o f ht e w ild
一
ty P e
.
G er e n fl u o er s c e n t Por te i n
一
C P K 30 ( G FP
-
C P K 3 0 ) fu s i o n P r o te i n s tu d i e s r e v e a l e d t h e l o e a l i z a t i o n
o f A tC P K 3 0 t o b o t h e e l l w a l l a n d P l a s m a m e m b r a n e
.
T h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a t A tC P K 3 0 ac t s a s t h e c a l e i u m
s e n s o r a n d in v o l v e d i n th e h o mr
o n e 一 s i g n a l i n g Phat
w a y s
.
g ib b e er l l i n s
,
ab s e i s i c a e i d a n d e t h y le n e
,
P l a y fu n d a m e n
-
t a l r o l e s i n c o n t r o l l i n g P l a n t g r o w t h a n d d e v e l o P m e n t
,
fo r e x a m Pl e
,
i n d u e i n g e e l l d iv i s i o n
,
e e l l e l o n g a t i o n a n d
e e l l d ife
r e n ti a t i o n b y r e g u l a t i n g t h e t r a n s e r i P t i o n af
c -
to r s o r t h e e x P r e s s i o n o f s o m e g e n e s
.
T h e h o r m o n e r e
-
s P o n s e s ar e s P e c i if e i n P e cr e P t i o n
.
In s o m e e a s e s th e r e
-
s P o n s e s e v o k e a r i s e o f l e v e l o f c a l c i u m i o n fl u x e s
.
C a Z
+
a l s o a m P li if e s t h e s i g n a l t o s u s t a i n th e r e s P o n s e b e s id e s
m e d i a t i n g th e r e s P o n s e
.
5 0 i t 15 c o n e l u d e d t h a t e a l c i u m
15 i n v o l v e d i n h o mr
o n e s i g n a li n g P a t h w a y s
.
I t 15 w e ll k n o w n t h a t c a l e i u m 15 a u b i q u i t o u s s e e
-
o n d m e s s e n g e r i n e u k a yr o ti e s ig n a l tr an s d u c t i o n e a s e ad
e s
a n d th e e y t o s o li e fr e e v ar i a b l
e C a Z
+
fu n c t i o n s a s a n im
-
P o r t a n t i n t r a e e l l u l a r s i g n a l i n g m e e h a n i s m
.
N u m e r o u s
s tim u l i a fe
c t C a Z
+ c h a n n e l s l o c a t e d a t t h e p l a s m a m e m
-
b r a n e a n d o gr an e l lar m e m b r a n e s t o e l e v a t e t h e l e v e l s o f
C a Z
+
i n t h e e y t o s o l
,
w h i e h m a y s e r v e t o tr a n s d u e e m e s
-
s a g e s a n d a m P l i fy
s ig n a l s b y tr i g g e r i n g a n i n t r a c e l lu l a r
e a s c a d e o f b i o e h e m i e a l P r o c e s s e s
.
eT m P
o r a l a n d s P a t i a l
c h a n g e s i n C a Z
+ e o n c e n t r a t i o n c a n e l i c i t a e a s e a d e o f
d o w n s t r e a m e v e n t s i n v o l v i n g C a Z
+ 一
b i n d i n g p r o t e i n s
,
w h i e h a e t i v a t e a s e q u e n e e o f r e a e t io n s l e a d i n g t o g e n e
a e t i v a t i o n in t h e n u c l e u s t o r e s P o n d t o e x t e r n a l s t im u li
.
C a le i u m
一
b i n d i n g P r o t e in s d e e o d e t h e i n fo r m a t i o n e o n
-
t a i n e d i n t h e t e m p o r a l a n d s p a t i a l P a t t e nr s o f t h e s e C a Z
+
s ig n a l s a n d i n i t i a te e h a n g e s i n m e t a b o l i s m a n d g e n e e x
-
P r e s s i o n (H a r r n o n e r a l
.
2 0 0 0 )
.
K e y w o r ds
: A ar b ido l
〕515 ; P or et in ik n a s e : h o mr
o n e : e a le i u m : or o t :
e x P er s s io n a n a l y s i s
P l a n t h o r m o n e s
, s u e h a s a u x i n s
, e y t o k i n i n s
,
R e e e i v e d 2 0 0 7
一
0 1
一
2 5
,
A e e e P t e d 2 0 0 7
一
0 4
一
0 8
.
T h i s w o r k w a s s u P P o r t e d b y H u n a n N a t u r a l S c i e n c e F o u n d a t io n ( N o
.
0 5 J J 3 0 0 3 8 ) a n d
“
9 8 5
”
H ig h e r E d u e a t i o n P r o m o t io n F u n d t o H u n a n
U n iv e r s i t y
.
* T h e s e a u th o r s e o n t r ib u te d e q u a l ly t o t h i s r e P o r t
-
* * C o r r e s P o n d in g a u th o r ( E
一
m a i l : s w _ x m l @ h n u
.
c n : T e l : 8 6
一
7 3 1
-
8 8 2 17 2 1)
2 28 J P la
n t P柳 s io l M 口 I B io l V 0 1. 3 3
T h e m aj
o r C a Z
+
s e n s o r y i n p l a n t s i n c l u d e c a lm o
-
d u l i n s ( C a M )
, c a l c i u m
一
d e P e n d e n t P r o t e i n k i n a s e s
( C D P K s )
,
a n d ht e r e c e n t l y d i s e o v e r e d e a le i n e u ir n B
一
like
Por et i n s (C B L s ) (儿m e t a l . 2 0 0 3 ) . R e s u l t s o f er c e n t s ut d -
i e s s u g g e s t t h a t C D p K s a r e im p o r t a n t s e n s o r s o f C a Z
+
fl u x i n r e s P o n s e t o s t r e s s e s i n P l a n t s
.
I t 15 n o w k n o w n
t h a t m o s t r e s P o n s e s t o e a l e i u m i o n fl u x a r e a s s o e i a t e d
w i t h C D P K s
,
w h i c h d i r e e t l y b i n d e a l c i u m i o n
, u n l ik e
c al c i u n订c a lm o d u li n 一 d e P e n d e n t Por t e i n ik n a s e s w ih e h ar e
d e P e n d e n t o n e al m o d u li n s ( C a M K s : R o b e rt s a n d H田刀 l o n
19 9 2 )
.
A e t i v i t i e s o f ht e fu
n e ti o n a l CD P K s m a y b e r e g u
-
lat e d a t b o ht tr a n s e ir P ti o n a l a n d P o s t tr a n s l a t i o n a l l e v e l s
,
a s w e l l a s o bj e e t i
v e s u b e e l l u lar
c o m P a rt m e n t a l i z a ti o n
,
e a l c i u m a n d l iP i d s e n s i t i v i t y
,
a n d s u b s t r a te r e e o g n i t i o n
(C h e n g e r a l
.
2 0 0 2 )
.
A t P er s e n t
, a l t h o u g h s tu d i e s o n e a l e i u m s e n s o r
一
a s
-
s o e i a t e d P r o t e i n Ph o s Ph o r y l a t i o n i n h i g h e r Pl a n t s h a v e
b e e n m a d e
,
i t 15 u n c le a r a b o u t t h e r e l a t i o n s h iP b e tw e e n
P l a n t h o r m o n e s a n d e a l c i u m
一
d e P e n d e n t P r o t e i n
Ph o s Ph o yr l
a t i o n
.
H e er
,
w e
aer g
o i n g t o Per s e n t t h e e v i
-
d e n e e ht a t A tC P K 3 0
,
a e al e i u m
一
d e pe
n d e n t P r o iet
n ik n a s e
,
15 i n v o l v e d i n P l a n t h o r m o n e s i g n a l t r a n s d u c ti o n i n
A ar b id op
s i s
.
In o r d e r t o u n d e r s t a n d b e t t e r th e fu n c ti o n
o f C P K 3 0
,
w e o v e r e x P r e s s e d th e C P幻0 i n w i l d 一 t y P e
A ar b id o l , 5 15 P l a n t s t h r o u g h t h e a e t i o n o f a e o n s t i t u ti v e
e a u l i fl o w e r m o s a i e v iur s 3 5 5 P r o m o t e r
.
1 M s t e ir a I S a n d M e ht o d s
1
.
1 B a c t e r i a l s t r a i n s
sE
e h e ir c h i a e o l i s t r a l n D H S以 w a s u s e d i n a l l D N A
er e o m b i n a n t tr a n s of mr
a it o n
.
A g or b
a c et ir u m ut m aef
e论 n s
s t r a i n G V 3 1 0 1 (of r fl o r a l d i P ) w a s u s e d of r g e n e r a t i o n
o f t r a n s g e n i e li n e s o f A ar b idO P
s i s
.
1
.
2 lP a n t m a t e r i a l s
C o l u m b i a e c o t y P e o f A ar b idol
, 5 15 (e o l
一
4 ) w a s t a k e n
a s t h e w i ld
一
ty P e
, a n d t h e P l a n t s o f t h e s a m
e o r i g i n b u t
aft
e r t r an s fo mr a it
o n o f o v e er x Per s s i o n o f A t C P 3K O w
e er
u s e d
.
F o r s e l e e t i o n o f t r a n s g e n i c P l a n t s
,
T o g e n e r a t i o n
s e e d s w e er P lan t
e d i n 50 11 an d
s P r a y e d w it h B a s t a a ft e r s
d a y s
.
1
.
3 O v e r e x P er s s i o n o f A t C P孟3 0 i n P l a n t s
T h e fu l l
一
l e n g t h C P 3K O
e D N A w a s r e l e a s e d fr o m
PG EM
一
T v e e t o r a n d s u b c l o n e d i n t o t h e PE G A D b i n ayr
v e e t o r u n d e r t h e e o n t r o l o f a e o n s t i t u t i v e e a u l i fl o w e r
m o s a i e v iur s 35 5 P r o m o t e r (R o g e r s e t a l
.
19 8 7 )
.
T h e n
,
t h e d e ir v e d e o n s tur e t w a s i n t r o d u c e d i n t o t h e C o l u m b i a
e c o t y P e o f A r a b id op
s i s b y A g or b a e t e r i u m
一
m e d i a t e d
i n if l t r a t i o n
.
P l a n t t r a n s fo mr
a t i o n e x P e ir m e n t s w e r e P e卜
fo r m e d a s d e s e r ib e d b y C l o u g h a n d B e n t ( 19 9 8 )
.
T h e
t r a n s fo r m a n t s w e r e s e l e c t e d u s i n g B a s t a ( 1 0 0 林g / m L ) .
F o yrt
一
if v e fe 币l e T I P lan t s w e er o b t ian e d in o n e s e er e n i n g
·
In T : g e n e r a it o n
,
22 o u t o f 4 5 毛 s e l if n g fa 而l i e s sh o w e d
t h e s e g er g a t i o n o f th r e e r e s i s t a n t a n d o n e s e n s i t i v e l in e s
fo
r B a s t a
.
In T 3 g e n e r a t i o n
,
7 o u t o f t h e 15 Pl a n t s i n t h i s
fa m i ly P
r o d u e e d th e s e e d s t h a t a l l g a v e r i s e t o B a s t a
s e e d l i n g s
.
oF
u r h o m o z y g o u s Plan t s fr o m ht e
s e l i n e s w e r e
s e l e e t e d fo r Ph e n o ty P i c a n d g e n e t ie e h a r a c t e ir z a ti o n
.
1
.
4 E x P r e s s i o n a n a ly s i s u s i n g s em i
一
q u a n it t i v e R -T
P C R
R-T P C R
a n a ly s i s w a s m a d e t o s t u d y C P灯 0 tr a n -
s e ir P it o n l e v e l s i n v丽 o u s t i s s u e s an d het s e e d l i n g s etr a t e d
w i t h d l f fe er n t h o r l l l o n e s
.
l b t a l R N A w a s i s o la t e d fr o m
s e e d l i n g s
, o r t h e i r r o o t s
,
s t e m s
,
l e a v e s
,
fl o w e r s
,
a n d 5 11
-
i q u e s u s i n g ht e irT
z o l er ag e n t
,
a n d er v e r s e l y t ar
n s e ir b e d
a c c o ul i n g t o ht e m an
u
acf ut er
r i n s utr
e t i o n s o f S u P e r s c ir P t
P r e
一 a m P li if e a t i o n S y s et m (P r o me g
a
,
M a d i s o n
,
iW
,
U SA )
.
R e v e r s e t r a n s e r iP ti o n w a s P e r fo r幻。 e d i n a t o t a l v o l u m e
o f 2 5 料L u s i n g Z 林9 o f t o t a l R N A a s t h e t e m Pl a t e , a n d
i n e u b a t e d a t 4 2
“
C fo r 6 0 inI n
.
R-T P C R w a s P e for mr
e d
u s i n g t h e P r i m e r
,
C尸娜OF (5 ’ 一 A T G G A A A I , G G A T G C -
T T G G A C T A I’-3 ’ ) a n d C P K了OR ( 5 ’ 一 T C C A G T G A G T G -
C G T C G T G T A G A I ’- 3’ ) , an d t h e a m Pl i if e d D N A P r o d u e ts
w e r e e o l l e e t e d a n d a n a ly z e d a ft e r th e s a m e n u m b e r o f
a m Pl iif e at i o n e y e le s ( 2 6 )
.
T h e A ar b i汉op s is ac ti n g e n e w a s
a m Pl i if e d u s i n g t h e A c t i n Z P ir me
r s
,
A e t ZF ( 5
’一
C A C T G
-
T G C C A A I
,
C T A C G A G G G -T 3
’
)
, a n d A e t ZR ( 5
’ 一
C A C A
-
A A C G A G G G C T G G A A C A A G
一
3
’
) t o q u a n t i fy t h
e r e l a
-
t i v e a r n o u n t s o f c D N A
.
1
.
5 R o o t g or w t h a s s a y
H o m o z y g o u s s e e d s a n d w i l d
一
t y P e s e e d s w e r e s t e r
-
i l i z e d w i t h b l e ac h
,
ir n s e d w i t h s t e ir l e w at e r 4 t im e s
,
an d
P r e t r e a t e d a t 4
“
C fo r 4 d a y s b e fo r e i n o c u l a t e o n M S
( 1
.
5% s u e or
s e ) me d i
u m
.
hT
o s e
me d i
a m o s t ly c o n t ia n d i -f
fe r e n t e o n e e n t r a t i o n s o f d i fe
r e n t h o rm o n e s
,
i n e l u d i n g
A B A
,
IA A
,
N PA (N
一
l
一
n a Ph t h y lPh t h a l a m i
e a e i d )
,
G A 〕
P l u s P a c o ( P a e o l o b u t r a z o l ) o r 6
一
B A
.
P a c o
, a n i n h i b i t o r
o f G A 3 b i o s y n t h e s i s
,
w a s u s e d t o b l o e k t h e a e t i o n o f
N o
.
3 Y U A N X in
e t a l
.
: P r o te i n 儿 n a s e a n d H o r m o n e S ig n a l rT a n s d u e t io n 2 29
e n d o g e n e t i c G A 3 o n s e e d l i n g d e v e l o Pm e n t
.
T h e r e a s o n
15 t h a t i t s e fe
e t w a s n o t a s o b v i o u s a s o t h e r Pl a n t h o r
-
m o n e s w h e n m e d ia o n ly c o n t a i n s G A 3 i n h o mr
o n e etr
a t
-
m e n t e x P e n m e n t s
·
T h e s e e d s w e r e t h e n P l a e e d o n a g a r P l a t e s w i t h o r
w i t h o u t v a r i o u s h o r m o n e s
,
a n d s t a e k e d v e r ti e a l l y i n a
g r o w t h b o x ( a t 2 3
“
C a n d u n d e r a 16
一
h l ig h t / 8
一
h d a r k
Ph o to P e r i o d )
.
T h e l e n g t h o f P r im ar y r o o t w a s m e a s u er d
fr o m r o o t t iP t o b a s e o f h y P o e o ty l s
·
1
.
6 L o c a l i z a t i o n o f G F P
·
A tC P K 3 0 fu s i o n Por t e i n
L o e a li z a t i o n o f A tC P K 3 0 P r o t e i n w a s et s et d b y t r a n
-
s i e n t e x P r e s s i o n o f a n A tC P K 3O fu s i o n P r o t e i n i n o n i o n
(A l li u m e eP
a ) e Pid e mr
a l e e l l s
.
T h e A tC P K 3 0 w a s e l o n e d
i n t o th e v e c t o r PE G A D
一
G F P ( g r e e n fl u o r e s e e n t P r o t e i n )
,
y i e l d i n g Pl a s而 d P E G A D 一 G F P 一 C P K 3 0 . In t h i s Pl a s而 d
e x Per s s i o n o f t h e A tC P K 3 0 fu
s i o n P r o te i n t r a n s e ir P t w a s
a l s o u n d e r t h e c o n t r o l o f t h e e a u l i fl o w e r m o s a i e v i r u s
3 5 5 P r o m o t e r
.
P l a s m i d PE G A D
一
G F P
一
C P K 3 0 w a s u s e d
fo
r t r a n s i e n t t r a n s fo mr
a t i o n o f o n i o n e P i d emr
a l c e l l s u s
-
i n g a g e n e g u n ( S e i e n t z
,
C h i n a )
.
D e t e e t i o n o f fl u o r e s
-
c e n e e w a s P e r fo rm e d 4 0 h a ft e r b o m b a r dm e n t u n d e r a
fl u o r e s e e n c e m i c r o s e o P e (D M I 4 0 0 0 L e i c a )
.
P l a s m o l y
-
5 15 o f o n i o n e Pid e r m i s e e l l s w a s i n d u e e d b y 1 m o l /L
S U C f O S e
.
2 R e s u l t S
2
.
1 E x P r e s s i o n o f A tC P孟3 0 i n r o o t
S h e e n ( 1 99 6 ) h a d id e n t i if e d a or l e o f t h e C P K 3O i n
a e t i v a t i n g c o ld
,
d r o u g h t a n d s a l t s tr e s s r e s P o n s e P a t h
-
w a y s i n a m a i z e P r o t o P l a s t s y s t e m
.
C P K 3 0 n o t a b l y m e
-
d i a t e d e o l d a n d s a l t s t r e s s s i g n a l i n g
.
B u t l i t t l e 15 k n o w n
a b o u t w h e er i t w o kr s m o s t ly i n v iv o a n d w h e t h e r C P K 30
er s P o n d s to P l a n t h o r m o n e o r n o t i n A ar b i J OI , 5 15
.
A s a s t e P to w a r d d i s s e c t i n g t h e fu
n e ti o n o f C P 3K O
i n A ar b id口P s i s , i t s e x P r e s s i o n P a t t e nr i n d i fe er n t t i s s u e s
w a s s u r v e y e d u s i n g s e m i
一
q u a n t i t a t i v e R -T P C R
.
I n
s u r P r i s e
,
t h e t r a n s e r iP t l e v e l o f C P沼 0 15 s ig n i if e a n t ly
h ig h i n r o o t
,
w hi le
,
t h o s e o f i n t h e o ht e r o gr
a n s w e r e l o w
(F i g
.
I A )
.
T h i s r e s u l t w a s c o n s i s t e n t w i t h th e M P S S e x
-
P r e s s i o n P r o if l e i n g e n e r a l
.
5 0 i t 15 l i k e ly t h a t C P K 3 0
Pl a y s a n im P o rt an t r o l e i n or o t d i fe
r e n t i a ti o n an d g r o w ht
,
a n d m o r e at te n ti o n w a s P a id t o i t i n t h i s s t u d y
.
In t e r e s t i n g ly
,
s o m e h o r m o n e s (i n e lu d i n g A B A
,
I A A
,
2
,
4
一
D
,
6
一
B A a n d G A 3 ) s ig n i if e a n t ly i n d u c e d t h e
e x Per s s i o n o f t h e C P心 0 g e n e (F i g . I B ) . T h e m R N A l e v -
e l s a PP e ar e d to e h a n g e w i t h tim e a ft e r v ar i o u s h o mr
o n e s
F i g
.
l E x Per s s i o n Pa t te nr s o f ht e A tC p K 3 0 g e n e a n d e o n s trU
c t io n o f o v e er x P r e s s io n v e c t o r
(A ) R下 p C R a n a l y s i s o f A tCP 幻 O t r an s e ir P t s i n d i fe er n t t i s s u e s o f A ar b id哪 7s is P lan t s · OT t a l R N A w a s i s o la t e d for m v ar i o u s o r g a n s ( r 0 0 t ,
s te m
,
l e a f
,
fl o w e
r
,
a n d s i l iq u e ) o f 3
一
w e e k
一o
ld w i ld
一 ty Pe P la n t s g r o w n u n d e r lo n g
一
d a y e o n d it io n s
.
(B ) A c e u m u l a t io n o f A I C P划 0 g e n e
tr a n s c ir P t s in re s Po n s e to A B A ( 1 00 p n
l o
lL )
,
G A 3 (100 pm o ljL )
,
IA A ( l0() pm o比 ) , 2 , 4 一D ( 10 卜m o ljL ) , a n d 6 一B A (10 p l n o ljL ) tre a tm e nt s .
OT ta l R N A w a s a ls o i s o la te d ofr m 3
一
w e e k
一 o l d w il d
一
t y Pe Pl an t s
.
(C ) M a P o f o
v e r e x Pre s s i o n v e e t o r
.
c D N A o f A tC P 3K O w
a s s u b e lo
n e d in to
t h e PE G A D b in a r y
v e c to r w it h a G矛, P g e n e a n d a B a r g e n e u n d e r ht e e au l ifl o w e r m o s ia e v iur s (C a M V ) 355 P r o m o t e r (D ) T h e A t C P心O
m RN A l e v e l o f w i ld
一 ty Pe ( e o l
一
4 ) an d 3 55
:
C P K 30 t r a n s g e n i c li n e s
.
2 30 JPa l nt P hvs io l M口 I B io l Vo l
.
3 3
t C f
at mn ets
,
b u t i t d i fe
r s fr o m t h e a c c u l l l u l a ti o n o f C P K了O
g e n e t r a n s c r i P t s a n d t h e t im e w h e n i n d u e t i o n l e v e l 15 a t
i t s m a x im u m
,
A B A 15 t h e s tr o n g e s t i n d u e o r, of ll
o w e d b y
G A 3
,
2
,
4
一
D
,
IA A
, a n d 6
一
B A
.
T h e h i g h e s t m R N A l e v e l
o f C P娜0 g e n e a PP e a r e d a t 6 h a ft e r A B A t r e a tm e n t ,
a n d a t Z
,
6
,
12
,
a n d 4 h a ft e r G A 3
,
IA A
,
2
,
4
一
D
,
a n d 6
一
B A
t er a tm e n t s r e s P e e t i v e l y
.
2
.
2 Ph e n o t y Pe o f C P孟3 0 一 o v e r e x P r e s s i n g l i n e s
OT d
e t e mr i
n e w h e t h e r C P K 3 0 Pl a y s a r o l e i n h o r
-
m o n e er sP o n s e P a t hw a y s
,
w e t r a n s fo mr
e d th e C o l u m b i a
( c o l
一
4 ) e c o t y P e o f A r a b id op
s i s w i th a b i n a r y v e e t o r
,
P E G A D
,
t o g e n e r a t e a n a e t i v a t i o n T
一
D N A
一
t a g g e d
P o P u l a ti o n
.
T h e -T D N A er g i o n o f ht e v e e t o r e o n t a i n s t w o
e
hn
a n c e r s
for m ht
e c a u l i fl o w e r m o s ia e v iur
s ( C a M V ) 35 5
p r o m o t e r
,
a b a r g e n e (B a s ta er s i s t a n e e ) a s th e Pl a n t tr a n s
-
fo r m a t i o n s e l e e t i v e m a r k e r n e a r t h e r i g h t b o r d e r (R B )
a n d a g r e e n fl u o r e s e e n e e P r o t e i n ( G F P ) g e n e n e a r t h e
l e ft b o r d e r (L B ) ( F i g
.
I C )
.
H o m o z y g o u s T : l i n e s w e r e
o b t a i n e d b y s e lif n g th e 4 5 o ir g i n a l T I t r a n s fo mr
a n t s fo
r
tw o g e n e r a ti o n s (d e s i g n a t e a s 3 5 5 : C P K 3O)
, a n d fo
u r li n e s
w e r e s e le e t e d fo r fu rt h e r a n a ly s i s
.
C尸沼0 In R N A le v e l s
i n t h e s e P l a n t s w e r e e x a m i n e d b y s e m i
一
q u a n t i t i v e R -T
PC R a n a ly s i s
.
I t w a s fo u n d t h a t a l l fo u r i n d e P e n d e n t il n e s
sh o w e d s ig n i if e a n t l y i n c r e a s e d m R N A l e v e l e o m P a r e d
w i th th e w i l d
一
t y P e c o n t r o l li n e s ( F ig
.
I D )
.
T h e P r i m a r y r o o t o f 3 5 5 : C P K 3 0 s e e d l i n g s sh o w e d
af
s t e r d e v e l o Pm e n t th a n t h a t o f w i ld
一
t y P e a t t h e e a r l y
s t a g e s ( F ig
.
2 )
,
b u t t h e d i fe
r e n c e
fa d
e d a w a y a t 1 1 d a y s
a ft e r s o w i n g
.
C P K 3 0 s e r v e s a s a c a l e i u m s e n s o r P r o t e i n
k i n a s e
,
a n d w e t r y t o s t u d y e fe
e t o f e a l e i u m o n w i ld
-
t y P e a n d 3 5 5 : C p K 3 0 l i n e s
.
T h e s e e d s w e r e i n o e u l a t e d
o n s o li d M S m e d i a e o n t a i n i n g d i fe
r e n t e o n e e n t r a ti o n s
o f C a Z
+ : 0
.
0 1 m m o l几 ( s e r i o u s la c k o f C a Z+ ) , 1 m m o l几
(s l i g h t s h o rt a g e o f C a ,
+
)
,
a n d 10 m m o l几 (a n e x c e s s o f
C a Z
+
)
.
In et er s ti n g ly
,
ht e er s u l t s s h o w th at ht e p ir m娜 or o t s
o f C P天3 0 一 o v e er x Per s s i n g l i n e s d e v e l o P fa s te r a n d s otr n
-
g e r t h a n th o s e o f w i l d
一
ty P e li n e s g r o w n o n M S c o n t a i n
-
i n g C a Z
+
0
.
0 1
nu
o比 o n l l t h d a y . B u t t h e r e w a s a li t t l e
d i fe
r e n c e w h e n t h e s e e d l i n g s w e r e g r o w n o n M S c o n
-
t a i n i n g C a Z
+
1
m
o l几 a n d t h e p r im ar y r o o t l e n g t h s o f
w i l d
一
ty P e an d t h o s e o f C P人万O一 o v er x P er s s i n g li n e s e l o n
-
g a t e d th e s a m e w h e n t h e i r s e e d l i n g s w e r e i n o e u l a te d o n
M s c o n t a i n i n g C a ,
+
10
m
o比 ( F i g . 3A ) .
2
.
3 A b n o r m a l r o o t d e v e l o Pm e n t i n d u c e d b y h o r
-
m o l
e t此 s tm e n t
T h e s e e d s o f w i ld
一
t y P e A ar b i故 )P 5 15 a n d 3 5 5 : C P K 3O
w e er i n o c u la t e d o n M S s u PP l e m e n t e d w i th d i fe er
n t e o n
-
e e n tr a ti o n s o f A B A
,
I A A
,
N PA
,
G A 3 P l u s P a e o o r 6
一
B A
.
A ft e r 1 1 d o f d e v e l o Pm e n t
,
t h e l e n g t h s o f t h e P r im a r y
r o o t s w e r e m e a s u r e d a n d t h e n u m b e r s o f l a t e r a l r o o t s
w e er e o u n t e d
.
nI t h e a b s e n e e o f e x o g e n o u s h o mr
o n e
,
th e
l e n g t h o f P r im ar y
r o o t a n d n u m b e r o f l a t e r a l r o o t s w e r e
a lm o s t t h e s a m e i n w i ld
一
t y P e a n d 3 5 5 : C P K 3 0
,
b u t fo r
ht e s e e d l i n g s g r o w n o n M S e o n t ia n i n g d i fo er
n t e o n e e n
-
t r a t i o n s o f A B A
,
th e r e s u l t s s h o w s i g n i if c a n t d i fe
r e n e e
,
a n d 3 5 5 : C P K 3O a PP e a r t o b e m o r e s e n s i t i v e t o A B A
.
F i g
.
2 P ir m a r y r o o t d e v e lo Pm e n t o f 35 5 : C P K 30 t r a n s g e in e Ii n e a n d w il d
一
ty P
e a t e alr y s ta g e
s o f s e e d l in g g or w th
(A ) Wi ld
一
ty Pe (
e o l
一
4 ) a n d t
r a n s g e n i e l in e
s e e d li n g s w e er g r o w n o n s o li d M S m e d i u m v e rt i e a ll y
.
hT
e s e e d s w
e er i n e u b a t e d a t 4
“
C fo r 4 d
b e fo er b e in g tr a n s fe er d
t o 23
“
C fo r g e nur
n a t io n
.
T h e Ph
o t o g r ap h s w e
r e t a ke
n a ft e
r n u m b e r s o f d a y s
.
(B ) C h a
n
g e o f P ir m a yr r o o t le n g t h
w i th t im e o f s e e d li n g s s h o w n i n (A )
.
N 0
.
3 Y UA N X i n e r a l
.
: Pr o te in 幻n a e a n sd H o rm o n e S i g n a l r Ta n sd e u tio n 2 31
几旧11卜5 3 A
3
.
0
2
.
1
2
.
5
47
:
月 .ē口
ǎE。à40ó己门J u一ìd乞石罗J -
2
.
0
ǎE。àúoJ己e一d节石6 u0J -
1 5
0
.
0 1 0
.
1 1 10
C a Z
`
e o n e e n tr a i to n (m m
o i lL )
0
.
1 0
.
2 0
.
3 0
.
4 0
一
5
A BA e o n e e n tr a tio n (卜m o l /L )
D
Sù0ì一门ó9倒口卜O山E qnN
0
.
0 1 0
.
1 10
N A Pe o
n e e n tr a i to n (卜m o l /L )
F ig
·
3 Ro o tg ro w th o f w ild
一
t yPe a n d 5 53:C KP 0 3 e e sd l in g sr te a te d w ih te a le i um o r l Pa n th o rm
o n e s
(A ) h T
e e n s si ti vi t y to c a l e i um
, s h o w n a s d i fe re n e e s i n le n g ht o f P ir mary or
o t
,
t h e a b s e i s s a d e n o te s t h e s iz e o f e o
m
o n lo g iar ht m s c a le
.
(B )
A B A in h i b i t io n o f r o o t e l o n g a t i o n o f 1 1
一
d a y
一 o l d s e e d l i n g s
.
(C ) A b n o r m a l r o o t d e v e lo Pm e n t o f 11
一
d a y
一 o ld s e e d li n g s o n M S m e d i u m
c o n ta i n in g IA A ( 1 P m o ljL )
,
6
一
B A (0
·
0 8四 。比 ) , o r G A 3 (0 . 1 林m o比 ) Pl u s Pa e o (0 · 02 四o lL/ ) . (D ) hT e e fe c t o f N PA a P Pli c a t io n o n la te r a l
r o o t d e v e lo Pm e n t o f 11
一
d a y
一 o l d s e e d l in g s
,
t h e ab
s e i s s a d e n o te s ht e s i z e o f e o
m
o n lo g iar t hm s e a l e
.
R o o t g or w t h w
a s e o m P l e t e ly In h ib i te d b y A B A 0
.
4 5 m o lj
L w h i l e r o o t s o f w i ld
一
t y P e s t i l l e l o n g a t e d (F ig
.
3B )
.
T h i s
r e s u l t fu rt h
e r P r o v e s t h a t C P K 3 0 15 a P o s i t i v e re g u l a t o r
o f A B A s i g n a l t r a n s d u e t i o n i n a e e o r d a n e e w i t h S h e e n
( 1 9 9 6 )
.
O n t h e e o n t r a r y
, r o o t s o f 3 5 5 : C P K 3 0 d e v e l o P e d
af s t e r t h a n t h o s e o f w i l d t y P e P l a n t s w h e n g r o w i n g o n
M S e o n t a i n i n g IA A
,
G A 3 P l u s P a e o o r 6
一
B A
.
T h e g er a t
-
e s t d i fe
r e n e e s i n e v e yr P l a n t h o r m o n e t r e a tm e n t w e r e
f i g u r e d P a r a l l e l t o th e e o n t r o l (F i g
.
3 C )
.
T h e r e s u l t i n d i
-
e a t e s t h a t P l a n t h o mr
o n e s , e s P e e i a l l y IA A a n d G A 3
,
P r o
-
m o t e r o o t g r o w t h o f 3 5 5 : C P K 3 0 s e e d l in g s m o er ht an th at
o f th e w i l d
一
ty P e
.
D e v e l o Pm e n t o f la t e r a l r o o t P ir m o dr i
u m 15 Por P
o s e d
t o o b t a i n IA A v i a P o lar a u x i n t r an s P o rt (R e e d e t a l
.
19 9 8 )
.
T h e P o lar a u x i n tr an s P o rt ihn ib i t
o r N PA b l
o e k la t e alr or
o t
e m e r g e n e e a n d l e a d t o d e e r e a s e d n u m b e r o f l a te r a l or
o t s
a n d r e d u e e d t h e fr e e I A A l e v e l s i n r o o t
.
W i l d
一
t y P e a n d
3 5 5 : C P K 3 0 s e e d l i n g s w e r e g e rm i n a t e d o n M S m e d i u m
s u PP l e m e n t e d w i t h N PA (0
,
0
.
0 1
,
0
.
1
,
1 o r 10 p m o l /L )
.
NP A s i g n i if e an t ly in h i b i et d th e e m e gr e n c y o f la t e r a l or o t s
fr o m 1 1
一
d a y
一 o l d P ir m a yr r o o t s o f w i ld
一
ty P e s otr
n g e r t h a n
t h a t o f 3 5 5 : C P K 3 0
, e s P e e i a l l y
,
th e g r o w ht o f la t e r a l r o o t
o f w i l d
一
t y P e b u t n o t t h a t o f 3 5 5 : C P K 3 0 s t o PP e d e o m
-
P l e t e ly b y N PA 10 林m o lL/ ( F i g
.
3D )
.
2
.
4 L o c a l i z a t i o n o f A t C P K 3 0 i n c e l l
oT i
n v e s t i g aet
t h e l o e a l i z a t i o n o f A t C P K 3 0
, a g r e e n
fl u o r e s e e n t P r o t e i n (G F P )
一
A t C P K 3 0 fu
s i o n P r o t e i n w a s
t r a n s i e n t ly e x Per s s e d i n o n i o n e P id e r m a l c e l l s u n d e r t h e
e o n t r o l o f t h e c a u li fl o w e r m o s a i e v i r u s 3 5 5 P r o m o t e r
.
W h
e n t h e G FP
一
A t C PK 3 0 fu s i o n P r o t e i n w a s e x P r e s s e d
i n o n i o n e e l l s
,
fl u o r e s c e n e e w a s v i s ib l e i n t h e e e l l w a l l
2 32
J P la n t P hy s io l M o l B io l V o l
.
33
a n d P l a s m a m e m b r a n e ( F i g
.
4)
.
日一A
F i g
.
4A t C P K 30 lo e a li a zt i o n i n e e ll
G F P
一
C P K 30 fu s io n P r o te i n t r a n s ie n t t r a n s fo r m a t i o n o f o n io n
e P id e rm i
s e e ll s re v e a l e d t h e l o e a l i zat i o n o f C P K 30 in e e ll wa ll an d
e e l l m e m b r a n e
.
( A ) G e n e r a l P i e t u r e o f G F P a c e u m u l a t e d i n
eP id e rm i
s e e l ls
.
( B ) P la s m o l y s i s o f o n io n e P id e rm i
s e e ll s
.
3 D is c u s s i o n
F r o m t h e a b o v e r e s u l t s
,
w e e a n c o n e l u d e t h a t
A r口灯 0 fu lif 一15 m u l t i p l e fu n e t i o n s o f er s p o n s e s t o h o r -
m o n e s a t th e e a r ly d e v e l o Pm e n t s t a g e s o f A ar b id op
s i s
.
3 5 5 : C P K 3O w a s h y P e r s e n s i ti v e t o e x o g e n o u s A B A a n d
s i g n i if c a n t l y i n h ib i t s r o o t g r o w t h ( F ig
.
3B )
.
M o r e o v e r
,
h o mr
o n e s e an
e
fe
e t i v e ly in d u e e t h e e x Per s s i o n o f C P 3K O
( F ig
.
I B )
.
In d e e d
,
P r e v i o u s s t u d i e s a n d o u r er s u l t s s h o w
t h a t A tC P K 3 0 m a y b e a m e d i a t o r o f s i g n a l t r a n s d u c t i o n
Por
e e s s e s t h a t s e vr
e s t o c o o dr i n at e e x tr ac e l lu lar h o mr
o n e s
s t im u l i t o c e l lu lar er s P o n s e s d u ir n g n o mr
a l d e v e l o Pm e n t
o f t h e P l a n t
,
b u t i t w o u ld P l a y a n i m P o r t a n t r o l e w h e n
Plan t 15
u n d e r setr s s
.
S y n th e t i e a l ly
,
S h e e n ( 199 6 ) an d o u r
if n d i n g a l s o P r o v e t h a t A tC P K 3O c a n s e r v e a s a s i g n a l
r e g u l a t o r a n d a c r o s s
一
t a l k n o d e i n s t r e s s a n d h o r m o n e
s i g n a l t r a n s d u e ti o n
.
I t h a s b e e n er P o r t e d i n d e ta i l ht a t s i g n a l
一
t r a n s d u e
-
t i o n P a t h w a y s i n v o lv e h o mr
o n e s a n d e a l e i u m a s s e c o n d
m e s s e n g e r s i n a n im a l s y s t e m s
.
A s h w o r t h a n d H i n k l e
( 19 9 6 ) r e P o rt e d t h a t h o mr
o n e i n d u e e d i n tr a e e l l u lar c a l
-
e i u m r e s P o n s e i n i n d i v id u a l r a t l a e t o tr o Ph s a n d t h y r o Ph s
.
A n d r i e i l lu而 n a t e d th a t e n d o t h e l i n i n d u e e d l o n g l a s t i n g
a n d C a Z
+ 一
in fl u x
一
i n d e p e n d e n t b l o c k a d e o f i n t r i n s i e s e c r e
-
t i o n i n P i t u i t a r y e e l l s ( A n d r i e e t a l
.
2 0 0 5 )
.
I n P l a n t s
,
h o w e v e r
,
i t 15 u n c l e ar h o w P l a n t h o n l l o n e s
, s u c h a s a u x i n
,
G A 3 o r 6
一
B A
,
i n t e r a e t w i t h e al e i u m t o e o n t r o l i n t r a c e ll u
-
lar e v e n t s
.
S e v e r a l lab o
r a t o ir e s h a v e eam
e d o u t t h e s t u d y
t h a t s o m e e a l e i u m
一
r e g u l a t e d P r o t e i n ik n a s e s for m Pl
a n t s
i n v o l v e d i n s o m e h o r m o n e s s i g n a l
一
t r a n s d u e t i o n
P a t h w a y s
.
F o r e x a m P l e
,
t h e C D P K a e t i v i t y h a s b e e n i n
-
c r e a s e d w h i l e r i c e s e e d s w e r e t r e a t e d w i th g ib b e r e l l i n
( A b o
一
E I
一
S a a d a n d W u 19 9 5 ) o r b r a s s i n o l id e (aY
n g a n d
K o m a t s u 2 0 0 1)
.
C D P K s a e t i v i ti e s a r e a l s o r e g u l a t e d a t
t h e t r a n s e r iP t i o n a l l e v e l b y h o r m o n e s
.
G A 3
,
A B A
, a n d
e y tok i n i n a l l i
n d u c e th e e x Per s s i o n o f N tC D P K I m R N A
i n d e t a c h e d t o b a e c o l e a v e s (OY
o n e t a l
.
19 9 9 )
.
B e nj am i
n s
e t a l
.
( 2 0 0 3 ) P r o v i d e s t h e if r s t m o l e e u la卜 b i o l o g i c a l e v i -
d e n c e fo r t h e i n v o l v e m e n t o f e a l e i u m i o n b i n d i n g P r o
-
t e i n i n a u x i n
一 r e g u l a t e d Pl a n t d e v e l o Pm e n t P r o e e s s e s
.
H e r e
,
b y i m P a r t i n g a g a i n
一 o -f fu
n e t i o n t o A ar b i
-
J即 5 15 ( N ak a z a w a e r a l . 2 0 0 3 ) , i t fo mr e d l o n g e r P r im ar y
r o o t s i n t h e e a r ly s t a g e s a n d 15 m o r e s e n s i t i v e t o h o r
-
m o n e fo r 3 5 5 : C P K 3 0 P l a n t s ( F i g
.
2 )
,
w h i c h i n d i c a t e s a
r o l e o f A tC P K 3 0 i n A ar b id op
s i s r o o t d e v e l o P m e n t
, a l
-
t h o u g h t h e r o o t o f 3 55 : C p K 30 e l o n g a t e s a lm o s t a s fa s t
a s t h a t o f t h e w i ld
一
t y P e o n 1 l t h d a y o f g r o w th
.
I t i s w e l l
k n o w n th a t t h e g r o w t h o f P l a n t w o u l d b e d e l a y e d w h e n
s e e d l i n g s g r o w o n M S i n w h ie h n e c e s s a r y n u tir t i o n s ar e
l a e k
.
In te er s t i n g l y
,
i n t h i s s t u d y s e ir o u s l a c k o f C a Z
+
h a s
s m a l l e fe
c t s o n r o o t o f 3 5 5 : C P K 3 0 o n 1 l t h d a y e o m
-
Paer d
w i t h t h a t o f w i l d
一
t y P e A ar b id op
s i s (F ig
·
3A )
,
w h i c h
d e m o n s t r a te s t h a t o v e er x P r e s s i n g A tC PK 3 0 P r o te i n e a n
r e s P o n d t o s t im u l u s s i g n a l s s u e h a s v a r i o u s P l a n t
h o r l l l o n e s
.
P l a n t h o mr
o n e s s u e h a s a u x i n s
,
G A 3
,
a n d A B A a -f
fe e t or o t d e v e l o Pm e n t i n d i fe er n t w a y s
.
A u x i n tr a n s P o rt
P r o m o t e s th e e l o n g a ti o n o f P ir m a r y r o o t s thr o u g h r e g u
-
l a t i n g b o t h e e l l d i v i s i o n a n d e e l l e x P a n s i o n
,
a s w e l l a s
l a t e r a l r o o t s i n i ti a ti o n a n d e l o n g a t i o n ( C a s im i r o e t a l
.
2 0 0 1; K i m e t a l
.
2 0 0 1 )
,
h o w e v e r
, a u x i n e o n t r o l s t h e
g r o w t h o f r o o t s b y m o d u la t i n g e e l l u lar er s P o n s e s t o th e
P h y t o h o r m o n e g ib b e r e l l i n i n A r a b id o P s i s ( F u a n d
H a r b e r d 2 0 0 3 )
, a n d A B A i n h i b i t s r o o t e l o n g a t i o n
(W h
a l e n an d eF ld m
a n 19 8 8 )
.
R e s u lt s o f o u r e x P e ir m e n t s
s h o w e d th a t 3 5 5 : C P K 3 0 er s u l t e d i n l o n g e r P ir m a r y or
o t s
g r o w n o n M S e o n t a i n i n g v ar i o u s h o r m o n e s o t h e r t h a n
A B A e o m Par e d w i t h t h e e o n t or l s o n 1 l th d a y ( F i g
.
3 C )
.
A m o d e l 15 P r o P o s e d t h a t t h e r e 15 e o n n e e t i o n b e
-
t w e e n a u x i n a n d la t e r a l or o t d e v e l o P m e n t
.
M u t a n t s w i t h
l o w e r s e n s i t i v i t y t o a u x i n e x h i b i t r e d u e t i o n o r a b s e n e e
N o 3 Y U A N X i n e ta l
.
: P r o te in助 n a s e a n d H o rm o n e S i g n a l Tr a n s d uc tio n 23 3
o f l a te r a l r o o ts ( R e e d e r a l
.
1 9 9 8 )
.
T h e to m a to m u ta n t
d iag
e o
ro tP i
e a (d g t) d o e s n o tP ro d e e ul a te ral r o o ts (M
ud a y
e ta l
.
19 9 5 )
.
In o r s u t ud y
,
i t 15 o b v i o u s t h a t N PA
r e l a
-
t i v e l y l e s s i n h ib i ts e m e gr i
n g l a t e r a l r o o t s fo r 3 55 : C P K 30
(F ig
.
3D )
.
hT
e s e Ph e n o m e n a s u g g e s t t h a t C P K 30 m a y ac t
a s o n e o f s t im u l u s
一 r e s P o n s e fo
r s o m e h o mr
o n e s
an d h
e lP
r o o t t o t r a n s d u e e a n d a m Pl i fy t h
e h o r m o n e s i g n a l
.
A e e o r d i n g l y
,
i t 15 i n fe r e d t h a t A tC P K 30 m a y li e d o w n
-
s t r e a m o f h o r m o n e
一
m e d i a t e d s ig n a l i n g P a t hw a y s a n d
Ph o s Ph o r y l a t e s o m e P r o t e i n s r e l a t e d t o h o mr
o n e s i g n a l
t r a n sd u e ti o n o r h o r m o n e m e t a b o l i s m
.
T h e e e l l w a l l a n d i t s u n d e r l y i n g Pl a s m a m e m b r a n e
r e Per s e n t th e d y n a m i c i n t e afr
e e b e tw e e n a P l a n t e e l l a n d
i t s e n v i r o n m e n t
,
w h i c h i n c l u d e s i n t e r a e t i n g w i t h P l a n t
h o mr
o n e s ( S h o w a lt e r 2 0 0 1)
.
N o w w e b e e o me ac q
u ia n et d
w i th t h e e x i s t e n e e a n d im P o r t a n e e o f c e l l w a l l Por t e i n s
,
t h e l o e a l i z a t i o n o f G F P
一
C P K 3 0 fu s i o n P r o t e i n t o b o t h
e e l l w a l l a n d P la s m
a m e m b r a n e P r o v i d e d u s W i t h u n d e r
-
s t a n d i n g o f c e l l w a l l P r o t e i n s a n d a l s o fu hrt
e r P r o v e d t h at
A rC P沼0 m a y b e i n v o lv e d i n P la n t h o mr o n e s i g n a l t r a n s -
d u e t i o n (F ig
.
4 )
.
In s u m m a r y
,
o u r er s u l t s s h o w t h a t A tC P 3K O P l
a y s
a n im P o r t a n t r o l e i n r o o t d e v e l o P m e n t b y P a rt i c iP a t i n g
i n Pl a n t h o mr
o n e s ig n a l tr a n s d u e t io n i n A ar b i故沪 5 15 . hT e
Ph e n o t y P e s o f a g a i n
一 o -f fu n e t i o n m u t a n t c o u ld b e t h e
r e s u l t o f m im i e k i n g n a t u r a l fu n c t i o n o f t h e g e n e (Z h a o
e t a l
.
2 0 0 4 )
.
T h e r e fo r e
,
t h e y r e fl e e t ht e r o l e o f A rC P心O
g e n e i n w i ld
一
t y P e P l a n t s
.
A c k n o w l e d g e m e n ts : W亡 t h a n k D r C h e n t a o L in , D e P a r t m e n t o f
M o le c u l a
r
,
C e l l a n d D e v e l o P m e n t a l B i o lo g y
,
U n i
v e r s i ty o f
C a li of r n i a
,
L o s A n g e le s
,
U S A
,
of r h i s h e lP fu l d i s e u s s i o n s a n d
Pr o v i d i n g t h e P E G A D P la s m i d a n d t h e C o l u m b i a e e o t y P e o f
A ar b i dd P
s i s s e e d s
,
R e fe r e n c e s
A b o
一
E I
一
S a a d M
,
W
u R (199 5 )
.
A ir e e me m barn
e e a lc i u m d e pe
n d e n t
P r o te i n k i n a s e 15 in d u e e d b y g i b b e r e l li n
.
P la n t P hy s i o l 108 :
7 8 7一 79 3
A n d r i e S A
,
Z iv a d in o v i e D
,
G o n z a le
z 一
I g l e s i a s A E
,
L a e h o w i e z A
,
oT m i c M
,
S toj il k
o v i e 5 5 (2 00 5 )
.
E n d o t h e li n
一
i n d u e e d lo n g
-
la s t i
n g a n d C a
Z+
i n fl u x
一
i n d e p e n d e n t b lo e k a d e o f in t r i n s i e
s e e r e t io n i n Pi t
u
i ta ry c e ll s b y G z s u b u n i t s
.
J B io l C h e m 28 0 :
1 074一 10 9 1
A s w o rt h R
,
H i n kl e PM (199 6 )
.
T h y or tor P i n
一 r e le a s in g h o rm
o n e -
i n d u e e d i n t r a c e l l u l a r c a le iu m r e s P o n s e s i n i n d i v i d u a l r a t
l a e to tor Ph s a n d ht y or tr o P h s
.
E n d o e ir n o lo g y 137 : 52 05一52 12
B e nj a m in s R
,
A m Pu d i a C S G
,
H o o y k a a s P J J
,
O f f r i n g a R (2 00 3 )
.
P IN O ID
一
m e d i a t e d s i g n a li n g i n v o l v e s e a l e i u m
一
b i n d i n g
P or t e i n s
.
P la n t P h y s i o l 13 2 : 16 2 3一 16 30
C a s im i r o l
,
M a r e h a n t A
,
B h a l e r a o R P, B e e e k m a n T, D h o o g e S
,
S w aru P R
,
G ahr am N
,
D i rk l
,
San db ers G
,
C a s e r o PJ
,
B e n n e t t
M (2 00 1)
.
A u x i n t r a n s Po rt Por m o te s A ar b id哪 , 5 15 l a te ar l or o t
in it ia t i o n
.
P la n t C e l l 13 : 84 3一 8 52
C h e n g S H
,
W i l lm
a n n M R
,
C h e n H C
,
S h e e n J (2 00 2 )
.
C a lc i u m
s ig n a l in g th r o u g h Pr o te i n k i n a s e s
.
T h e A ra b id op s is e a l e iu m
-
d e Pe n d e n t P r o te i n k i n a s e g e n e fa m i ly
.
P l a n t P h y s i o l 1 2 9 :
4 69一4 8 5
C lo u g h S J
,
B e n t A F (19 9 8 )
.
F l o r a l d i P : a s im Pl i if e d m e th o d fo r
A g or b a
c t e r iu m
一
m e d i a te d t r a n s fo r m a t i o n o f A
r a b id op s i
s
ht a l ia n a
.
P la n t J 16 (6 ) : 7 35一7 4 3
F u X D
,
H a r b e r d N P (20 0 3 )
.
A u x i n P r o m o t e s A ar b i J 口P s is r o o t
g or w t h by m o d u la t in g g i b b e re lli n re s Po n s e
.
N a tu re 4 2 1 : 74华
7 4 3
H
arfn
o n A C
,
G r ib s k o v M
,
H a rp e r JF (20 0 0 )
.
C D P K s 一 a k i n a s e
of r e v e叮 e a Z+ s i g n a 一? rT e n d p la n t S c i s : 15今 15 9
K im K N
,
C h e o n g Y H
,
G r a n t J J
,
P a n d e y G K
,
L u a n S (2 0 0 3 )
·
C I P K 3
, a e a l c i u m s e n s o r
一 a s s o e i a t e d P r o te i n k i n a s e th a t
r e g u la t e s a b s e i s i c a c i d a n d e o ld s i g n a l t r a n s d u e t i o n i n
A ar b id op s i s
.
P l a n t C e ll 15 : 4 11一 2 3
助 m S H , A rn o ld D , L lo y d A , R o u x S J (20 1 ) . A n t i s e n s e e x Pre s s io n
o f an A ar b i汰矽5 15 r an b in d in g Por te i n re n de r s tr an s g e in c or o t s
h y Pe r s e n s i t iv e ot a u x i n a n d a lt e r s a u x i n
一
i n d u e e d or o t g or w ht
a n d d e v e lo P m e n t b y a r e s t i n g m i to t ie P r o g r e s s
.
P l a n t C
e l l
13 : 2 6 19一 26 30
M u d a y G K
,
L o m a x T L
,
R a y l e D L ( 199 5 )
.
C har a c t e ir z a t io n o f th e
g or w ht a n d a u x in Ph y s i o l o g y o f r o o t s o f ht e to m a to m
u t a n t ,
d i a g e o t r o Pi e a
.
Pl a n ta 19 5 : 54 8一5 53
N a k a z a w a M
,
I c h ik a w a T, I s h i k a w a A
,
K o b a y a s h i H
,
sT
u h a r a Y,
K a w a s h i m a M
,
S u z u k i K
,
M u t o S
,
M a t s u i M (2 0 0 3 )
.
A e t iv a t io n t a g g in g
, a n o v e l to o l t o d is s e c t t h e fu n e t io n s o f a
g e n e af m il y
.
P l a n t J 3 4 : 7 4 1一 75 0
R e
e
d R C
,
B
r a d y S R
,
M u d a y G K ( 1 99 8 )
.
I n h i b i t i o n o f a u x in
m o v e m e n t fr o m t h e s h o o t in to th e r o o t i n h i b i t s la t e r a l r o o t
d e
v e l o P m e n t i n A ar b iJ
`
,
5
1
5
.
P l a n t Ph y s io l 1 1 8: 1 36 9一 13 7 8
R o b e rt s D M
,
H a r m o n A C ( 199 2 )
.
C a le i
u m
一
m o d u la t e d P r o te in s :
t ar g e t s o f i n tr a e e ll u lar e a l c iu m s i g n a ls in h i g h e r Pl a n t s
.
A n n u
R e v P l a n t P hy s i o l P la n t M o l B i o l 4 3 : 3 75礴 14
R o g e r s S G
,
K e e H J
,
H o r s e h R B
,
F r a l e y R T ( 19 87 )
.
Im P r o v e d
v e e t o r s fo r P la n t t r a n s fo rm
a t i o n
: e x P r e s s io n e a s s e t t e v e e to r s
a n d n e w s e le e ta b l e m a r k e r s
.
M e th o d
s
E n z y m o l 1 5 3 : 2 5 3一
27 7
植物生理与分子生物学学报 , oJ u rn a l of p勿 n t p hy s i o l o舒 a n d M Ole c u la r B io lo群 2 00 7 , 3 3 (3) : 2 27一 23 4
Sh e e n J ( 199 6 )
.
C a ,
+ 一
d e p e n d e n t P or t e i n k i n a s e s a n d s t er s s s i g n a l
t r a n s d u e t io n i n Pl a n t s
.
S e ie n e e 27 4 : 19 0于 190 2
Sh o w a lt e r A M (20 0 1 )
.
In otr d
u e t io n : P la n t e e ll w a ll Pr o te i n s
.
C e ll
M o l L i fe S e i 58 : 136 1一 136 2
W h a le n M C
,
F e l dm a n L J (19 88 )
.
T h e e fe
e t o f e t hy l e n e o n r o o t
g or w t h o f eZ a m a y s s e e d l i n g s
.
C a n J B o t 66 : 7 19一7 2 3
aY
n g G
,
K o m a t s u S (20 0 1)
.
I n v o lv e m e n t o f c a le i u m d e P e n d e n t
P r o t e in k i n a s e in r i e e (O ry z a s a t iv a L
.
) la m i n a i n e li n a ti o n
c a u s e d by b r a s s i n o l id e
.
p la n t C e l l p h y s i o l 4 1 : 124 3一 12 50
Y o o n G M
,
C h o H S
,
H a H J
,
L i u J R
,
L e e H P ( 19 9 9 )
.
C h a r a e te ir z a ti o n o f Nt C D P K ]
, a e a l e iu m
一
d e Pe n d e n t Pr o te i n
k in a s e g e n e i n iN e o t at n a t a b a e u m
, a n d rh e a e t i v it y o f i t s
e n c o d e d P r o t e in
.
P la n t M o l B io l 3 9 : 99 1一 100 1
Z h a o L
,
N ak
a z a w a M
,
aT k a s e T, M a n a b e K
,
K o b a y a s h i M
,
S e k i
M
,
S h in o z iak K
,
M a ts u i M (20 04 )
.
O v e r e x Per s s io n o f L S H ]
,
a m e m b e r o f an u n e h a r a c te ir s e d g e n e fa n 1 i 1y
, c a u s e s e n han c e d
li g h t r e g u lat i o n o f s e e d l in g d e v e lo P m e n t
.
P l an t J 37
: 6 9 4一
70 6
拟南芥钙依赖蛋白激酶参与植物激素信号转导
袁听 ’ ` , 邓克勤 ” , 赵小英 ’ , 伍贤进 2 , 秦玉芝 ’ , 唐冬英 ’ , 刘选明 ’ *
, 湖南大学生命科学与技术研究院 , 生物能源与材料研究中心 , 长沙 4 10 0 8 2 ; 2 怀化学院生物工程系 , ,怀化 4 1 8 0 0 0
摘要 : 在植物信号通路中 , 涉及到钙应答的蛋 白激
酶大多是钙依赖蛋白激酶 。 钙依赖蛋 白激酶作为钙
信号转导因子 , 参与了包括激素信号转导途径在内
的很多传递过程 。 本工作在前人研究的基础上 , 对
拟南芥 A t C 尸 K 了O 基因的功能进行了深入的研究 。
R T
一
P C R 分析结果表明 : A t C P K3 O在植物根中的表达
量很高 , 其在幼苗 中的转录 水 平分别受 A B A 、
I A A
、
2
,
4
一
D
、
G A 3 和 6 一 B A 等激素的诱导调节 。
A t C P娜口基 因过表达的转基因株系幼苗的主根比野
生型的长 , 同时发现转基因植株幼苗的根在缺钙的
M S 培养基上生长较野生型植株长 , 表明缺钙对转
基因幼苗影响较小 。 用 A B A 、 I A A 、 G A 3和 B A 处
理时 , 转基因植株幼苗的根对激素更敏感 。 当野生
型和转基因植株生长在含有生 长素抑制剂 N P A 的
M S 培养基上时 , N P A 对转基因植株侧根的抑制比
对野生型弱 。 G F P 一C P K 30 融合蛋白的亚细胞定位研
究结果表明 : C P K 3 0 蛋白定位在细胞壁和细胞膜
上 。 这些研究结果说明了 A tC P K 30 作为钙信号转导
因子 , 参与了多种激素调节植物根生长的过程 。
关键词 : 拟南芥 ; 蛋白激酶 ; 激素 ; 钙 ; 根 ; 表达量分析
中图分类号 : Q 7 8
湖南省自然科学基金 ( N o . 0 5 J J 3 0 0 3 8 )和 “ 9 8 5 ” 工程高校基金 (湖 l钓
大学 )资助 。
* 共同第 作者 。
* * 通讯作者 ( E一 m a il : s w _ x m l @ h n u . c n ; T e l : 0 7 3 1一 8 8 2 1 7 2 1) 。