全 文 ：农业生物技术学报，2010年，第 18卷，第 6期，第 1079~1083页
Journal of Agricultural Biotechnology, 2010, Vol.18, No.6, 1079~1083
研究报告
A Letter
赭曲霉毒素 A (OTA)对拟南芥植物毒性的初步研究
王龑 1* 许文涛 1,2* 彭晓丽 1 罗云波 1,2 赵维薇 1 唐小革 1 黄昆仑 1,2**
1中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083；2农业部转基因生物使用安全检验监督测试中心，北京 100083
*同等贡献作者
**通讯作者，HKL009@163.com
摘 要 赭曲霉毒素 A主要由某些真菌产生的次级代谢产物，广泛分布于谷物、啤酒以及肉等动物性食品中，
对动物和人体赭曲霉毒素 A（OTA）具有肾脏毒性、肝脏毒性，以及致畸、致突变和致癌的作用。本研究主要通
过 Evans blue 染色、trypan blue 染色、琼脂糖凝胶电泳以及双向电泳等研究 OTA 对拟南芥（Arabidopsis
thaliana）植物的毒性，结果表明：OTA对拟南芥植株生长有明显的抑制作用，尤其表现在根、叶等部位；DNA
片段化，经 Trypan blue和 Evans blue染色证明发生细胞死亡，OTA导致拟南芥叶片细胞损伤或坏死，细胞膜
完整性破坏，DNA降解；蛋白电泳结果表明 OTA诱导拟南芥蛋白表达发生变化，一些蛋白表达量上调，一些
蛋白表达量下调，甚至消失。研究提示 OTA具有植物毒性。
关键词 拟南芥，毒性，OTA，双向电泳
Preliminary Study on the Toxicity of Ochratoxin A (OTA) in Arabidopsis
thaliana
Wang Yan 1* Xu Wentao 1,2* Peng Xiaoli 1 Luo Yunbo 1,2 Zhao Weiwei 1 Tang Xiaoge 1 Huang Kunlun 1,2**
1 College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083,China; 2 The Supervision, Inspection & Testing
Center of Genetically Modified Organisms Food Safety, Ministry of Agriculture, Beijing 100083, China
* The authors who contribute equally
** Corresponding author, HKL009@163.com
DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2010.06.007
Abstract Ochratoxin A (OTA) is a mycotoxin produced by several kinds of fungi growing on food source
materials. The main target of OTA is the kidney and liver. However, its plant toxicity is rarely reported. In this paper,
we studied the plant toxicity by OTA in Arabidopsis thaliana through the phenomenon and expression of protein
during the cell necrosis. The results showed that plant growth was obviously inhibited by OTA, especially the roots
and leaves; Trypan blue staining, Evans blue staining and DNA ladder showed that OTA could lead Arabidopsis
thaliana cell necrosis, cell membrane integrity damage and DNA crack; Two-dimensional gel electrophoresis maps
illustrated that OTA could induce different protein expression in A. thaliana. Some proteins were up regulated, and
some others proteins were down regulated, even disappeared. The research indicates the plant toxicity of OTA.
Keywords Arabidopsis thaliana, Toxicity, Ochratoxin A, Two-dimensional gel electrophoresis
DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2010.06.007
基金项目：本研究由国家高技术研究发展计划(863)项目(No.2006AA10Z440)，国家自然基金(No.30800770)和转基因生物重大专
项(No.2008ZX08012-001)共同资助
收稿日期：2009-11-10 接受日期：2009-11-23
赭曲霉毒素 A (Ochratoxin A, OTA)是 1965 年
由 van der Merwe等（1965）首次从赭曲霉(Aspergillus
ochraceus)中分离得到的一种真菌毒素，其化学结构
为苯甲酸异香豆素，化学分子式为 C20H18ClNO6，分子
量为 403.8，是无色结晶化合物。主要由赭曲霉、黑曲
霉和青霉属的某些菌株产生，广泛分布于各种各样
的贮藏的食品中，如谷物、咖啡、啤酒、红酒，以及肉
等动物性食品 (Jorgensen, 2005; Mateo et al., 2007)。
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Journal of Agricultural Biotechnology
因此，在正常饮食情况下摄入 OTA几乎是不可避免
的。根据欧盟报告，在欧盟平均 OTA摄入量大约是
1 ng/d/kg体重，根据不同的饮食习惯最高能到 3.55
ng/d/kg体重(Miraglia et al., 2002)。OTA对多种动物
具有肾脏毒性、肝脏毒性、免疫毒性、致畸毒性和致
癌性，国际癌症研究机构在 1993年将 OTA定为人
类可能的致癌物（Visconti et al., 2001），但其植物毒
性鲜有报道。
本研究主要通过观察 OTA抑制拟南芥植株生
长，诱导发生细胞死亡的现象，以及蛋白质组的变化
来揭示其对拟南芥的植物毒性。
1结果与分析
1.1 OTA纯度验证
按照方法 3.3.1得到高效液相色谱图（图 1）。根据
峰面积计算得出，OTA 浓度为 175 mmol/L，纯度
99.31%。
1.2 OTA对拟南芥植物毒性的形态学观察
通过在 MS培养基中加入一定浓度的 OTA，种
子的发芽率明显降低。如图 2左所示，B幼苗是在含
有 0.025 mmol/L OTA培养基上发芽后的第 7天，相
对 A幼苗长势明显变弱，长出两片基叶很小，而且根
的生长缓慢。发芽生长 7 d，根长为对照组的 59.26%，
幼苗鲜重（10棵一组）为对照组的 72.73%。4周龄拟
南芥离体叶片在 0.5 mol/L OTA胁迫下光照处理 48
h，相对于在甲醇对照中的叶片 C，叶片 D表面出现
明显的坏死斑（图 2右）。这说明 OTA能导致植物组
织细胞死亡，并且抑制叶和根的生长，高浓度 OTA
可直接阻止其发芽。
1.3 DNA 片段化
细胞死亡或凋亡时，细胞染色体的 DNA被降
解，产生不同长度的寡聚核苷酸片段，把降解的片段
置于含 GoldViewTM的 1％琼脂糖凝胶中进行电泳，
细胞凋亡呈现特征性典型的“梯状”条带。而细胞死
亡时，常由细胞损伤而引起的 DNA无规律的断裂，
伴有组蛋白降解，在琼脂糖凝胶电泳上呈模糊的弥
漫膜状条带。如图 3所示，OTA胁迫处理的拟南芥叶
片细胞基因组除主带外，还呈模糊弥漫状条带，说明
发生细胞死亡，分子水平证实 OTA存在植物毒性。
1.4 细胞死亡染色
图 4 A显示正常拟南芥叶片没有被 Trypan blue
着色，处理组图 4 B被 Trypan blue染成蓝色。细胞损
伤或死亡时 Trypan blue穿透变性的细胞膜，与解体的
DNA结合，使其着色，活细胞能阻止染料进入。台盼蓝
检测的是细胞膜完整性，通常认为细胞膜丧失完整性，
即认为已经死亡。Trypan blue核酸染色说明 OTA能
引起拟南芥叶片细胞膜的破裂使其丧失完整性。
OTA处理 36 h后的叶片相对于对照组吸光值
明显增高（图 4 C）。Evans blue染色法检测拟南芥叶
片细胞死亡动态。其原理是 Evans blue在 600 nm处
有吸收峰，死细胞可吸收 Evans blue，而活细胞和超
敏反应（HR）发生后期的细胞则不能，因而在分光光
度计 OD600下可检测细胞死亡程度，并可根据不同时
刻 OD600的值获知处理后细胞的死亡进程。
1.5双向电泳
在相同的条件下进行双向电泳，得到的 2-D图
谱，见图 5。相同条件下甲醇对照和 OTA胁迫处理的
双向电泳实验分别重复了 3次，各自总蛋白分布模
式极其相似。经 ImageMaster 2D platinum软件分析，
匹配率均达 90%以上，图像分辨率甲醇对照达到
801±42 个蛋白斑点（图 5 A），OTA 胁迫处理达到
810±28个蛋白斑点（图 5 B）。
结合软件分析和肉眼观察，如图 5 A和 5 B所
示，红色圈显示表达发生差异的蛋白，红色箭头指示
在处理组 2-D 图中没有表达或表达量明显下降的
点。可以得出结论，OTA胁迫处理导致拟南芥叶片全
蛋白表达发生了变化，一些蛋白表达上调，也有些蛋
白表达下调。但是什么蛋白、表达量差多少、属于哪
个家族，还需要做胶内酶切、质谱鉴定、在数据库中
查到比对才能得出结论。
2 讨论
2.1 OTA 植物毒性依据
图 1 OTA高效液相色谱图
Figure 1 Picture of OTA with HPLC
14.0
400
350
300
250
200
150
100
50
0
t/min
m
A
U
0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.011.012.013.0 15.0
1080
OTA的植物毒性主要通过生理现象和分子手段
进行检测（Zhang, 2000）。生理现象主要有肉眼可观
察到的是否生长，存在坏死斑等表观现象，也包括活
性氧、胼胝质的积累，呼吸速率 CO2变化等。在 OTA
胁迫的环境下，模式植物拟南芥种子发芽率降低，幼
苗长势弱，叶片较小，根生长缓慢；叶片直接浸泡在
含 OTA的水溶液中会出现坏死斑。生理形态表明
OTA存在植物毒性。细胞损伤或坏死过程中，通常会
发生细胞膜的破裂和染色体 DNA双链断裂或单链
断裂。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有细胞
图 3拟南芥基因组琼脂糖凝胶电泳
M：DNA maker；1：甲醇对照组；2：0.5 mol/L OTA处理 36 h的
拟南芥叶片
Figure 3 Electrophoresis of the DNA extraction from A. thaliana
obtained by CTAB method
M：DNA marker; 1：Leaves treated by methyl (CK); 2：Leaves
treated by 0.5 mol/L OTA for 36 h
图 2 OTA对拟南芥植物毒性的幼苗和叶片观察
A：甲醇对照；B：0.025 mmol/L OTA培养基发芽第 7天的拟南
芥幼苗；C：甲醇对照；D：0.5 mol/L OTA光下处理 48 h的拟南
芥叶片；E：发芽幼苗根长和鲜重随 OTA加入的变化
Figure 2 The toxicity observation of OTA in seedlings and leaves
of A. thaliana
A：Methyl-treated seedling (CK); B：Sprout on the substrate with
0.025 mmol/L OTA for 7 d; C：Methyl-treated leave; D：0.5
mol/L OTA-toxin-treated leave for 48 h in light; E：Changes in
the root length and weight of seedling with OTA-toxin-treated
图 4拟南芥叶片 Trypan blue染色显微镜观察（A，B）和 Evans
blue染色吸光值（C）
A：Trypan blue 染色空白对照组；B：0.5 mol/L OTA 处理 36 h
的叶片 Trypan blue染色；C：0.5 mol/L OTA处理 36 h的叶片
Evans blue染色 OD600值变化
Figure 4 Microscope photos of Trypan blue stained leave of A.
thaliana (A, B) and the value of OD600 after evans blue staining(C)
A：Control group; B：Leaves treated by 0.5 mol/L OTA for 36 h;
C：Value of OD600 leaves treated by 0.5 mol/L OTA for 36 h
图 5拟南芥叶片全蛋白双向电泳图
A：甲醇对照组；B：0.4 mmol/L OTA处理 10 h的拟南芥叶片
全蛋白；圆圈和箭头指向的点表示处理组蛋白下调表达
Figure 5 Two dimensional electrophoresis maps of A. thaliana
A：Two dimensional electrophoresis map without OTA treatment
(CK); B：Two dimensional electrophoresis map with OTA-
treated; The dots that the circle and the arrows pointed indicated
the proteins down regulated with OTA-treated
赭曲霉毒素 A（OTA）对拟南芥植物毒性的初步研究
PreliminaryStudyon theToxicityofOchratoxinA(OTA) forArabidopsis thaliana
A B C D
M 1 2
2000
1000
750
500
250
100
bp
A B
A B
0 h 36 h
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
OD
60
0/n
m
OTA胁迫时间 /Day
Time of OTA treated
C
0.5 mmol/L OTA
Control
根
长
/m
m
Ro
ot
le
ng
th
根长
Root length
鲜重
Fresh weight
幼
苗
重
/m
g
FW
Se
ed
in
g
w
ei
gh
t
25
20
15
10
5
0
0.025 mmol/L OTA
Control 25
20
15
10
5
0
E
1081
农业生物技术学报
Journal of Agricultural Biotechnology
膜完整性的破坏及 DNA的断裂，因而染料 Trypan
blue无法进入细胞内与断裂的 DNA结合，很少能够
被染色（Stone, 2000）。而损伤或死亡细胞则因为出现
细胞膜完整性破坏，DNA断裂而与染料结合，在显
微镜下能观察到明显的斑点。同时，DNA无规律的
断裂，伴有组蛋白降解，在琼脂糖凝胶电泳上呈模糊
的弥漫膜状条带。实验结果从分子水平说明发生细
胞死亡，证实 OTA存在植物毒性，但是否发生细胞
程序性死亡还需要进一步验证。
2.2双向电泳图表明 OTA植物毒性引起蛋白差异表达
由于植物组织自身蛋白质含量较低，含有较多
的色素，多酚等干扰物质，有些植物蛋白组分在两性
电解质中的溶解性又低，致使一般的双向电泳方法
无法得到分离效果较好的植物蛋白。我们改进了蛋
白提取方法，有效地去除干扰物质，如使用丙酮或甲
醇多次洗沉淀；提高蛋白溶解性，如加入两性电解
质，CHAPS，IPG buffer 或 CA等，增强蛋白质的溶
解。同时，拟南芥植物中高丰度蛋白 1，5-二磷酸核
酮糖羧化酶 /加氧酶(Rubisco)含量高,在进行双向电
泳时时形成一个弥散的条带区,覆盖了其周边许多
蛋白质点,致使可检测到的蛋白质点相对低，此时可
采取分级提取的方法去除高丰度蛋白，提高检测灵
敏度（Maldonado et al., 2008）。
通过 ImageMaster 2D platinum软件分析，本实
验发现 OTA胁迫处理导致拟南芥叶片全蛋白表达
发生了变化，这表明在受到 OTA胁迫下植物的抗逆
机制发挥作用，接受环境不利因子信号后，通过信号
转导过程调节细胞内抗逆相关蛋白的表达，进而调
整自身的生理状态或形态的改变来适应不利环境。
但是是何种抗逆蛋白，还需要进一步做胶内酶切，质
谱鉴定，在数据库中查到比对才能得出结论。
3 材料与方法
3.1材料
野生型拟南芥（Arabidopsis thaliana Columbia-
0），中国科学院遗传与发育中心赠送。种子表面灭菌后
播种在MS培养基上，发芽 5~6 d后，转移至蛭石和营
养土（3∶2比例）基质中，用塑料保鲜膜覆盖在幼苗上，1
周后去掉保鲜膜。培养条件是：22℃/16 h光照，8 h黑
暗，光照强度为 80μmol/s/m2。培养 4周后收获植株。
赭曲霉毒素 A（Ochratoxin A，OTA），赭曲霉菌种
（Aspergillus ochraceus 3.4412）为实验室保存。提取方
法为实验室所有。采用液液萃取的方法提取OTA，之
后进行两遍制备薄层层析，收集提取物，过高效液相色
谱（C18柱，吸收波长 333 nm，激发波长 403 nm）收集样
品。OTA溶于有机溶剂甲醇，放-20℃冰箱避光保存。
3.2主要仪器及试剂
荧光显微镜(OLYMPUS，Japan)；Ettan IPGphor等
电聚焦系统(Amersham Biosciences，USA)；凝胶成像
系统 ImageScaner (Amersham Biosciences，USA)；13
cm pH 3-10NL IPG干胶条、pH3-10NL IPG buffer、干
胶条覆盖液（矿物油）、Tris-base、尿素（Urea）、三氯乙酸
（TCA）、丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺购自 Amersham
pharmacia公司，美国；苯甲基磺酰氟（PMSF）、碘乙酰
胺、二硫苏糖醇（DTT）和硫脲购自 Sigma公司，美国；
牛血清白蛋白（BSA）、蛋白Maker购自上海生工。
3.3 方法
3.3.1 OTA纯度验证
OTA提取物溶于甲醇，过高效液相色谱 C18柱，
柱温 28℃，流动相乙腈∶水∶乙酸 =100∶100∶1，流速
1.00 mL/min，荧光检测器，吸收波长 333 nm，激发波
长 403 nm，上样量 20 μL。获得高效液相色谱图，根
据峰面积计算 OTA浓度和纯度。
3.3.2培养基配制和 OTA胁迫培养基处理
基本培养基：选用的是MS培养基。加入 2%蔗
搪和 0.8%琼脂粉，pH调至 5.7，经 121℃，15 min高压
灭菌，配制成固体培养基。
OTA胁迫值培养基：在基本 MS培养基凝固前
加入终浓度为 0.025 mmol/L的 OTA，其它条件同基
本培养基。
种子表面灭菌后播种在MS培养基上，22℃/16 h
光照，8 h黑暗发芽一周，竖直放置培养，观察生长情况。
3.3.3拟南芥离体叶片的 OTA胁迫处理
取培养 4周的拟南芥植株的健康叶片，沿叶基
部剪下。浸泡在含有 0.5 mol/L OTA的水中，对照浸
泡在相同含量甲醇的水中。16 h光照，8 h黑暗，光照
强度为 80 μmol/s/m2，放置 48 h，观察叶片变化。
3.3.4 DNA片段化
拟南芥离体叶片 OTA胁迫处理 36 h，对照浸泡
在相同含量甲醇的水中，具体步骤如 3.3.3。蒸馏水冲
洗干净，滤纸吸干。采用实验室改进的 CTAB裂解法
提取基因组（Swidzinski et al., 2002），1%琼脂糖凝胶
电泳，照相观察。
3.3.5细胞死亡染色
1082
叶片前处理如 3.3.3，光照 36 h。叶片投入 70℃
LPTB染液中（2.5 mg/mL Trypan blue，25%（W/V）乳
酸，23%水饱和酚，25%甘油，25% ddH2O），真空缓
慢渗透 5 min，再重渗透。沸水煮 2 min，冷却 1 h，吸
走 LPTB溶液，换水合氯醛（25 g/10 mL ddH2O）脱
色。多次换水合氯醛，然后样品在 70%甘油中平衡
数小时，显微镜观察照相（Bowling et al., 1997）。
叶片前处理如 3.3.3，光照 36 h。用打孔器取直径
8 mm叶盘 3片，中间切开，加 0.25% Evans blue染液
2 mL染色 5 h，取出加煮沸得乙醇脱色，换洗 3次，
显影蓝色沉淀。准确滴加 2 mL 1% SDS溶于 50%甲
醇的溶液，50℃保温 10 min后，取出叶片，紫外分光
光度计测 OD600（Hung et al., 2007）。
3.3.6叶片全蛋白提取
叶片前处理如 3.3.3。蛋白提取方法采用三氯乙
酸 /丙酮（TCA / acetone）沉淀法（Qin et al., 2007）和
BPP蛋白提取法（Wang et al., 2007）。样品溶解在蛋
白质裂解液 （lysis buffer：7 mol/L urea，2 mol/L
thiourea，4% CHAPS，2% pH3-10NL IPG buffer，1%
DTT）中。用 Bradford方法测定蛋白浓度,制备好蛋
白质样品冻存于-80℃待用。
3.3.7双向电泳
剥开固相 pH梯度(IPG)胶条(pH3-10NL，13 cm)保
护膜后,将 IPG胶条胶面朝下置于预先加好样品液的
聚焦槽凹槽中,矿物油覆盖后室温水化 15 h (水化上样
400 μg)后进行等电聚焦电泳,在等电聚焦时设置参数：
20℃，50 μA/strip；Step 500 V 500 Vh；grad 1 000 V 800
Vh；grad 8 000V11 300Vh；step 8 000V7400Vh。
胶条平衡参照 Finnie等（2002）报道的方法，先用
含 1% DTT的平衡液平衡 15 min，再用含 2.5% IAA
的平衡液平衡 15 min。第二向为垂直 SDS- PAGE电
泳。考马斯亮蓝（0.16% CBB R-250）胶体染色。
凝胶的扫描使用 ImageScaner 5.0，设置参数为透
射模式。数据分析使用 ImageMaster 2DPlatinum 5.0软
件，调整图像对比度，设置参数 Smooth=3，Saliency=
100.000，MinArea=6，并对个别点进行手动编辑。
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赭曲霉毒素 A（OTA）对拟南芥植物毒性的初步研究
PreliminaryStudyon theToxicityofOchratoxinA(OTA) forArabidopsis thaliana 1083