全 文 ：第 36 卷　第 4 期 西北农林科技大学学报(自然科学版) Vol.36 No.4
2008 年 4 月 Journal of No rthwest A&F Univer sity(Na t.Sci.Ed.) April 2008
拟南芥热激转录因子 AtHsf A6a的克隆
与细胞定位分析＊
晁　旭1 ,巩振辉1 ,逯明辉1 ,马　超1 ,李大伟1 ,赵　军2 ,孟长军1
(1 西北农林科技大学 园艺学院 ,陕西 杨凌 712100;2 中国农业科学院 生物技术研究所 ,北京 100081)
[ 摘　要] 　【目的】研究拟南芥热激转录因子 At Hs f A6a 在植物细胞中的定位及其作用机制。【方法】用 RT-
PCR方法从野生型拟南芥总 RNA 中 ,扩增获得了 849 bp的拟南芥热激转录因子 AtH sf A6a cDNA 片段 , 经过测序 ,
结果与公布的序列完全相同。将该片段与绿色荧光蛋白(GFP)基因的 cDNA 重组 , 并克隆到表达载体 pCH F3 上 , 经
PCR与酶切检测表明构建的表达载体正确。按照 Clough 等的方法转化拟南芥 ,经 Kanamycin 筛选和 PCR 检测 , 得
到转基因植株;用激光共聚焦扫描荧光显微镜观察转基因植株幼苗的根部。【结果】在正常条件下 , 融合蛋白存在于
细胞质中。【结论】在正常条件下拟南芥热激转录因子 AtH sf A6a 在细胞质中表达。
[ 关键词] 　拟南芥;热激转录因子;绿色荧光蛋白;细胞定位分析
[ 中图分类号] 　Q785 [ 文献标识码] 　A [ 文章编号] 　1671-9387(2008)04-0094-05
Cloning and analysis of cellar locat ion of the Arabidopsis
heat transcriptional factor AtHsfA6a
CHAO Xu
1 ,GONG Zhen-hui1 , LU Ming-hui1 ,M A Chao1 ,
LI Da-wei1 ,ZHAO Jun2 ,M ENG Chang-jun1
(1 Co llege o f Hor ticu lture , Nor thwest A ﹠F Un iver sity ,Yangl in g , Shaan xi 712100 , Ch ina;
2 Biotechnology R esearch Inst itute , Chinese Academ y o f Ag ricul tu ral S ciences , Bei j ing 100081 , Ch ina)
Abstract:【Objective】T he rsearch studied the lo cation of the Arabidopsis heat shock transcriptional
facto r AtHsf A6a in the plant cel l and its mechanism.【Method】The cDNA fragment of the Arabidopsis
heat shock transcriptional facto r AtHsfA6a ,whose length was 849 bp ,was cloned by one-tube RT-PCR re-
action wi th specif ic primers f rom Arabidopsis Columbia.It s sequence w as the same as the published se-
quence.After the cDNA fragment w as conf irmed by the sequence test , it w as subsequently combined w i th
green fluo rescent pro tein (GFP)gene , then cloned to expression vecto r pCHF3 transgenic Arabidopsis
lines containing pCHF3-AtHsf A6a-GFP const ruct w ere generated through ag robacterium-mediated genetic
t ransfo rmation and obtained transgenic Arabidopsis plant through kanamycin select ion and PCR test.Then
the roots of t ransgenic Arabidopsis plant w ere observed through lase r scanning confocal fluo rescence mi-
croscop.【Result】The fusion protein lies in the cytoplasm under the ordinary condition.【Conclusion】Under the
ordinary condition , the Arabidopsis heat t ranscriptional factor AtHsf A6a expresses in cy toplasm o f cell.
Key words:Arabidopsis;heat shock transcriptional facto r;green fluorescent protein(GFP);analy sis of
cellar location
＊ [ 收稿日期] 　2007-04-25
[ 基金项目] 　国家重点基础研究发展规划项目(2004CB117200)
[ 作者简介] 　晁　旭(1974-),男 ,陕西周至人 ,硕士 ,主要从事植物生物技术研究。 E-mail:chaoxu 2004@126.com
　　植物受到自然界中干旱 、高温 、盐渍 、氧化等非
生物胁迫的侵袭时 ,会积极调动体内的防卫系统来
对抗外来逆境 。在高温胁迫下 ,植物会发生热激反
应(Heat shock response , HSR)[ 1] 。热激反应是一
种高度保守的反应 , 能诱导植物产生热激蛋白
(Heat shock pro teins ,Hsps),而热激蛋白可以作为
分子伴侣维持其他蛋白质在高温下正常的功能[ 2] ,
这类热激蛋白能提高植物的耐热性[ 3] 。热激蛋白基
因的转录受热激转录因子(Heat shock transcrip-
tional factors ,Hsfs)的调控[ 4] 。Hsfs 在热激反应中
的主要功能是在热休克基因表达过程中与相应启动
子结合 ,启动热休克基因的转录 ,最终促使 Hsps 表
达[ 5] 。Hsfs 在细胞质中为单体 ,处于非活化状态 ,
受到胁迫时形成三聚体 ,并转入核内结合到相应的
热激蛋白启动子区的目的序列(HSE),从而激活热
激蛋白基因的表达[ 6] 。综上所述 , Hsfs 在联系热胁
迫信号转导和耐热基因表达方面具有重要作用 。目
前 ,有关植物热激转录因子的研究主要集中于番茄
HsfAla 、HsfA2 和 HsfB1[ 3] ,而在拟南芥中对 H sfs
的研究还很少[ 7] 。李春光等[ 8] 研究发现 ,拟南芥热
激转录因子 AtHsfA2 调节胁迫反应基因的表达并
参与抗热和抗氧化胁迫 ,为抗热研究提供了理论依
据。但有关拟南芥热激转录因子 A tHsfA6a 的具体
功能和作用机制尚未见报道。本试验克隆了拟南芥
热激转录因子的 cDNA AtHsf A6a ,构建了 A tHs-
fA6a 和 GFP 融合基因的表达载体并转化拟南芥 ,
旨在分析拟南芥热激转录因子 A tHsfA6a在细胞中
的表达 ,探讨其在热激反应中的功能及其可能的作
用机理 ,为抗逆分子育种提供理论依据 。
1　材料与方法
1.1　材　料
1.1.1　植物材料 　供试野生型拟南芥(Co lumbia
型)种子 ,由中国农业科学院生物技术研究所提供 。
1.1.2 　菌株和质粒 　大肠杆菌 DH5α、农杆菌
GV3101 、质粒载体 pCHF3 ,均为本实验室保存。
1.2　方　法
1.2.1　野生型拟南芥总 RNA 的提取　将供试野
生型拟南芥种子经表面灭菌后 ,播种于含有 15 g/L
蔗糖的 1/2M S 培养基中 , 4.0 ℃处理 2 d 后 ,置于
22 ℃下光照 16 h , 20 ℃下黑暗 8 h ,相对湿度 70%
的光照培养箱中培养 。苗龄 3 周时 ,将其在 37 ℃±
0.3 ℃下热激处理 1 h 后 ,立即用 TRIzol reagent
(Invi tro gen 公司)提取试材的总 RNA 。
1.2.2　RT-PCR及测序　cDNA 第一链的反转录
反应用 ReverTra A ce-α-(TOYOBO 公司)试剂盒
完成。PCR反应所用的 AtHsf A6a 基因特异性引
物为:正 向 引 物 5′-A TGGA TTA TAACCT TC-
CAA T-3′;反向引物 5′-T TA TATAAAA TGT TC
CACTA-3′。
PCR 反应总体积为 20 μL ,其中含 1×反应缓
冲液 , 0.2 mmol/ L dNTPs , 0.25 μmol/ L 正向引物
和 0.25 μmo l/L 反向引物 , 1.0 U Taq DNA 聚合
酶 ,模板 cDNA 1.0 μL 。反应条件为:94 ℃预变性
5 min;94 ℃变性 40 s ,45 ℃退火 40 s , 72 ℃延伸 50
s ,35 个循环;最后 72 ℃延伸 5 m in。
PCR 产物经 1%琼脂糖凝胶电泳 , 然后按
TIANGEN 公司的琼脂糖凝胶 DNA 回收 Kit 说明
书进行 PCR 扩增产物的回收与纯化。回收的 PCR
扩增片段与克隆载体 pGEM ? -T Easy Vector 在 T4
DNA 连接酶的作用下 ,于 4 ℃连接过夜。连接产物
转化感受态 E.coi l DH5α,涂在含有 x-gal+IPTG+
Amp 的 LB 平板上 , 37 ℃过夜 ,挑取白色克隆 ,在含
Amp 的 LB培养液中摇菌 ,然后由北京奥科生物技
术公司测序 。
1.2.3　野生型拟南芥表达载体的构建　分别设计
含 BamH Ⅰ和 Xba Ⅰ限制性内切酶位点的 A tHs-
f A6a的 PCR 引物 ,及含 Xba Ⅰ 、Sal Ⅰ限制性内切
酶位点的 GFP 的 PCR 引物 。 AtHsf A6a 正向引
物:5′-CGC GGA TCA TGG AT T A TA ACC T TC
CAA TT-3′;反向引物:5′-CGG TCT AGA TA T
AAA A TG TTC CAC TAA A TC-3′;GFP 正向引
物 :5′-CGC TCT AGA A TG AGT AAA GGA
GAA GAA CT-3′;反向引物:5′-CCG G TC GAC
T TA T TT GTA TAG T TC A TC CA-3′。分别以
pGEM? -T Easy-AtHsf A6a 和 pGEM ? -T Easy-
GFP 质粒为模板进行 PCR扩增。按 TIANGEN 公
司的琼脂糖凝胶 DNA 回收 Kit 说明书进行 PCR扩
增产物的回收与纯化 ,回收的 PCR 扩增片段分别连
接到克隆载体 pGEM ? -T Easy Vecto r 上。转化感
受态 E.coi l DH5α,涂在含有Amp 的 LB 平板上 ,37
℃过夜 ,挑取阳性克隆 ,在含 Amp 的 LB 培养液中
摇菌 ,按照碱裂解法[ 9] 进行质粒的小量提取。提取
的 T-Easy-A tHsf A6a 质粒用 BamH Ⅰ和 Xba Ⅰ酶
切 , 回收大片段 。 T-Easy-GFP 质粒用 Xba Ⅰ和
SalⅠ酶切 ,回收小片段。然后将回收的小片段与大
片段在 T4 DNA 连接酶的作用下 4 ℃连接过夜 ,连
接产物转化感受态 E.coi l DH5α,涂在含有 Amp 的
95第 4 期 晁　旭等:拟南芥热激转录因子 AtHs f A6a 的克隆与细胞定位分析
LB 平板上 ,37 ℃过夜 ,挑取阳性克隆 ,在含 Amp 的
LB 培养液中摇菌 ,进行质粒的小量提取 。提取的质
粒用 BamH Ⅰ和 Sal Ⅰ酶切 , 回收小片段;同时用
BamH Ⅰ和 Sal Ⅰ酶切质粒载体 pCHF3 ,回收大片
段。然后将回收的小片段与大片段在 T4 DNA 连
接酶的作用下 4 ℃连接过夜 ,连接产物转化感受态
E.coi l DH5α,涂在含有 Amp 的 LB 平板上 , 37 ℃
过夜 ,挑取阳性克隆 ,在含 Amp 的 LB培养液中摇
菌 ,提取质粒 ,然后进行 PCR和酶切检测 。
1.2.4　农杆菌转化与野生型拟南芥的转化　将经
过鉴定的 pCHF3-AtHsf A 6a-GFP 质粒用热激法转
化农杆菌 GV3101 ,涂布于含壮观霉素(100 mg/mL)
的 YEP 平板上 ,挑取阳性克隆 ,在含壮观霉素的 YEP
培养液中 28 ℃摇菌 ,然后提取质粒进行 PCR 和酶切
检测。按照 Clough等[ 10]的方法转化拟南芥。
1.2.5　转基因拟南芥的 PCR检测　以转基因拟南
芥叶片为材料 ,采用 SDS 法提取基因组 DNA 。检
测转基因拟南芥所用的 PCR引物为:5′-TAA GGA
AG T TCA TT T CAT T TG GA-3′和 5′-GTC GAC
T TA A T T TG T A TA G TT CAT CCA-3′。反应
条件:94 ℃预变性 5 min;94 ℃变性 30 s , 50 ℃退
火30 s ,72 ℃延伸 100 s ,35个循环;最后 72 ℃延伸
5 min。
1.2.6　融合蛋白的观察　转化当代植株(T 0 代)收
获的种子用 1/2M S+50 mg/L Kanamycin 平板筛
选 ,10 d 后挑选 T 1 代阳性植株转移到穴盘中 ,PCR
鉴定并收获种子 。收获的种子用 1/2MS+50 mg/L
Kanamycin 平板筛选 , 6 d 后挑选 T 1 代阳性植株 ,
用超纯水冲洗根部后用荧光共聚焦显微镜观察。
2　结果与分析
2.1　拟南芥热激转录因子 AtHsf A6a cDNA的克隆
以拟南芥的 RNA 为模板通过一步法 RT-PCR
扩增得到 849 bp 的片断 ,条带单一 、清晰(图 1)。
图 1　RT-PCR扩增的 At Hs f A6a cDNA 片断
M.100 bp DNA M arker;1.AtH s f A6a 的 cDNA 片断
Fig.1　cDNA f ragment o f At Hs f A6a amplified by RT-PC R
M .100 bp DNA Marker;1.Th e cDNA fragm ent of A tHs f A 6a
2.2　野生型拟南芥表达载体的 PCR与酶切检测
用 BamH Ⅰ和 SalⅠ双酶切重组大肠杆菌的质
粒载体(图 2A),得到约 1 570 bp 的片断 ,符合酶切
图谱;同时以重组大肠杆菌的质粒为模板 , 进行
PCR 检测 ,结果扩增出约 1 600 bp 的片断 ,与预期
片段大小相同(图 2B),表明构建的表达载体正确。
图 2　野生型拟南芥表达载体的酶切(A)与 PC R检测(B)结果
A:M.100 bp DNA Marker;1.未酶切的表达载体;2.BamH Ⅰ和 Sa lⅠ双酶切的表达载体;
B:M.100 bp DNA Mark er;1.对照;2.PCR扩增出的片断
F ig.2　Identifica tion of expression vector of AtH sf A6a by restriction enzyme digestion(A)and PCR(B)
A:M.100 bp DNA Marker;1.Undiges ted recombinant plasmid;2.Expression vector diges ted b y B amHⅠ andSa lⅠ ;
B:M.100 bp DNA Marker;1.C on t rol;2.PCR produ ct
96 西北农林科技大学学报(自然科学版) 第 36 卷
2.3　转基因拟南芥的 PCR检测结果
图 3 表明 ,转基因拟南芥的 PCR 产物片段大小
均与预期相符 ,表明获得了转基因株系 ,可用于进一
步分析。
2.4　拟南芥热激转录因子 A tHsfA6a的细胞定位
分析
在荧光共聚焦显微镜下可以观察到绿色荧光蛋
白(呈绿色)。由于 At Hs f A6a 和GFP 形成的融合
基因在 35S 强启动子的作用下共表达 ,所以观察到
的绿色部分为 A tHsfA6a和 GFP 形成的融合蛋白
(图 4)。从图 4 可以看到 ,拟南芥热激转录因子
AtHsfA6a和 GFP 形成的融合蛋白存在于细胞质
中 ,从而证明拟南芥热激转录因子 A tHsfA6a 在细
胞质中表达。
图 3　转基因拟南芥的 PCR检测
1.1 000 bp DNA M ark er;+CK.重组质粒的 PCR产物 ;
-CK.野生型;2～ 6.转基因拟南芥的 PCR产物
F ig.3　Identifica tion of t ransgenic plant by PCR
1.1 000 bp DNA Marker;+CK.PCR product of recombinant plasmid;
-CK.w ild type plant;2-6.PCR product of t ran sgenic plan ts
图 4　正常条件下拟南芥热激转录因子 At Hsf A6a 在细胞质中的表达
Fig.4　Expre ssion o f the Arabidopsis heat shock transc riptional factor At Hs f A6a in cy toplasm
3　讨　论
真核细胞 Hsp 基因的转录调节过程包括热激
转录因子(Hsfs)的激活 、Hsfs 与热激元件(Heat
st ress element ,HSEs)的结合及 Hsp 基因的转录 3
个步骤[ 11] 。热激转录因子(Hsfs)结合于热激蛋白
基因启动子的热激元(HSE),以募集其他转录因子
而形成转录复合体 ,促进转录的起始[ 12] 。常温下 ,
Hsfs 以单体形式与阻遏蛋白结合而没有结合 DNA
的能力 , Hsp70 可能参与了 Hsfs 单体的形成[ 13] 。
许多 Hsfs 不仅含有核定位信号(N LS),而且含有核
输出信号(NES)[ 14] 。在番茄中 , AtHsfA2是一个主
要定位于胞质中的穿梭蛋白[ 15] 。转录因子在细胞
中的定位对于其功能至关重要。因为在真核生物
中 ,转录因子只有进入细胞核才能够与其调节基因
的启动子区结合 ,从而进一步募集其他转录因子或
蛋白形成转录复合体 ,启动基因的表达 。李春光
等[ 8] 通过插入突变和瞬时表达研究发现 ,拟南芥热
激转录因子 AtHsfA2 于正常条件下在细胞质中表
达 ,但是是一种间接的证明方法。本研究通过 RT-
PCR 方法从拟南芥总 RNA 中克隆了热激转录因子
A tHs f A6a 基因 ,并通过构建融合基因和转化拟南
芥 ,观察到在正常条件下热激转录因子 AtHsfA6a
与 AtHsfA2一样定位于细胞质中 ,结果更为直接 。
在正常条件下 ,热激转录因子 AtHsfA6a 定位
于细胞质中 ,并且含量很低。受到逆境信号的刺激
97第 4 期 晁　旭等:拟南芥热激转录因子 AtHs f A6a 的克隆与细胞定位分析
后 ,A tHsfA6a含量是否增加及它是否由细胞质转
入细胞核中 ,对于其在逆境信号转导中是否发挥作
用至关重要。这些问题还有待进一步研究。
本研究中采用构建融合基因的方法研究了
AtHsfA6a在细胞中的定位 ,得到了一些结果;但用
该方法能否进一步研究受到胁迫时 AtHsfA6a 含量
和定位的变化 ,从而更加直接地验证其功能还需进
一步试验 。
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