全 文 ：第 32卷　第 5期 西北农林科技大学学报 (自然科学版 ) Vol. 32 No. 5
2004年 5月 Jour. of No rthw est Sci-Tech Univ . o f Ag ri. a nd Fo r. ( Na t. Sci. Ed. ) May 2004
氮离子注入的拟南芥 M1代 RAPD分析
王卫东 ,刘磊安 ,王　燕 ,秦广雍 ,霍裕平
(郑州大学离子束生物工程省重点实验室 ,河南 郑州 450052)
　　 [摘　要 ]　对拟南芥种子进行能量为 30 keV的不同剂量 N+ 离子束诱变 ,以当代拟南芥幼苗叶片为材料建立
基因池 ,并进行随机引物扩增多态性 DN A( RAPD)技术分析。 结果表明 ,每个基因池可扩增出约 200条有效条带 ,
不同剂量组变异率随剂量的增加而增大。 对经离子注入后的拟南芥发芽率统计显示 ,发芽率并不随剂量的增加而
单调下降。 最后初步探讨了不同剂量条件下发芽率和变异率变化趋势不一致的机制。
[关键词 ]　离子注入 ;拟南芥 ;离子束诱变 ; RAPD;变异率
[中图分类号 ]　 Q947. 9　　　　 [文献标识码 ]　 A [文章编号 ]　 1671-9387( 2004) 05-0045-04
　　离子束作为一种新的诱变源在我国已经被成功
地应用于水稻、棉花等作物的诱变育种研究中。在过
去的 20多年中 ,利用离子注入在水稻、小麦、棉花、
甜菊、大豆等农作物中相继育出了新的品种和品
系 [1, 2 ]。近 10年来 ,离子束的应用范围逐渐拓宽 ,在
微生物诱变育种和辅助 DNA转化等方面 ,也逐渐
显示出了广阔的应用前景。离子注入生物体内后 ,由
于注入离子的电、能、质的联合作用 ,生物体表现出
了不同于Φ射线和γ射线作用的生物效应 [ 3]。目前
对低能离子的生物学效应也进行了众多研究 ,并取
得了一定的结果 [3～ 6 ]。随着分子生物学的发展 ,从
DNA水平检测植物变异的技术也愈来愈完善 ,为进
行辐射诱变机理方面的研究提供了便利的手段和方
法。 本研究以模式植物拟南芥为研究材料 ,利用
RAPD方法探讨了拟南芥在离子注入后引起的基
因组 DNA的变异 ,以期为离子束诱变机理研究奠
定基础。
1　材料与方法
1. 1　材　料
　　拟南芥菜 ( Arabidopsis thal iana )为 Co lumbia
生态型 ,来自英国诺丁汉大学拟南芥储藏中心。为减
小热效应对拟南芥种子的损伤 ,将拟南芥干种子用
双面胶带粘贴在导热性良好的厚金属片上 ,面积为
3 cm
2
,种子均匀分布。
1. 2　方　法
1. 2. 1　离子注入　用本实验室进口的俄罗斯产
T ITAN离子注入机进行注入。 注入的离子为氮离
子 ,能量 30 keV ,剂量分别为 0. 5× 1017 , 1× 1017 ,
2× 1017 , 4× 1017 N+ /cm2。注入机的工作条件:真空
度 5× 10- 2 Pa,采用脉冲注入 (频率 25 Hz) ,束流
200 mA。 以未注入处理的干种子作对照。
1. 2. 2　栽培条件　将经离子注入后的拟南芥干种
子从双面胶带上用水洗脱 , 4℃春化 3 d后 ,播种于
营养土中 ,每处理重复 3次 ,单粒播种。室内温度 23
℃ ,光照强度 4 000 lx ,光照时间每天 16 h。
1. 2. 3　观测和取材　出苗后 4 d计算发芽势 (% ) ,
10 d对幼苗的发芽率进行观测统计。 DNA所需样
品取自不同注入剂量的莲座叶 ,剪下的新鲜叶片用
纱布擦拭干净后备用。对每处理剂量 ,随机选取 8个
单株基因组的 DNA为 1个基因池。 DNA提取采用
基因组抽提试剂盒 (购自上海 Sangon生物工程公
司 )。
1. 2. 4　 RAPD分析　本试验共用 50条引物 (购自
上海 Sangon生物工程公司 ) ,分别为 S41～ S60,
S161～ S180, S27, S82, S108, S135, S140, S154,
S204, S223, S346和 S515。 Ex Taq酶 , dN TP和
PCR Buf fer均购自宝生物工程 (大连 )有限公司。
RAPD反应体系 ( 25μL): Taq Plus 10× Buf fer
2. 5 μL ( 100 mmol /L Tris-HCl , pH 9. 0, 100
mmol /L KCl , 100 mmo l /L ( N H4 ) 2 SO4 , 20 mmol /L
Mg SO4 , 1% Tri tonX-100) ; Taq plus DN A Poly-
merase 1 U; 模板 DNA 25 ng; d ATP, d TT P,
dCT P, dG TP各 6. 25 nmol; primer 0. 4μmol。
RAPD反应程序 [7, 8 ]: 94℃预变性 5 min; 94℃
1 min, 35℃ 30 s, 40℃ 30 s, 45℃ 30 s, 72℃ 2
[收稿日期 ]　 2003-07-25
[基金项目 ]　国家“十五”科技攻关项目 ( 2001BA302B-03)
[作者简介 ]　王卫东 ( 1977- ) ,男 ,河南正阳人 ,在读博士 ,主要从事离子注入农作物后的生物效应研究。
DOI : 10. 13207 /j . cnki . jnwaf u. 2004. 05. 011
min,共 5个循环 ; 94℃ 30 s, 35℃ 45 s, 40℃ 45 s,
45℃ 45 s, 72℃ 2 min,共 40个循环 ;最后 72℃保
持 5 min,降温至 4℃时保存。
每次反应设不含模板的 DNA空白为阴性对
照 ,设对照基因组 DNA为阳性对照。 RAPD产物用
1. 4%琼脂糖凝胶电泳分离 ,点样 5μL,电压 8
V /cm ,溴化乙锭染色后于紫外灯下观测并照相。每
条引物重复扩增 3次 ,分析并统计数据。变异率按下
式计算:
变异率 /% = 试验组与对照组差异条带数总条带数 × 100%
2　结果与分析
2. 1　离子注入对发芽势和发芽率的影响
　　从表 1可以看出 ,离子注入后各剂量只有发芽
势在 2× 1017 N+ /cm2剂量点能达到对照水平 ,其余
剂量下的发芽势及所有处理的发芽率均低于对照。
剂量 4× 1017 N+ /cm2可达到半致死剂量。 t检验表
明 ,剂量 4× 1017 N+ /cm2与对照相比 ,差异达显著
水平。这说明经离子处理后的种子的萌发力受到了
一定程度的损伤 ,造成萌发力降低。
表 1　低能离子 ( 30 keV )注入对拟南芥发芽势与发芽率的影响 (平均值 )
Table 1　 Effect o f low ener gy ions( 30 keV ) on Arabidopsis thaliana ge rminating
po tential and germina ting r ate( av era ge)
低能离子剂量 /
(× 1017 N+ · cm- 2)
Low energy ion
f luence
发芽势 /%
Germinating
poten tial
发芽率 /%
Germinating
rate
低能离子剂量 /
(× 1017 N+ · cm- 2 )
Low en ergy ion
fluence
发芽势 /%
Germinating
potential
发芽率 /%
Germinating
rate
0( CK) 61 83 2 61 73
0. 5 52 67 4 34* 41*
1 56 62
　　注: * 表示在 0. 05水平上差异显著。
Note: * Stat is tical ly signif icant at 0. 05 levels, respectiv ely.
2. 2　 RAPD分析
采用 RAPD分子标记法分析了对照和低能离
子注入后的 4个处理。 在所采用的 50条引物中 ,有
12条没有扩增出条带 ,其余的均能扩增出清晰、重
复性好的条带。有些引物扩增出的带数可多达 7条 ,
有的引物只扩增出 1条。 扩增产物的分子量在
250～ 2 000 bp,主要集中在 350～ 1 500 bp。不同引
物不仅扩增出的谱带数差异较大 ,而且谱带差异率
相差也较大 ,其中 S44, S55, S165, S170, S171和
S180等引物扩增出的带谱差异率较大 ,有些引物呈
近 50%的多态性 (图 1A) ,而有些引物不表现多态
性 (多态带数为零 ) ,这说明不同序列在 DNA链上
的保守性不同 ,对辐射的敏感性也不同。
所扩增的条带呈现出下列特点: ( 1)对照和处理
多具有相同的主扩增带 ,大约 40个引物都表现为这
种特征 ,这些 DNA的片段应该说都是离子辐射的
非敏感区序列。 ( 2)在所试各剂量组间存在差异片
段 ,其差异表现为扩增片段不同、主扩增带的不同或
扩增强度不同。 这些特点与其他作物或者微生物的
核基因组扩增的结果相似 ,说明辐射引起的差异与
种间的基因差异相似 ,存在较丰富的遗传多样性 (图
1B)。 ( 3)随着离子注入剂量的增加 ,差异条带数和
变异率增加 (表 2)。
图 1　不同剂量和不同引物拟南芥的基因组多态性
M. DN A标准分子量 ; C K.对照样品 ; 0. 5, 1, 2, 4分别表示剂量为 0. 5× 1017 , 1× 1017, 2× 1017 , 4× 1017 N+ /cm2
Fig . 1　 Some primer s amplifica tion image o f the Arabidopsis thaliana genomics by different low energ y N+ io n implanta tion
M. DNA marker; CK. Cont rol Sample; 0. 5, 1, 2, 4: Fluence 0. 5× 1017 , 1× 1017, 2× 1017 , 4× 1017 N+ /cm2
46 西北农林科技大学学报 (自然科学版 ) 第 32卷
表 2　不同剂量条件下 RAPD产物变异率
Table 2　 Th e mutagenetic percentag es caused by different low energ y N+ io n implanta tion
低能离子剂量 / (× 1017 N+ · cm- 2)
Low energy ion f luence
差异条带数
Numbers of
di f ferent bands
总条带数
Total numbers
of bands
变异率 /%
M utation
percentag es
0. 5 12 212 5. 7
1 17 203 8. 4
2 23 202 11. 4
4 29 202 14. 4
　　辐射可能引起几种基因突变形式 ,这些基因突
变主要包括: 与引物互补位点发生碱基突变 ,互补位
点之间的 DNA发生插入或缺失 ,断裂或插入片段
过大而导致不能扩增等 ,从而使 RAPD扩增条带改
变。对于低能离子注入所引起的基因突变 ,高剂量的
低能离子引起的基因突变在数量上和程度上是低剂
量的叠加 ,表现出与剂量呈线性关系的特性。另外 ,
多拷贝引物结合位点上某些位置的碱基发生突变 ,
使引物结合量减少 ,造成扩增出的 DNA量减少 ,或
是出现的新片段与原有某条片段具有相近的 DNA
序列或分子量 ,从而在电泳后出现谱带加深 ,即反映
出谱带深浅的变化。
3　讨　论
目前发现影响 RAPD结果的因素很多 [9 ] ,在做
RAPD试验之前 ,有必要优化出对拟南芥总基因组
进行 PCR的各个因素的较佳条件。保证 RAPD分
析稳定性的关键在于严格控制试验条件和规范操作
手法 ,同时要以多次试验中能重复出现的条带作为
阳性扩增条带来分析基因组变异情况 ,从而保障其
可靠性和准确度。
离子注入后种子的发芽率 -剂量曲线呈先降后
升再降的“马鞍型”特性 ,与 DNA的突变率 - 剂量
的关系特征有一定差别 ,这种现象可能是由于离子
注入对种子造成的损伤在较低剂量下会启动某种修
复体系 [10 ] ,如酶的修复、 DNA的修复等。小剂量的
离子注入引起的损伤较小 ,此时修复系统尚未完全
启动 ,其结果是形成从外观看来较小的突变 ,同时对
种子萌发力的损伤产生一定的抑制作用 ;若注入剂
量继续增大 ,修复系统完全启动 ,其效应不再是出芽
率的持续降低 ,而是出现一个出芽率提高的过程 ;继
续提高注入剂量 ,则会使修复体系在短时间内不能
完成修复 ,或是由于 DNA损伤修复系统本身遭到
破坏而难以或不能起作用 ,最终结果是出芽率骤降。
在低能离子造成的各种损伤的机理方面 ,出现
了各种各样的推测和假说 ,随着生物技术的不断发
展和进步 ,致力于离子束生物效应研究的学者对此
问题的解答也越来越完善 ,但是还没有比较令人信
服的结果。作为离子束诱变的理论基础 ,这种机理的
研究值得人们进一步深入探讨。
[参考文献 ]
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47第 5期 王卫东等:氮离子注入的拟南芥 M1代 RAPD分析
The variations of M 1 to the seeds of Arabidopsis thaliana
implanted by keV N
+
ion beam
WANG Wei-dong, LIU Lei-an,WANG Yan,QIN Guang-yong,HUO Yu-ping
( Henan Prov incial Key Laboratory of Ion Beam Bioengineering, Zhengzhou University , Zhengzhou, Henan 450052,China)
Abstract: Af ter the Arabidopsis thaliana seeds were implanted by the dif ferent do ses o f the N
+
ion
beams wi th the energ y o f 30 keV , DN A poo ls were set up and thei r changes o f the M 1 DNA were investi-
ga ted using the method of RAPD. The results indicated tha t there are about 200 bands of RAPD genera ted.
With the intensification of the implantation dose, compa red wi th the control g enomic DN A, the rates o f the
f requencies of RAPD va ria tion increased. M oreover, the germina tion percentag es o f the implantation seeds
w ere counted. It suggested that the germina tion percentag es w ere not always decreased wi th the dose in-
crease. And at last , the reason tha t the t rends of the germination percentage and the muta tion percentag e
w ith the dif ferent dose w ere no t consistent w as discussed.
Key words: ion implantation; Arabidopsis thal iana; ion beam mutation; RAPD; variation rate
·简　讯·
“板栗保鲜贮藏技术”获陕西省科学技术二等奖
由西北农林科技大学林学院鲁周民副研究员主持的“板栗保鲜贮藏技术”为国家林业局重点科研项目
(编号 97-11)。 该成果于 2002年 3月通过国家林业局组织的技术成果鉴定 , 2003年获陕西省林业厅科技进
步一等奖和全国商业科技进步一等奖 , 2004年 4月获陕西省科学技术二等奖。
该项目研究了板栗采后呼吸强度变化规律及不同成熟度板栗的冰点 ,首次提出板栗为非呼吸跃变型果
实 ,充分成熟的板栗具有较低的结冰点温度 ( - 4～ - 5℃ ) ,该结果为板栗在低温冷藏下的最佳贮藏温度参
数的确定提供了理论依据 ;研究了板栗采后失水变化和在贮藏过程中影响板栗腐烂的因素 ,确定了板栗最佳
采收期和在贮藏过程中减少失水和腐烂的前处理方法 ;基本搞清了板栗采后的生理生化变化 ,为板栗保鲜贮
藏工艺及工艺参数的确定提供了理论依据 ;进行了不同药剂、低温以及γ射线辐射处理抑制板栗萌发的试
验 ,提出了方便实用的抑制板栗萌发的技术 ,并确定了采用γ射线抑制板栗萌发时的最佳辐射剂量 ;提出了
简单实用的板栗低温冷藏新工艺及工艺控制参数和板栗贮藏前处理技术 ,为板栗的低温冷藏提供了可靠的
技术依据 ;首次确定了板栗气调贮藏时的 O2和 CO2浓度以及温、湿度等调控参数。
采用该技术可有效抑制霉菌的生长和板栗萌发 ,使板栗保鲜贮藏期达 180 d,好果率达 95%以上。该研
究成果已经在陕西省板栗产区应用于生产 ,取得了很好的效果。本技术与生产实际结合紧密 ,容易掌握 ,适于
栗农及中小企业应用 ,投资小 ,见效快。另外 ,对于无冷藏库的地方 ,采用本技术对板栗进行预处理后 ,利用山
洞或土窑洞贮藏 ,也具有较好的贮藏效果。
(窦春蕊　供稿 )
48 西北农林科技大学学报 (自然科学版 ) 第 32卷