全 文 ：基因组学与应用生物学，2009年，第 28卷，第 3期，第 465-470页
Genomics and Applied Biology, 2009, Vol.28, No.3, 465-470
研究报告
Research Report
花粉管通道法介导的真菌耐盐基因转化拟南芥
郑鹏 谭德冠 孙雪飘 张家明 *
中国热带农业科学院,热带生物技术研究所,农业部热带作物生物技术重点实验室,海口, 571101
*通讯作者, jmzhang@vip.163.com
摘 要 橡胶树内生真菌 ITBB2-1具有很强的抗盐性，在培养基中添加 2倍海水盐度的 NaCl能显著促进
菌落的生长。采用两种方法研究利用花粉管通道法将 ITBB2-1耐盐基因导入拟南芥。多数耐盐转基因植株
畸形，生长发育不正常。通过对一千两百余株转基因植株的筛选，获得了耐盐性显著提高、生长发育正常的转
基因植株 3个。对主要农艺性状统计分析发现，转基因植株叶片的长度、宽度和面积均比野生型植株小，差异
达极显著水平。转基因植株 SR3的角果长度仅为野生型的 64.5%，SR1和 SR2的角果长度与野生型无显著
差异。本研究表明，在真菌耐盐机制尚未得到研究和耐盐基因尚未克隆的情况下，可以采用花粉管通道法将
其耐盐特性导入高等植物中。
关键词 花粉管,拟南芥,抗盐基因,真菌 ITBB2-1
Fungus Salt Resistance Gene into Arabidopsis by Pollen-Tube Pathway
Zheng Peng Tan Deguan Sun Xuepiao Zhang Jiaming *
Key Laboratory of Tropical Crop Biotechnology, Ministry of Agriculture, Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology, Chinese Academy of
Tropical Agricultural Sciences, Haikou, 571101
* Corresponding author, jmzhang@vip.163.com
DOI: 10.3969/gab.028.000465
Abstract The endobiotic fungus ITBB2-1 isolated from rubber tree has strong salt resistance, its growth was
promoted by the addition of as high concentration of NaCl as 2 folds of the salt concentration of the sea water.
Two methods were served to introduce the salt resistance gene from ITBB2-1 to Arabidopsis through pollen tube
pathway. Most of the transgenic plantlets were deformed with abnormal growth and development. Three transgenic
plants with normal growth and development were obtained through screening of 1 200 transgenic plantlets. These
plants were found to be resistant to 0.17 mol/L (1%) of NaCl in the soil. Phenotypic variations of the transgenic
plants were observed, including narrower and longer leaves, and smaller leaf surface area. One transgenic plant
SR3 has short siliques with only 64% of the length of the wild type, while the other two plants have siliques of nor-
mal sizes. All the transgenic plants yielded normal seeds. The results demonstrated that salt characteristic of fungi
can be introduced into higher plants by pollen tube mediated transformation before the understanding of the salt re-
sistant mechanism and before the cloning salt resistant genes.
Keywords Pollen-tube, Arabidopsis thaliana, Salt-resistance gene, Fungus ITBB2-1
www.genoapplbiol.org/doi/10.3969/gab.028.000465
基金项目：本研究由中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金资助项目(ITBBZD2007-1-1)和国家自然科学基金项目
(30260062)共同资助
近年来，通过基因工程技术手段已将耐盐基因
转入到植物中，培育出具有耐盐特性的植物品系，并
对其分子细胞水平的耐盐机制、植物生理已有广泛
的研究。Tarazynski等(1993)首次报道用基因工程手
段可以提高转基因植物的耐盐性，并从 Escherichia
coli中分离出的 1-磷酸甘露醇脱氢酶基因(mtlD)转
化烟草，使转基因植物产生并积累甘露醇(而转化的
对照未检测到)。Apse等(1999)在拟南芥中超量表达
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
www.genoapplbiol.org
DOI: 10.3969/gab.028.000465
AtNHX1基因提高了植物的耐盐性，并对番茄和油菜
进行转化，得到了可在 200 mmol/L NaCl条件下正常
生长结实的转基因植株，获得了世界第一批真正意义
上的耐盐作物(Zhang et al., 2001)；Kumar等(2004)通
过质体转化法使 BADH基因在胡萝卜中表达获得了
可在 400 mmol/L NaCl条件生长的转基因植株，此时
野生型植株已经无法存活，这是目前已知转基因植物
所能耐受最高盐浓度。利用转基因手段获得耐盐转基
因植株，关键是获得具有耐盐性状基因，随着分子生
物学的发展，通过表达序列标签(EST)、cDNA微阵列
技术和分子标记等技术的运用，分离耐盐基因已经变
得更容易了。但植物耐盐性是由多基因控制的，单一
耐盐基因导入受体植物，并使其表达还存在着障碍。
花粉管通道法是由我国学者周光宇等(1979)首
先提出的植物分子育种方法，是指授粉后利用花粉
管的通道使外源 DNA导入植物卵细胞、合子或早期
胚细胞的技术(王艳杰和申家恒, 2006)。与其它转基
因技术相比，花粉管通道法具有变异率高，稳定快，
操作简便经济等优点，受到育种学家的青睐。
目前，我国利用花粉管通道法转基因技术已成
功应用于蔬菜、棉花、大豆、水稻等经济作物，并培育
出一批具有经济价值、稳定遗传的品系(马盾等, 2005;
崔岩等, 2003;赵凌等, 2003;郭亚华等, 1995;王浩波
等, 2002)。近几年来，随着气候变化和环境污染加剧，
土壤盐渍化也日益增加。因此，尽快培育出耐盐作物
已成为当前紧迫的任务。
利用花粉管通道技术进行遗传转化，其供体多
数为植物总 DNA、含有耐盐基因的质粒或经过人工
改造的农杆菌对植物进行转基因操作，进而获得具
有特定性状的转基因植株(Pozueta-romero et al., 2001;
Frary and Earle, 1996; 刘化龙等 , 2008; 陈国庆等 ,
2005)。本研究通过花粉管通道法将具有高耐盐性的
内生真菌 ITBB2-1总 DNA导入拟南芥中，获得了
耐盐性显著提高的转基因后代。
1材料与方法
1.1试验材料
供试的内生真菌 ITBB2-1 为本实验室分离获
得，其形态学和分子生物学鉴定文章待发表；本试验
所使用的拟南芥生态型为 Col-0，由本实验室保存。
1.2耐盐真菌 ITBB2-1总 DNA的提取
真菌 DNA提取采用 CTAB法(阳义健等, 2006)
稍做修改。将生长于马铃薯液体培养基中的菌体
(28℃,静置培养 10 d)用镊子夹出，用滤纸吸干水分，
将菌体于液氮预冷的研钵中，加入石英砂和液氮，磨
成细微干粉末然后用 DNA抽提缓冲液[(2% CTAB
(W/V); 100 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0); 20 mmol/L ED-
TA (pH 8.0); 1.4 mol/L NaCl; 2% PVP (V/V); 1% β-巯
基乙醇(V/V)]提取。然后用等体积的酚:氯仿:异戊
醇(24:24:1)抽提并离心。上清液用异丙醇沉淀。将
提取的 DNA用紫外分光光度计检测，其值为 2.0>
A260/A280>1.8。
1.3内生真菌 ITBB2-1耐盐性测定
将待鉴定的真菌孢子接种在含 NaCl 0.2 mol/L、
0.6 mol/L、1.0 mol/L、2.0 mol/L、3.0 mol/L、5.0 mol/L
的马铃薯固体培养基中，于室温静置培养 15 d，每隔
3 d观察并记录菌落在不同盐浓度下直径大小，每个
处理重复 3次。
1.4花粉管介导外源真菌 DNA导入拟南芥
用两种不同的方法将外源真菌总 DAN导入拟南
芥：(1)选取拟南芥当日植株，授粉 0.5 h后，用细毛笔
蘸取真菌 ITBB2-1的总 DNA溶液涂抹在拟南芥柱
头上，肉眼可见柱头上有液滴即可；间隔 1 h，再重复
涂抹 1次。(2)选取拟南芥当日植株，授粉 0.5 h后，用
刀片将柱头切去，然后用细毛笔蘸取真菌 ITBB2-1
的总 DNA溶液涂抹拟南芥的柱头上，肉眼可见柱头
上有液滴即可；间隔 1 h，再重复涂抹 1次。转基因操
作于拟南芥开花期每天上午 8:00~11:00进行。
1.5野生型拟南芥种子的耐盐梯度实验
将野生型拟南芥种子用 75%乙醇浸泡数秒，吸出
上清液，用无菌水清洗 2次，吸出无菌水，再用 5%的次
氯酸钠溶液浸泡 6~8min，最后用无菌水冲洗 5次。将
消毒后的野生型拟南芥种子分别点播于含 NaCl 0、
0.086 mol/L (0.5%)、0.17 mol/L (1%)、0.26 mol/L (1.5%)
的MS培养基上，4℃放置 3 d后转到培养室培养。培养
温度 20℃，光照 8 h，光照强度 5 000Lx。
1.6转基因种子的获得及 T1农艺性状的比较
导入的当代为 T0，将获得的转基因种子消毒后，播
种在含 0.17mol/L (1%)NaCl的MS培养基上，4℃放置
3 d后转到培养室培养。培养温度 20℃，光照 8 h/d，光
照强度 5 000 Lx，筛选出抗盐转基因植株后，将幼苗转
至营养土中生长，培养温度 20℃，每天光照 16 h，并继
续喷施 0.17 mol/L (1%)的 NaCl水溶液。调查并统计
466
T1植株的叶片长度、宽度、叶面积、角果长度等农艺
性状。
2结果与分析
2.1内生真菌 ITBB2-1的抗盐性验证
ITBB2-1是本实验室从橡胶树中分离的一株抗盐
真菌。本研究进一步验证了其抗盐特性。结果表明，在
PDA培养基中添加 0.2~1 mol/L的 NaCl显著促进该
菌的生长(图 1)。不过，提高NaCl浓度至 2mol/L，菌落
的生长开始受到抑制。当 NaCl浓度提高到 5 mol/L
时，菌落生长被完全抑制。
2.2野生型拟南芥的耐盐性
将野生型拟南芥种子分别点播于含 NaCl为 0、
0.086 mol/L (0.5%)、0.17 mol/L (1%)、0.26 mol/L (1.5%)的
MS培养基上培养 30 d左右，研究拟南芥的耐盐性
(图 2A)。结果表明，添加 0.086 mol/L (0.5%) NaCl的
MS培养基与不添加 NaCl的MS培养基相比，野生
型拟南芥幼苗叶片较狭长，植株更粗壮，但总的生长
抑制作用不明显(图 2B)。在含 0.17 mol/L (1%) NaCl
图 1 NaCl对菌株 ITBB2-1生长的影响
注:菌株在添加不同浓度 NaCl的 PDA培养基上培养 15 d菌
落的直径
Figuer 1 Effects of NaCl to the growth of ITBB2-1
Note: The colonies were grown for 15 days on PDA plates con-
taining different concentration of NaCl, the diameters of colonies
were given in cm
的 MS培养基上，大多数拟南芥种子不能发芽，已发
芽的小苗生长缓慢，真叶发育受阻，根十分微小，叶
片淡绿色至黄色，有些苗完全白化(图 2C)。在添加
0.26 mol/L (1.5%) NaCl的MS培养基上培养 30 d，野
生型拟南芥种子不能发芽，或仅长出白色子叶(图 2D)。
据此，本试验确定在 MS培养基中添加 0.17 mol/L
(1%) NaCl作为转基因植株的筛选培养基。
2.3 花粉管介导真菌抗盐基因转化拟南芥两种方法
比较
采用了两种方法进行转化。第一种方法是直接
将真菌基因组 DNA用细毛笔涂抹在拟南芥柱头上；
第二种方法是先将柱头剪去，再涂抹真菌 DNA。比
较了两种方法的转化效率(表 1)。使用第一种方法，
拟南芥角果成熟后，其形状与野生型(CK)角果一样，
无明显区别。共转化 6 147朵花，获得约 122 940粒
种子，在含 0.17 mol/L (1%)的 NaCl的 MS培养上共
发芽 734株，转化率为 0.60%。采用第二种方法转化，
成熟角果比野生型(CK)角果短，顶部有明显切痕。共
转化 4 194朵花，获得约 83 880粒种子。含 0.17mol/L
(1%) NaCl 的 MS培养上共发芽 467 株，转化率为
0.56%。两种方法转化率差异不显著。
用两种方法获得的转基因植株在含 0.17 mol/L
(1%) NaCl的MS培养基上继续培养，随着培养时间
的延长，多数幼苗慢慢长成畸形(图 3A)，有些幼苗
虽然能长成较大的植株，并且开花结实，但叶片也
是畸形，角果和根短小(图 3B; 图 3C)，所收获的种
子不能发芽。
选择生长健壮的幼苗，移栽到营养土中，浇含
0.17 mol/L (1%) NaCl的水进行再次筛选。通过复筛，
一些假阳性的苗在含 0.17 mol/L (1%) NaCl 的土壤
中死亡。通过对一千二百余转基因植株的筛选，最终
获得 3株生长发育正常的耐盐植株(图 3D;图 3E;图
3F)，其中 2株来自第一种转化方法，1株来自第二种
转化方法。
花粉管通道法介导的真菌耐盐基因转化拟南芥
Fungus Salt Resistance Gene into Arabidopsis by Pollen-Tube Pathway
表 1两种花粉管介导方法转化拟南芥的效率比较
Table 1 Effeciency of two pollen-tube-mediated Arabidopsis transformation methods
处理
Trentment
方法 1
Method 1
方法 2
Method 2
处理花朵数
Treatment on
flowers
6 147
4 194
种子数
No. of
seed
122 940
83 880
发芽数
No. of
Germination
734
467
转化率(%)
Transformation
efficiency (%)
0.60
0.56
正常转基因植株数
No. of normal
transgenic plants
2
1
467
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
图 3用花粉管通道法转化获得的转基因耐盐拟南芥植株
注: A:在选择培养基上不能长大的畸形苗; B:根系生长不正
常的畸形苗 ; C: 开花结实但所获得种子不能发芽的植株 ;
D~F:生长发育正常的耐盐转基因植株
Figuer 3 Salt resistant transgenic plants obtained from introduc-
tion of ITBB2-1 salt resistant gene
Note: A: Malformed seedlings that could not grow big; B: A
seedling with short roots; C: A seedling with seeds failed to ger-
minate; D~F: Transgenic plants with normal morphology
虽然两种方法的转化率差异不显著，但是，方法
1获得生长发育正常的转基因苗的效率比方法 2的
高，可能是方法 2切割柱头对子房有一定的损伤，影
响了种子发育。方法 2既费工费时，转化效率又较差，
因此，用花粉管通道法进行拟南芥外源基因组 DNA
的转化时，以直接涂 DNA到柱头上的方法较好。
2.4转基因植株的表型
3 个发育正常的转基因植株在含 0.17 mol/L
(1%) NaCl的土壤中都正常开花结实。对其株高、叶
面积、角果大小进行了统计分析，结果表明 3个转基
因植株叶片长度、宽度和叶面积都比野生型植株小，
差异极显著水平(表 2)。转基因植株 SR1和 SR2 (来
自直接涂花柱)的角果长度与 CK的角果长度差异不
显著，SR3 (花柱切后涂花柱)的角果长度仅为野生型
的 64.3%，差异达极显著水平(表 2)。转基因植株表型
变异的原因可能与外源基因的表达有关，也可能是
外源基因在整合进拟南芥基因组后，抑制了受体中
某些基因的表达。
3讨论
外源总 DNA的花粉管通道转化法不需要克隆
目的基因，构建表达载体，是一种快速将目标性状导
入受体植物的遗传转化方法。庄东红等(2005)利用花
粉管通道法将海滩盐生植物秋茄总 DNA和海边月
见草总 DNA导入花生，获得具有一定耐盐性状并可
遗传的转基因花生。林栖凤等(2001)将海滩耐盐植物
红树 DNA经花粉管通道导入茄子，使茄子的耐盐性
明显增强。Luo和Wu (1989)将含报告基因的质粒导
入作物，经 Southern杂交，证实报告基因整合到受体
基因组中。在本研究中，我们将耐盐性强的内生真菌
ITBB2-1总 DNA导入拟南芥，获得了具有耐盐性的
转基因拟南芥植株；为耐盐植物分子育种提供了一
条新的途径。
花粉管通道技术有不同的导入方法 (Pandey,
1975;张孔湉等, 1982;赵炳然和黄见良, 1998;常利
图 2拟南芥的耐盐性
注:在MS培养基中添加 NaCl: A: 0; B: 0.086 mol/L (0.5%); C:
0.17 mol/L (1%); D: 0.26 mol/L (1.5%);在 20℃, 6 h每天光照条
件下培养 30 d的生长情况
Figuer 2 Salt tolerance of Arabidopsis
Note: Seeds of Arabidopsis were sown on MS medium containing
NaCl:A:0;B: 0.086 mol/L (0.5%);C: 0.17mol/L (1%);D: 0.26mol/L
(1.5%); cultured for 30 d at 20℃, with a photoperiod of 16 h per
day
表 2拟南芥转基因植株与野生型拟南芥植株农艺性状比较
Table 2 Characteristics of Arabidopsis transgenic plants compared with wild type
编号
Serail No.
CK
SR1
SR2
SR3
平均叶长±SD (cm)
Average leaf
length±SD (cm)
3.2±0.14
2.3±0.12
2.4±0.37
1.7±0.48
平均叶宽±SD (cm)
Average leaf
width±SD (cm)
1.8±0.08
1.5±0.15
1.5±0.15
1.3±0.27
平均叶面积±SD (cm2)
Average leaf
area±SD (cm2)
4.90±0.37
2.90±0.34
3.13±0.67
1.90±0.54
平均角果长±SD (cm)
Average silique length
±SD (cm)
1.4±0.08
1.4±0.12
1.2±0.18
0.9±0.13
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DOI: 10.3969/gab.028.000465468
花粉管通道法介导的真菌耐盐基因转化拟南芥
Fungus Salt Resistance Gene into Arabidopsis by Pollen-Tube Pathway
芳等, 2003)，本研究采用两种不同的方法进行转基
因操作，都获得了转基因植株，花柱切涂花柱，费
时，技术要求高，而直接涂花柱，快，简单，技术要求
低。然而，直接涂花柱获得获得正常转基因植株的
效率却要高于切柱头的转化方法。其原因可能是切
花柱导致子房损伤，影响种子发育。在涂花柱的过
程中，以肉眼可以看到花柱上有液滴为止。涂 DNA
的时机较为重要，导入过早，花粉管还未伸长或未
到达胚珠，DNA溶液中的水分蒸发会大大降低导入
效率(刘芳等, 2007)。一般在授粉后 0.5 h后开始进
行转化。这样有利于真菌总 DNA有更多的机会通
过花粉管通道进入子房。
植物耐盐性机制十分复杂，是一种数量性状，受
多基因控制(Serrano and Gaxiola, 1994)。研究表明,耐
盐基因的表达非常复杂,受到低温、干旱、热激、ABA
等多种环境条件的诱导(Shiozaki et al., 2005)。随着
分子生物学技术的发展，一些先进的研究手段，如
DNA微点阵分析、定位克隆、mRNA差异显示等，用
于克隆植物耐盐相关基因、研究植物耐盐机制(Ka-
suga et al., 1999)。在目前识别和分离耐盐基因以及
同时操作多个基因尚有困难的情况下，采用总 DNA
转移的方法，有可能同时导入多个基因，达到耐盐植
物分子育种的目的(林栖凤等, 1999)。本试验通过花
粉管通道法将具有高耐盐性的内生真菌 ITBB2-1总
DNA转移到拟南芥植物中，通过对一千二百余株转
基因植株的筛选，最终获得 3株具有耐 0.17 mol/L
(1%) NaCl的拟南芥植株。虽然转化率非常低，但我
们提供了一条获得耐盐转基因植株的新途径。
拟南芥是植物生物学研究的最好的模式植物，
被称为植物界的“果蝇”(Alonso-Blanco and Koorn-
neef, 2000)，并且拟南芥的基因组序列已经清楚(Wis-
man et al., 1998)，因此，本研究中筛选出来的具有耐
盐性状的拟南芥转基因苗，对其进行深入分析和研
究将是非常有价值的。
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