全 文 ：基金项目：国家转基因生物新品种培育重大专项(No. 2011ZX08010-004)
收稿日期：2013-10-28 接受日期：2013-11-12
拟南芥 5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶基因(EPSPS)的定点
突变及抗草甘膦转基因拟南芥获得
陈荣荣 1 曹高燚 1，2 刘允军 1*
1中国农业科学院作物科学研究所，北京100081；2天津农学院农学系，天津300384
*通讯作者，liuyunjun@caas.cn
摘 要 目前商业化种植的抗草甘膦转基因作物中使用的基因主要是来自土壤农杆菌(Agrobacterium
tumefaciens)CP4和大肠杆菌(Escherichia coli)的 5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶(5-enolpyruvy-
shikimate-3-phosphate synthase, EPSPS)基因，抗性基因资源过于狭窄，有必要拓宽可用基因种类。本研究
通过 PCR方法克隆了拟南芥(Arabidopsis thaliana)EPSPS基因，对其进行定点突变，并将野生型基因
(AtEPSPS)和突变基因(AtTIPS)分别转化EPSPS基因缺陷型大肠杆菌菌株ER2799。草甘膦抗性鉴定结果
表明，含AtTIPS基因的重组菌株在 20 mmol/L草甘膦胁迫条件下长势良好(P＜0.01)，而含AtEPSPS基因
的重组菌株在5 mmol/L的草甘膦胁迫条件下即受明显抑制(P＜0.01)。同时将两个基因分别构建到植物
表达载体中，并转化野生型拟南芥。对T1代转基因植株进行PCR验证和转录水平分析，证明外源基因已
整合到拟南芥基因组中并正常表达。对转基因拟南芥进行草甘膦抗性分析结果表明，在0.5 mmol/L草甘
膦处理下，转 AtTIPS基因拟南芥相比转 AtEPSPS拟南芥有更高的植株鲜重和存活率(P＜0.05)，表明转
AtTIPS基因拟南芥有更高的草甘膦抗性。以上结果表明AtTIPS具有较高的草甘膦抗性能力，可以用于抗
草甘膦转基因作物的培育。
关键词 拟南芥，5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)，突变，转基因，草甘膦抗性
Site- specific Mutagenesis of the Arabidopsis Gene 5- enolpyruvy-
shikimate-3-phosphate Synthase (EPSPS) to Gain Glyphosate-resistant
Transgenic Arabidopsis thaliana
CHEN Rong-Rong1 CAO Gao-Yi1,2 LIU Yun-Jun1*
1 Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China; 2 Department of Agronomy, Tianjin Agriculture
University, Tianjin 300384, China
* Corresponding author, liuyunjun@caas.cn
Abstract At present, the most widely used gene in commercialized transgenic glyphosate-resistant crops is 5-
enolpyruvy- shikimate- 3- phosphate synthase (EPSPS) genes from Agrobacterium tumefaciens CP4 and
Escherichia coli, which results in narrow gene resource. In this study, aiming at developing new genes,Arabidopsis
EPSPS gene was cloned and two amino acids (T178I, P182S) were point mutated via overlap extension PCR. The
wild- type gene (AtEPSPS) and the mutant gene (AtTIPS) were introduced into EPSPS- defective strain E. coli
ER2799, respectively. The glyphosate resistance ofAtEPSPS and AtTIPS transformed ER2799 strains were tested
at 0, 5, 10, 20, 50, 100 and 150 mmol/L glyphosate. AtTIPS transformed ER2799 grew normally in the medium
containing 20 mmol/L glyphosate, while the growth of AtEPSPS transformed ER2799 was inhibited by 5 mmol/L
Online system: http://www.jabiotech.org
农 业 生 物 技 术 学 报
Journal of Agricultural Biotechnology
2014, 22(4): 397~405
DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2014.04.001
农业生物技术学报
Journal of Agricultural Biotechnology
0 引言
草甘膦广泛用于非耕地、免耕地中作物播前或
播后处理，以及出苗后定向处理，是全世界使用量
最大的除草剂。草甘膦的理化性质稳定，具有高
效、广谱、低毒、低残留、不破坏土壤环境、对大多数
植物具有灭生性等其他除草剂所不可比拟的优点
(Duke, Powles, 2008)。然而，草甘膦作为一种非选
择性除草剂，对农作物的生长同样有着抑制作用，
这就限制了其大规模地使用和发展。因此，培育抗
草甘膦或降解草甘膦的转基因农作物并成功应用，
可以降低除草成本，提高除草效果，减少药害，使除
草操作可以在见草后简便灵活地进行，延长除草的
适期，既节省农业生产费用，又能极大地促进我国
现代农业的发展(强胜等, 2010)。
目前，植物获得草甘膦抗性主要采用3种方法
(Dill, 2005)。第一，植物细胞通过5-烯醇式丙酮酰-
莽草酸- 3-磷酸合成酶(5- enolpyruvy- shikimate- 3-
phosphate synthase, EPSPS)的超表达对一定剂量的
草甘膦产生抗性(Hauptmann et al., 1988)。第二，植
物细胞通过EPSPS的作用活性位点变化，改变其空
间构型，一方面提高与底物磷酸烯醇式丙酮酸
(phosphoenolpyruvate,PEP)和莽草酸磷酸(shikimate-
3-phosphate, S3P)的亲和能力(降低 KmPEP和 KmS3P)；
另一方面提高对草甘膦的抑制常数 (增加
Kiglyphosate)，降低与草甘膦的亲和能力，使其产生草
甘膦抗性,即通常所说的抗草甘膦基因。利用这
种作用机理使植物具有草甘膦抗性的常用基因主
要是农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens)菌株 CP4
和大肠杆菌 (Escherichia coli)及玉米 (Zea mays)
EPSPS基因突变体。第三，导入草甘膦降解基因,
比 如 草 甘 膦 氧 化 还 原 酶 基 因 (glyphosate
oxidoreductase gene, GOX)及草甘膦乙酰转移酶编
码基因 (glyphosate N-Acetylation, GAT)。当前生
产中应用的草甘膦抗性基因主要是孟山都公司开
发的 CP4 EPSPS和杜邦公司开发的 (glyphosate
N-acetylation, GAT)基因。
EPSPS 催 化 底 物 磷 酸 烯 醇 式 丙 酮 酸
(phosphoenolpyruvate, PEP) 和 莽 草 酸 - 3- 磷 酸
(shikimate-3-phosphate, S3P)生成 5-烯醇式丙酮酰-
莽草酸-3-磷酸(EPSP)，是真菌、细菌、藻类和高等
植物体内芳香族氨基酸(包括色氨酸、酪氨酸、苯丙
氨酸)生物合成过程中一个关键性酶 (Boocock,
Coggins, 1983)。草甘膦是底物 PEP的结构类似
物，可以竞争性地结合EPSPS，当给植物喷施草甘
膦时，草甘膦与EPSPS结合，抑制了此酶的活性，导
glyphosate(P＜0.01). When the concentration of glyphosate was higher than 50 mmol/L, the growth of AtTIPS
transformed ER2799 was also inhibited, without difference with AtEPSPS transformed ER2799. Meanwhile, we
constructed two plant expression vectors containing AtEPSPS or AtTIPS, and introduced them into wild
Arabidopsis thaliana via Agrobacterium mediated flower dipping approach, respectively. Seven AtEPSPS
transformed lines and ten AtTIPS transformed lines were gained. PCR and RT-PCR analysis suggested that the
AtEPSPS and AtTIPS genes were successfully integrated into the Arabidopsis thaliana genome and expressed
correctly. We transplanted the transgenic plants to MS media containing 0.3, 0.5 and 1.0 mmol/L glyphosate,
respectively, to test their resistance to glyphosate. All three glyphosate concentration led the leaves of AtEPSPS
transformed plants and wild type plants to turn yellow, whereas AtTIPS transformed plants grew normally. RT-
PCR results showed that there was no significant difference of transcriptional level of AtEPSPS and AtTIPS in
transgenic plants. The survival rate and fresh weight ofAtTIPS transformed plants were significantly higher than
that of AtEPSPS transformed plants (P＜0.05). Whereas, the survival rate and fresh weight of AtEPSPS
transformed plants were higher than that of wild type plants. These results suggest that the overexpression of
AtEPSPS could only confer transgenic plants with low level of glyphosate tolerance; however, transgenic plants
overexpressing AtTIPS could tolerate high concentration of glyphosate. So we can conclude that AtTIPS
transformed plants performed higher glyphosate resistance than that ofAtEPSPS transformed plants and wild type
plants, andAtTIPS can be a candidate for the development of transgenic glyphosate-resistant crops.
Keywords Arabidopsis thaliana, 5- enolpyruvy- shikimate- 3- phosphate synthase (EPSPS), Mutate,
Transgenic, Glyphosate-resistance
398
拟南芥5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶基因(EPSPS)的定点突变及抗草甘膦转基因拟南芥获得
Site-specific Mutagenesis of the Arabidopsis Gene (EPSPS) to Gain Glyphosate-resistant Transgenic Arabidopsis thaliana
致莽草酸途径的合成受阻，进而导致植株死亡
(Steinrücken, Amrhein, 1980)。EPSPS主要分为Ⅰ
型和Ⅱ型两种类型。Ⅰ型对草甘膦敏感，主要来源
于植物和大肠杆菌，利用基因工程对其进行突变可
以在一定程度上降低其对草甘膦的敏感性(Healy
et al., 2007)，从而获得一定的草甘膦抗性。Ⅱ型对
草甘膦的敏感性较差，有一定的草甘膦抗性，通常
来源于对草甘膦有一定耐受性的微生物，一般与底
物 PEP的亲和性和催化效率较高 (Funke et al.,
2006)。
目前，生产上常用的CP4-EPSPS基因，来自土
壤农杆菌CP4，是通过细菌培养筛选分离出来的抗
性优良的基因。应用的Ⅰ型EPSPS基因主要是E.
coli和玉米的EPSPS基因，基因种类单一稀少。因
此寻找新型高抗草甘膦基因是培育抗草甘膦转基
因作物的一个重要途径。本研究通过PCR方法克
隆了拟南芥EPSPS基因，通过定点突变获得了突变
基因AtTIPS。利用野生型基因(AtEPSPS)和突变基
因(AtTIPS)构建原核表达载体，在大肠杆菌EPSPS
基因缺陷型菌株ER2799中进行草甘膦抗性鉴定。
同时构建植物表达载体，采用拈花法转化野生型拟
南芥，获得的转基因拟南芥具有很好的草甘膦抗
性。结果表明，拟南芥EPSPS突变基因AtTIPS具
有较高的草甘膦抗性能力，可以作为培育抗草甘膦
转基因作物的候选基因。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
拟 南 芥 (Arabidopsis thanliana) 生 态 型
Columbia- 0(Col- 0)、大肠杆菌 (Escherichia coli)及
EPSPS 基 因 缺 陷 型 菌 株 ER2799、农 杆 菌
(Agrobacterium tumefaciens)GV3101由本实验室保
存。琼脂粉，MS培养基，卡那霉素，利福平，
CTAB，Taq DNA聚合酶，TransStart Fast Pfu DNA
聚合酶，琼脂糖等生化试剂购于Sigma或北京经科
宏达生物技术有限公司或北京全式金生物技术有
限公司，均为分析纯以上级别；各种引物由上海生
工生物工程有限公司合成；pGWC-T，pEarlygate
CD3-724购于 Invitrogen公司(美国)；pACYC184及
所用限制性内切酶购于New England Biolabs公司
(英国)；草铵膦(PPT)购于日本株式会社，草甘膦购
于Sigma公司(美国)。
1.2 AtEPSPS基因的克隆
根据NCBI上公布的拟南芥EPSPS基因序列，
设计特异引物，以拟南芥 cDNA为模板，扩增长度
为 1 563 bp包含其叶绿体定位信号肽的编码区序
列。PCR扩增总长度为1 590 bp，引物序列为：
AtEP-S: 5-TAGGATCCATGGCGCAAGTTA-3；
AtEP-A: 5-
TTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAGTGCTTTG
TGATTCT-3。
反应体系为 TransStar fast pfu DNA 聚合酶
(2.5 U/µL)0.5 µL，5×fast pfu buffer 6 µL，引物(2.5
mmol/L) AtEP- S、AtEP- A 各 1.5 µL，dNTPs(10
mmol/L) 2 µL，cDNA 1 µL，加水至 30 µL，反应条
件为 95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5
min，30个循环后72℃延伸7 min。
1.3 基因的定点突变
以质粒 pGWC-AtEPSPS为模板，用重叠延伸
PCR法突变AtEPSPS基因的第 533位和第 544位，
由C突变为T，其蛋白序列的第178位由Thr突变为
Ile，第182位由Pro突变为Ser。重叠延伸PCR法所
用引物：
At-TIPS-S：5-AATAGCAATGCGTTCACTTACCGCT-3；
At-TIPS-A：5-TGAACGCATTGCTATTCCTGCATTAC-3。
PCR反应体系为 TransStar fast pfu DNA聚合
酶 (2.5 U/µL)0.5 µL，5× fast pfu buffer 6 µL，引物
(2.5 mmol/L)At-TIP-S、At-TIPS-A各 1.5 µL，dNTPs
(10 mmol/L) 2 µL，质粒DNA(0.1 µg/µL)1 µL，加水
至 30 µL；PCR反应条件为 95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，
60 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min 40 s，30个循环后 72 ℃延伸
7 min。 实 验 方 案 根 据 全 式 金 公 司 Fast
mutagenesis system方案进行。
1.4 含拟南芥EPSPS的大肠杆菌重组菌株的草甘
膦抗性鉴定
以质粒pACYC184为载体骨架，在基因5端和
3端分别添加EcoRⅠ和EcoRⅠ酶切位点，构建含
AtEPSPS和AtTIPS基因的重组载体，质粒经测序验
证正确后，转化ER2799感受态细胞，涂布于含有四
环素的LB固体培养基上，单克隆用 PCR检测，并
通过测序验证。挑取单克隆于 5 mL含四环素的
LB液体培养基中，37℃恒温培养至OD600=0.5，之后
收集菌体，用不含草甘膦的液体M9培养基重悬菌
399
农业生物技术学报
Journal of Agricultural Biotechnology
体至OD600=0.5。取等体积的重悬菌体至含有 0、5、
10、20、50、100和 150 mmol/L浓度草甘膦的液体
M9培养基中 37 ℃，200 r/min，震荡培养 16 h，取菌
液测定OD600吸光值。
1.5 植物表达载体的构建
将质粒 pGWC-AtEPSPS和 pGWC-AtTIPS中的
EPSPS编码基因通过 Invitrogen公司的LR重组酶
用 Gateway方法构建到 pEarlygate CD3-724载体
上，形成目的植物表达载体，并进行测序验证。用
电击法将植物表达载体转化农杆菌GV3101感受
态，重组菌株通过PCR方法进行验证。
1.6 蘸花法转化野生型拟南芥
(1)转化前准备：待拟南芥长到抽薹时，剪去主
薹，约1周后次薹长出，准备转化。(2)菌液制备：将
含有EPSPS编码基因AtEPSPS和AtTIPS的GV3101
重组菌株的单菌落接种于YEB液体培养基(50 mg/
L Kan+50 mg/L Rif)内，28 ℃摇床，220 r/min，培养
16~18 h。8 000 r/min离心 5 min收集菌体，用空白
YEB液体重悬菌体，调节OD600值在 0.6~0.8，加入
0.02%的 silwet。(3)拟南芥转化：将重悬后的菌液
倒入大的培养皿中，将拟南芥的花序浸入菌液中
40 s，侵染后的植株套袋保湿，黑暗培养24 h。之后
在16 h光照/8 h黑暗，22℃的环境下正常生长，1周
后可再转化一次，待种子成熟后收获。
1.7 阳性转基因植株的筛选
将收获的拟南芥种子春化后，均匀铺种于装有
蛭石∶营养土(3∶1)的小花盆中，并覆膜保湿，3 d后
除去覆膜，16 h光照/8 h黑暗，22 ℃的环境下生长。
幼苗长出真叶后7~9 d，喷施0.1%(V/V)的草铵膦溶
液(PPT)，每24 h喷施一次，连续喷施2~3次，非转基
因植株死亡，存活下来的为可能的阳性转化子。
1.8 阳性转基因植株PCR鉴定
取PPT筛选活下来的植株叶片，用CTAB方法
提取叶片DNA。用AtEPSPS基因特异性引物进行
PCR鉴定，PCR产物用 1%的琼脂糖凝胶电泳检
测。所用引物序列为：
AtEP-inF：5TGGGGATTGAAGAAGAGTGG3；
AtEP-inR：5CGTTCCATCAACTTCAATGTCA。
PCR反应体系：2×Taq PCR Mastermix 10 µL，
引物 (2.5 µmol/L)AtEP- inF、AtEP- inR各 0.5 µL，
DNA(0.5 μg/μL)1 µL，加水至 20 µL；反应条件：
95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35个
循环后72℃延伸7 min，PCR产物用1%琼脂糖凝胶电
泳检测。
1.9 阳性转基因植株的半定量RT-PCR鉴定
选择部分转AtEPSPS和AtTIPS基因的拟南芥
株系，提取其总RNA反转录成cDNA。以cDNA为
模板做半定量RT-PCR，肌动蛋白基因(Actin)作为
PCR反应的内参。分析目的基因表达量的差异。
所用引物：
EPSPS1k-F：5-GGAACTAACTGCCCTCCTGT-3；
EPSPS1k-R：5-CAATAGCCCGCAAGTGTCTC-3。
AtActin-F：5-CGATTGAGCATGGCATTGTCA-3；
AtActin-R：5-CCCACTAGCGTACAACGAA-3。
PCR反应体系为2×Taq PCR Mastermix 10 µL，
引物(2.5 μmol/L)各 0.5 µL，cDNA1 µL，加水至 20
µL；反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，
72 ℃ 1 min，28个循环后 72 ℃延伸 7 min，内参
Actin；PCR反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，57 ℃
30 s，72 ℃ 20 s，28个循环后72 ℃延伸7 min。PCR
产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.10 转基因植株草甘膦抗性鉴定
经分子检测的阳性转基因植株，收获 T1代种
子，用 75%的酒精和 5%的次氯酸钠消毒后播种在
含 10 mmol/L PPT的MS固体培养基上，4 ℃春化 3
d后，转移至温室，16 h光照/8 h黑暗，22 ℃的环境
下正常生长7~9 d，存活的植株转移至含0.3、0.5和
1 mmol/L草甘膦的MS固体培养基上竖直培养，5 d
之后拍照并统计生物量，进行草甘膦抗性鉴定。用
t检验法进行差异显著性分析。
2 结果与分析
2.1 拟南芥EPSPS基因PCR克隆及定点突变
以拟南芥 cDNA为模板，根据NCBI上公布的
拟南芥EPSPS基因序列，设计特异引物，用Transtar
fast pfu DNA聚合酶进行PCR扩增，克隆得到拟南
芥EPSPS基因基因片段 AtEPSPS，长度为 1 590 bp
(图1)。将扩增得到的基因片段连接到pGWC-T载
体，测序正确后，质粒命名为 pGWC-AtEPSPS (图
2)。根据已知的玉米 EPSPS突变体 TIPS(T102I/
P106S)和大肠杆菌EPSPS突变体TIPS(T97I/P101S)
400
的突变位点(Healy, 2007; Funke et al., 2009)，通过与
拟南芥EPSPS基因和玉米及大肠杆菌EPSPS基因
进行比对，找到其保守位点。推测拟南芥 EPSPS
(AtEPSPS)第 182位的脯氨酸(Pro)对应于大肠杆菌
E.coli EPSPS第101位的脯氨酸(Pro)，178位苏氨酸
对应大肠杆菌 E.coli EPSPS 第 97 位的苏氨酸
(Thr)。因此设计引物将这两个位点的氨基酸进行
突变。以质粒pGWC-AtEPSPS为模板，进行定点突
变，经PCR、测序验证后，得到重组突变质粒pGWC-
AtTIPS (图2)。突变后的AtTIPS基因编码的蛋白有
2个氨基酸发生变化，178位苏氨酸(Thr)变为异亮氨
酸(Ile)，182位脯氨酸(Pro)变为丝氨酸(Ser)(图3)。
2.2 载体构建
以质粒 pACYC184为载体骨架，在基因 5和 3
端分别添加 EcoR I 酶切位点，构建了分别含
AtEPSPS和AtTIPS基因的重组原核表达载体，质粒
经测序验证，连接正确。通过 Invitrogen公司的LR
重组酶介导的Gateway技术将 pGWC-AtEPSPS和
pGWC-AtTIPS重组至 pEarlygateCD3-724上，获得
植物表达载体(图2)。
2.3 大肠杆菌 ER2799中 AtEPSPS及 AtTIPS的
草甘膦抗性检测
拟南芥 EPSPS基因编码Ⅰ型的 EPSPS，Ⅰ型
EPSPS一般对草甘膦敏感。为比较 AtEPSPS及
AtTIPS的草甘膦抗性，将其构建至pACYC184载体
上。载体经PCR扩增目的基因、酶切检测、测序验
证正确后，命名为 pACYC- AtEPSPS和 pACYC-
AtTIPS(图 2)。分别将AtEPSPS及AtTIPS基因转化
到缺陷型大肠杆菌菌株ER2799，进行抗性鉴定。
结果显示，在没有草甘膦胁迫条件下AtEPSPS
及AtTIPS都能够互补缺陷型菌株ER2799的功能，
使其在M9培养基中正常生长，表示拟南芥野生型
及相关突变体都有催化PEP和S3P生成EPSP的活
性。随着草甘膦浓度的不断增加，含 AtEPSPS的
ER2799菌株受到严重的抑制，不能正常生长，表明
它们都只有极低的草甘膦抗性；而转化AtTIPS的重
组菌株可以在含20 mmol/L草甘膦的M9培养基中
生长良好，但不能耐受高于50 mmol/L以上的草甘
3000
2000
1000
bp M 1 CK-
图 1 AtEPSPS基因扩增
Figure 1 The amplification of AtEPSPS
M：DNA分子量标记；1：cDNA为模板；CK-：空白对照
M: DNA marker; 1: cDNA as template; CK-: No template
拟南芥5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶基因(EPSPS)的定点突变及抗草甘膦转基因拟南芥获得
Site-specific Mutagenesis of the Arabidopsis Gene (EPSPS) to Gain Glyphosate-resistant Transgenic Arabidopsis thaliana
图 2 载体构建图谱
Figure 2 Scheme of the vector construction
AtTIPS突变基因由重叠延伸PCR介导的定点突变得到，载体通过gateway技术或常规酶切-连接方法构建
AtTIPS mutant was produced by overlap extension PCR mediated site-directed mutagenesis, and expression vectors were con-
structed using gateway technology or normal digestion-ligation method
401
农业生物技术学报
Journal of Agricultural Biotechnology
膦浓度(图4)。以上结果说明突变基因AtTIPS有较
高的草甘膦抗性能力。
2.4 转基因拟南芥的分子鉴定
沾化法分别转化 AtEPSPS和 AtTIPS植物表达
载体后收获的拟南芥T0代种子，喷施0.1%(V/V)草
铵膦 (PPT)溶液筛选存活的株系，共获得 7个转
AtEPSPS基因拟南芥株系和 10个转AtTIPS基因拟
南芥株系。PCR检测结果表明，转基因株系都得到
了 740 bp左右的DNA片段，其长度与含目的基因
的质粒 pGWC-AtEPSPS扩增产物大小一致，而野
生型拟南芥内源EPSPS基因含有内含子，扩增片段
DNA约 1 150 bp。由于转基因株系本身也含有内
源EPSPS基因,因此在 1 150 bp处有一条较弱的条
带(图5)。以上结果表明AtEPSPS和AtTIPS基因已
经成功整合到拟南芥基因组中。
2.5 转基因拟南芥转录水平分析
选择 8 个株系，提取其总 RNA 反转录成
cDNA。在 AtEPSPS基因上设计特异性引物扩增
514 bp特定PCR片段，内参为肌动蛋白Actin，做半
定量RT-PCR，检测其表达量的差异。结果显示，
AtEPSPS及 AtTIPS转基因拟南芥株系中有很高的
AtEPSPS和 AtTIPS基因的表达量(图 6)；但两种转
基因株系之间目的基因的表达量没有明显变化。
可以推测，转 AtTIPS基因拟南芥株系相对于转
AtEPSPS拟南芥株系对草甘膦的抗性的增强是主
要是由基因的自身特性决定而不是由于目的基因
表达量的变化导致。
2.6 转基因拟南芥的草甘膦抗性鉴定
取收获的阳性株系T1代种子，分别在0.3、0.5和
1.0 mmol/L草甘膦胁迫下进行草甘膦抗性鉴定。野
图 3 AtEPSPS基因点突变示意图
Figure 3 The part sequence of AtEPSPS and AtTIPS
编码Thr的密码子第二个碱基C突变为T(·)，编码氨基酸由
Thr变为 Ile；编码 Pro的第一个碱基C突变为T(·)，编码氨
基酸由Pro变为Ser
The changed nucleotides were highlighted using asterisk. The
middle base C of the Thr code was mutated to T(· ), so Thr
was changed to Ile; The first base C of the Pro code was mu-
tated to T(·), so Pro was mutated to Ser
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
0 5 10 20 50 100 150
OD
60
0
草甘膦浓度/(mmol· L-1)
Glyphosate concentration
AtEPSPS
AtTIPS
**
**
**
图 4 含AtEPSPS和AtTIPS的重组菌株在不同浓度草甘膦
胁迫下抗性鉴定
Figure 4 Glyphosate tolerance of recombinant strains
containing AtEPSPS or AtTIPS under different concentra⁃
tion of glyphosate
**：P<0.01差异极显著
**: Exremely significant difference at P<0.01
2000
750
bp M 1 2 3 4 5 6 WTCK-CK+
图 5 转基因植株PCR鉴定
Figure 5 PCR analysis of transgenic plants
M：DNA marker；1~3：转AtTIPS株系；4~6：转AtEPSPS株系；
WT：野生型拟南芥株系；CK-：水；CK+：质粒 pGWC-AtEP⁃
SPS
M: DNA marker; 1~3: AtTIPS transgenic lines; 4~6; AtEPSPS
transgenic lines; WT: Wild type; CK-:Water; CK+: Plasmid pG-
WC-AtEPSPS
目的基因 Target gene
内参Reference Actin
1 2 3 4 5 6 7 8
图 6 AtEPSPS及AtTIPS的表达分析
Figure 6 Expression analysis of AtEPSPS and AtTIPS in
the transgenic and WT plants
1~3：转 AtEPSPS基因拟南芥株系；4~7：转 AtTIPS基因拟南
芥株系；8：野生型植株
1~3:AtEPSPS transgenic Arabidopsis plants; 4~7: AtTIPS trans-
genic Arabidopsis plants; 8: Wild type plants
Thr Pro
AtEPSPS CAGGAAC·AGCAATGCGTC·CACTTA
Ile Ser
AtTIPS CAGGAAT·AGCAATGCGTT·CACTTA
402
生型拟南芥和转AtEPSPS拟南芥在3种浓度草甘膦
的胁迫条件下，生长均受到明显的抑制，出现明显的
变黄萎蔫现象，而转AtTIPS拟南芥在3种浓度草甘
膦胁迫条件下生长基本上没有受到抑制(图7)。在
0.5 mmol/L草甘膦浓度下，转 AtTIPS拟南芥比转
AtEPSPS拟南芥有显著高的植株存活率，而且植株
鲜重也达到了极显著性差异(图8)。转AtEPSPS拟
南芥相比于野生型也变黄萎蔫，但其受抑制程度要
低于野生型，特别是在 0.3和 0.5 mmol/L水平(图
7)。以上结果证明过量表达AtEPSPS可以赋予拟南
芥一定的草甘膦抗性，但其抗性程度低，不足以用于
生产。草甘膦抑制了野生型及转AtEPSPS拟南芥的
莽草酸途径，而转AtTIPS基因拟南芥的莽草酸途径
没有受到明显的抑制，具有优良的草甘膦抗性。图
7中转基因材料根系的长度要略短于野生型，但是
转基因材料的侧根数要多于野生型拟南芥。可能与
AtEPSPS或AtTIPS的过量表达进而影响莽草酸途径
及其他相关次生代谢途径的进行有关。
拟南芥5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶基因(EPSPS)的定点突变及抗草甘膦转基因拟南芥获得
Site-specific Mutagenesis of the Arabidopsis Gene (EPSPS) to Gain Glyphosate-resistant Transgenic Arabidopsis thaliana
1 WT 2 3 4 5 6
7 9 10 11 12
WT WT
WT WT WT
图 7 转基因株系在不同浓度草甘膦培养基上生长5 d后的长势
Figure 7 Trangenic plants expressing AtEPSPS or AtTIPS grown for 5 d on MS media with different concentration of
glyphosate
A：0.3 mmol/L草甘膦；B：0.5 mmol/L草甘膦；C：1.0 mmol/L草甘膦。WT：野生型植株；1~6：转AtTIPS株系，生长基本未受限
制；7~12：转AtEPSPS株系，与WT生长均受到明显抑制，出现变黄萎蔫
A: 0.3 mmol/L glyphosate; B: 0.5 mmol/L glyphosate; C: 1.0 mmol/L glyphosate. WT: Wild type ; 1~6: Trangenic plants express-
ing AtTIPS were hardly inhibited; 7~12: Trangenic plants expressing AtEPSPS were inhibited and turned into yellow and wilted as
well as WT
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
AtTIPS AtEPSPS WT
A
B
C鲜
重
/g
F
re
sh
w
ei
gh
t
A
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
AtTIPS AtEPSPS WT
a
b
c存
活
率
S
ur
vi
va
lr
at
e
B
图 8 0.5 mmol/L草甘膦胁迫下生长5 d的转基因拟南芥的鲜重(A)及存活率 (B)
Figure 8 The fresh weight (A) and survival rate (B) of transgenic plants grown under 0.5 mmol/L glyphosate condition
for 5 days
每个株系取5株为一组进行测量，实验设置3个重复。不同大写字母表示Duncans多重比较分析P＜0.01差异显著，不同小
写字母表示Duncan’s多重比较分析P＜0.05差异显著
Five plants each lines were tested as a group, the experiment was repeated three times. Different capital letters indicate the signifi-
cant difference according to Duncan’s multiple range test at P＜0.01 . Different lower case letters indicate the significant differ-
ence according to Duncan’s multiple range test at P＜0.05
8
403
农业生物技术学报
Journal of Agricultural Biotechnology
3 讨论
草甘膦在植物体内阻断莽草酸途径，靶蛋白是
EPSPS。我们克隆了拟南芥EPSPS基因，并通过重
叠延伸PCR介导的定点突变方法将其第 533位和
第 544位核苷酸，由C突变为 T，其蛋白序列的第
178位由苏氨酸(Thr)突变为异亮氨酸(Ile)，第 182
位由脯氨酸(Pro)突变为丝氨酸(Ser)，获得了突变基
因AtTIPS。为了验证其是否具有草甘膦抗性，我们
构建了原核表达载体，并转化EPSPS基因缺陷型大
肠杆菌菌株ER2799，对其进行不同浓度的草甘膦
抗性鉴定。结果显示，AtEPSPS及突变基因AtTIPS
都能够互补 EPSPS基因缺陷型菌株 ER2799的功
能，随着草甘膦浓度的不断增加，含 AtEPSPS的
ER2799重组菌株生长受到严重的抑制(图4)，而含
AtTIPS的ER2799重组菌株可以在含 20 mmol/L草
甘膦的M9培养基中生长良好，说明突变基因
AtTIPS具有较高的草甘膦抗性。
为了进一步验证其在植物中的抗性，将构建的
植物表达载体通过根癌农杆菌介导方法将两个基
因转化了野生型拟南芥(Col-0)。转基因株系和野
生型拟南芥草甘膦抗性鉴定结果显示，在 0.3、0.5
和 1.0 mmol/L草甘膦的胁迫条件下，野生型拟南
芥和转AtEPSPS拟南芥生长受到明显的抑制，出现
明显的变黄萎蔫现象。草甘膦抑制莽草酸途径，从
而抑制草甘膦敏感株系的根系的发育，并使幼苗叶
片出现萎黄的现象。植株死亡率和鲜重是容易评
价不同株系草甘膦抗性强弱的指标，转基因株系和
野生型植株的死亡率和鲜重统计结果显示，野生型
拟南芥和转AtEPSPS拟南芥死亡率和鲜重极显著
地小于转AtTIPS拟南芥的。过量表达EPSPS可以
在一定程度上削弱草甘膦对莽草酸途径的抑制作
用，增强对草甘膦的抗性(Holländer et al., 1988)；而
EPSPS基因拷贝数的增加也可以一定程度上增强
其对草甘膦的抗性 (Gaines et al., 2010; Powles,
2010)。仔细观察可以发现，在0.3和0.5 mmol/L草
甘膦胁迫下，转AtEPSPS拟南芥受抑制程度要低于
野生型拟南芥，鲜重统计也表明转AtEPSPS拟南芥
鲜重极显著高于野生型拟南芥(图8)。以上结果也
证明了过量表达EPSPS可以赋予拟南芥一定的草
甘膦抗性。为了排除基因表达量和拷贝数变化可
能造成的草甘膦抗性差异，本研究采用半定量RT-
PCR进行验证。结果表明，相对于野生型，两种拟
南芥转基因株系中AtEPSPS或AtTIPS基因的表达
量有所增加，但转基因株系间目的基因的表达量没
有明显变化，由此进一步证明过量表达EPSPS可以
一定程度上增强转基因拟南芥的草甘膦抗性。
AtTIPS转基因拟南芥在草甘膦胁迫条件下生长状
况要优于AtEPSPS转基因拟南芥，鲜重统计结果也
表明AtTIPS可以赋予转基因拟南芥较高的草甘膦
抗性(图7、8)。由此表明AtTIPS转基因株系相对于
AtEPSPS转基因株系较高的草甘膦抗性是由于关
键氨基酸位点的变异导致而非目的基因的表达量
增加所造成。其分子机理可能是由于两个氨基酸
改变导致相邻的氨基酸Gly177发生了一个轻微的
偏移，削弱了与草甘膦的结合。而 Ile178的突变在
一定程度上增强了与底物PEP的亲和能力，最终增
强了TIPS对草甘膦的抗性(Funke et al., 2009)。
在草甘膦胁迫条件下，AtEPSPS转基因拟南芥
相对于野生型拟南芥根系要短，同样的结果也出现
在AtTIPS转基因拟南芥与野生型拟南芥之间。在
根系长度上，转基因材料要略短于野生型，但是转
基因材料的侧根数要多于野生型拟南芥(图7)。在
无草甘膦胁迫的条件下，转基因与野生型拟南芥整
体长势及根的发育并没有明显差异；在有草甘膦胁
迫时，转基因株系与野生型材料之间出现根的长度
及侧根数目上的差异。这种表型上的差异可能与
AtEPSPS或 AtTIPS的过量表达进而影响莽草酸途
径及其他相关次生代谢途径的进行有关，其具体作
用机理有待进一步阐释。草甘膦竞争性地抑制
EPSPS的活性，导致植物莽草酸途径的中断或者受
阻。莽草酸途径受阻后会导致此途径中莽草酸含
量的增加。EPSPS转基因材料及非转基因材料在
草甘膦喷施 5~7 d后都有一个莽草酸积累的高峰。
但是草甘膦抗性表现优良的转基因植株随着喷施
后时间的延长，其莽草酸的积累量会迅速降低，而
野生型及草甘膦抗性一般的转基因植株莽草酸的
积累时间留存时间较长(Cao et al., 2012)。莽草酸
长时间的过量积累会导致莽草酸途径的正常进行
受阻，使其分枝酸的生成受到影响，进而导致酪氨
酸、苯丙氨酸及色氨酸等重要化合物不能正常合
成，严重影响植物的生长(Tzin, Galili, 2010)。
本研究所用的拟南芥 EPSPS(AtEPSPS)第 182
位的脯氨酸(Pro)对应于大肠杆菌EPSPS第 101位
的脯氨酸(Pro)。该位点在突变为亮氨酸、丝氨酸、
丙氨酸和甘氨酸后都会一定程度上提高其草甘膦
404
的耐受性，但是此位点并非是草甘膦直接的结合位
点，而是此位点在进行相应突变后可以导致草甘膦
的结合位点(第96位的甘氨酸和第97位的苏氨酸)
产生微小结构上的变动，降低草甘膦与EPSPS的结
合能力，提高其草甘膦抗性 (Baerson et al., 2002;
Healy et al., 2007; Kaundun et al., 2011; González et
al., 2012)。对其他位点的突变，也可能使突变基因
的草甘膦抗性得到提高，此方面需进一步研究。
4 结论
通过PCR方法克隆了拟南芥EPSPS基因，对
其进行定点突变，证明突变基因在EPSPS基因缺陷
型大肠杆菌菌株ER2799和转基因拟南芥植株中都
有很好的草甘膦抗性。随着我国现代农业生物技
术的发展，通过转基因的方法获得抗草甘膦转基因
作物是一个势在必行的策略。本研究为培育抗草
甘膦作物提供了一个候选基因。
参考文献
强胜,宋小玲,戴伟民. 2010.抗除草剂转基因作物面临的机
遇与挑战及其发展策略[J].农业生物技术学报, 18(1):
114- 125.(Qiang S, Song X L, Dai W M. 2010. The
opportunity and challenge faced by transgenic herbicide-
resistant crops and their development strategy[J].
Journal of Agricultural Biotechnology, 18(1): 114-125.)
Baerson S R, Rodriguez D J, Tran M, et al. 2002. Glyphosate-
resistant goosegrass. Identification of a mutation in the
target enzyme 5- enolpyruvylshikimate- 3- phosphate
synthase[J]. Plant Physiology, 129(3): 1265-1275.
Boocock M R, Coggins J R. 1983. Kinetics of 5-
enolpyruvylshikimate- 3- phosphate synthase inhibition
by glyphosate[J]. FEBS Letters, 154(1): 127-133.
Cao G Y, Liu Y J, Zhang S X, et al. 2012. A novel 5-
enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase shows high
glyphosate tolerance in Escherichia coli and tobacco
plants[J]. PloS ONE, 7(6): e38718.
Dill G M. 2005. Glyphosate-resistant crops: History, status and
future[J]. Pest Management Science, 61(3): 219-224.
Duke S O, Powles S B. 2008. Glyphosate: A once- in- a-
century herbicide[J]. Pest Management Science, 64(4):
319-325.
Funke T, Han H, Healy- Fried M L, et al. 2006. Molecular
basis for the herbicide resistance of Roundup Ready
crops[J]. Proceedings of the National Academy of
Sciences of the USA, 103(35): 13010-13015.
Funke T, Yang Y, Han H, et al. 2009. Structural basis of
glyphosate resistance resulting from the double
mutation Thr97→ Ile and Pro101→ Ser in 5-
enolpyruvylshikimate- 3- phosphate synthase from
Escherichia coli[J]. Journal of Biological Chemistry, 284
(15): 9854-9860.
Gaines T A, Zhang W, Wang D, et al. 2010. Gene
amplification confers glyphosate resistance in
Amaranthus palmeri[J]. Proceedings of the National
Academy of Sciences of the USA, 107(3): 1029-1034.
González- Torralva F, Gil- Humanes J, Barro F, et al. 2012.
Target site mutation and reduced translocation are
present in a glyphosate- resistant Lolium multiflorum
Lam. biotype from Spain[J]. Plant Physiology and
Biochemistry, 58: 16-22.
Hauptmann R, Della- Cioppa G, Smith A, et al. 1988.
Expression of glyphosate resistance in carrot somatic
hybrid cells through the transfer of an amplified 5-
enolpyruvylshikimic acid-3-phosphate synthase gene[J].
Molecular and General Genetics MGG, 211(2): 357-363.
Healy- Fried M L, Funke T, Priestman M A, et al. 2007.
Structural basis of glyphosate tolerance resulting from
mutations of Pro101 in Escherichia coli 5-
enolpyruvylshikimate- 3- phosphate synthase[J]. Journal
of Biological Chemistry, 282(45): 32949-32955.
Holländer- Czytko H, Johänning D, Meyer H E, et al. 1988.
Molecular basis for the overproduction of 5-
enolpyruvylshikimate 3- phosphate synthase in a
glyphosate- tolerant cell suspension culture of Corydalis
sempervirens[J]. Plant molecular Biology, 11(2): 215-220.
Kaundun S S, Dale R P, Zelaya I A, et al. 2011. A novel
P106L mutation in EPSPS and an unknown mechanism
(s) act additively to confer resistance to glyphosate in a
South African Lolium rigidum population[J]. Journal of
Agricultural and Food Chemistry, 59(7): 3227-3233.
Powles S B. 2010. Gene amplification delivers glyphosate-
resistant weed evolution[J]. Proceedings of the National
Academy of Sciences of the USA, 107(3): 955-956.
Steinrücken H, Amrhein N. 1980. The herbicide glyphosate is
a potent inhibitor of 5- enolpyruvylshikimic acid- 3-
phosphate synthase[J]. Biochemical and Biophysical
Research Communications, 94(4): 1207-1212.
Tzin V, Galili G. 2010. New insights into the shikimate and
aromatic amino acids biosynthesis pathways in plants[J].
Molecular Plant, 3(6): 956-972.
(责任编辑 马丽萍)
拟南芥5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶基因(EPSPS)的定点突变及抗草甘膦转基因拟南芥获得
Site-specific Mutagenesis of the Arabidopsis Gene (EPSPS) to Gain Glyphosate-resistant Transgenic Arabidopsis thaliana 405