全 文 ：


2008 年 第 53 卷 第 18 期: 2206 ~ 2215


2206 www.scichina.com csb.scichina.com
《中国科学》杂志社
SCIENCE IN CHINA PRESS 论 文
中国野生拟南芥居群冷胁迫下的表达谱变异
何飞①, 康菊清①, 周鑫②, 苏震②, 瞿礼嘉①③, 顾红雅①③*
① 蛋白质工程与植物遗传工程国家重点实验室, 北京大学-耶鲁大学植物分子遗传与农业生物技术联合中心, 北京大学生命科学学院,
北京 100871;
② 中国农业大学生物学院, 北京 100094;
③ 国家植物基因研究中心, 北京 100101
* 联系人, E-mail: guhy@pku.edu.cn
2008-05-04收稿, 2008-07-03接受
国家重点基础研究发展计划(批准: 2006CB100105)资助项目

摘要 利用 Affymetrix的拟南芥全基因组 ATH1芯片, 以拟南芥 Col生态型作为参照, 分析了
5个中国拟南芥野生居群在冷胁迫处理下转录水平的差异. 在正常生长条件下, 2.26% (513个
基因, 江西九江居群 JXjjx)至6.52% (1482个基因, 重庆铜梁居群CQtlx)的基因表达量超过对照
Col生态型 2倍以上. 在冷胁迫下, 12.84% (2920, 陕西城固居群 SXcgx)至 19.46% (4426, 新疆
青河居群 XJqhx)的基因表达水平相差两倍以上. 总体来说, 大部分上调基因可能对植物在低
温下生存十分重要, 如 MAPKs, CBFs, COR 基因以及提高冷耐受性小分子合成与积累的基因
等. 然而, 每一个野生居群在冷胁迫下都有其特异诱导表达的基因. 数据显示, 一些冷胁迫响
应基因在处于不同气候条件下的野生居群间发生了分化. CBF3 是一个冷胁迫应答途径的关键
转录因子, 其基因在居群间存在显著的表达差异. 序列分析表明, 主要是在调控区的变化导致
了表达模式的显著变化. 进一步对不同居群间基因表达差异与冷耐受性的相关性研究, 将为
揭示中国野生拟南芥适应本地环境的分子机制提供证据.
关键词
拟南芥
中国野生居群
芯片
表达谱
冷耐受性


作为固定不动的生物体 , 植物在特定的环境下
生存, 经受着不同的生物和非生物因素的胁迫. 不同
环境中 , 植物在其生命周期的不同阶段经受不同的
选择压力 . 居群内部及之间的遗传差异形成了进化
和选择的基础; 在自然选择作用下, 它们适应了各种
环境.
模式植物拟南芥是一个研究遗传变异与进化的
理想系统, 其原因有 3 个: 首先, 它的基因组已被完
全测序[1]; 其次, 在研究其居群(或生态型)内部和之
间遗传多样性特征方面已经取得快速进展[2~4]; 最后,
人们已对拟南芥植物进行了世界范围内的收集 , 发
现它们的生境多种多样[3].
温度是最为重要的气候因子之一 , 它限制了很
多植物物种的地理分布和生长季节[5]. 拟南芥通过一
种已知的冷驯化(cold acclimation)途径能够适应一定
程度的低温, 甚至是 0℃以下的温度[6,7]. 这一过程涉
及复杂的基因表达 , 这些基因涉及冷胁迫信号的感
受机制和潜在的低温感受体、低温胁迫信号传导体、
转录因子、靶标基因和代谢变化[8,9].
DNA 芯片技术为我们提供了一种新的工具, 可
用以系统分析大量基因的表达谱 . 生态学家或进化
生物学家能够用它在基因组水平上研究物种内或物
种间的表达模式 . 基于方差分析的新方法可以将由
个体、生态型、微环境、居群结构和地理分布的差异
导致的基因表达差异进行量化 [10]. 例如, Becher 等
人[11]和 Weber 等人[12]的两个研究组几乎在同时用拟
南芥基因组芯片 , 研究了拟南芥的一个近缘种 A.
halleri在高浓度金属离子胁迫下的表达谱, 在自然状
况下, 该物种能在体内积累大量的金属; Chen 等人[13]
通过 cDNA芯片研究了 5个拟南芥生态型在转录调节




2207
论 文
上的差异; Vuylsteke 等人[14]用芯片的方法检测了拟
南芥 3个自交和 2个杂交株系的转录丰度差异. 一些
研究组利用拟南芥基因组 ATH1 芯片 (Affymetrix,
Santa Clara, CA, USA)从基因的表达水平上鉴别不同
环境因子的效用[15,16]. 近来, 已有一些检测拟南芥冷
胁迫下基因表达谱的报道[17~22]; Hannah 等人[23]选取
了 9个有不同抗冻表型的拟南芥生态型, 研究了它们
的转录组和代谢谱的差异.
现有研究结果表明 , 具有表型差异的生态型在
冷耐受性上存在分化 [24~26]. 但是这些研究都没有包
括来源于中国的样品. 过去几年, 作者在中国收集了
约 30 个野生拟南芥居群, 并且对它们的遗传多样性
进行了初步的研究 [27]. 这些野生居群地理分布范围
很广, 从纬度 47°46.72N 到 26°44.78N. 本研究的目
的是研究这些野生居群之间的基因表达差异、这些居
群在应答冷胁迫下的基因表达差异以及造成这种差
异可能的分子机制.
1 材料与方法
(ⅰ) 植物材料与冷处理. 从作者野外采集的拟
南芥中选出 5个野生居群用于实验, 它们的地理分布
和生境情况见表 1. 野生居群命名法参照 He 等人的
方法[27]. Col生态型作为对照.
中国野生居群以及 Col 生态型的种子按照传统
的方法[28]经过灭菌后铺在MS琼脂糖固体平板上. 幼
苗在 22℃恒温培养箱中生长 3周, 光周期为 16 h 光
照/8 h黑暗. 平板随机放在培养箱的各个位置避免不
同的生长条件引起的实验误差 . 冷处理前将苗转移
到新的培养基上. 所有的冷处理均在下午 5点钟起始
至第二天下午 5 点钟结束, 以避免生物节律的影响.
植物材料使用抽苔前的植物避免发育调节基因的影
响. 每个居群取 25 株苗. 冷处理过程为正常光照强
度和光周期下(4±1)℃保温 24 h. 对照组样品同样转
移至新的培养基上, 在正常温度条件下生长 24 h.
(ⅱ) RNA提取和 cDNA合成. 收集每个样品整
株植物材料, 迅速置于液氮中冻存, 总 RNA 的提取
使用 Trizol 试剂盒 (Invitrogen Life Technologies,
Canada), RNA的纯化采用 RNAeasy试剂盒 (Qiagen,
USA), 均按产品说明使用. 纯化后 RNA 的完整性通
过甲醛-琼脂糖胶电泳检测, 浓度通过 260 nm波长光吸
收度测定 . 使用 SuperScriptTM Ⅱ RNase H-Reverse
Transcriptase 试剂盒 (Invitrogen, USA)将 5 μg 总
RNA反转录为 cDNA.
(ⅲ) 芯片数据分析. cRNA 的标记、杂交和信
号扫描操作参照 ATH1 芯片的使用说明(Affymetrix,
Santa Clara, USA). 基因芯片每个探针位点的信号强
度通过 Affymetrix的软件 GCOS (MAS 5.0)进行标准
化处理. 每张片子的 scale定义为 500, 这样不同的片
子之间可以直接比较. 为了找出差异表达的基因, 我
们计算了每个基因冷处理后相对于对照组的表达变
化倍数, 并对其取以 2为底的对数函数, 当 log2(ratio)
≥1, 该基因即为上调基因; log2(ratio)≤−1, 为下调
基因.
为了进行聚类分析 , 我们选取了一定的数据过
滤方法. 对一共得到的 6个生态型 13张芯片数据, 首
先计算每个生态型每个探针位点的 log2(冷处理 /对
照), 去除那些没有达到上调或者下调标准的位点 .
在计算 Col 生态型的处理/对照倍数的时候, 两套对
照组数据采用了与低温处理同时进行的一套数据 .
接着使用选择过的 13 张芯片的信号值进行
hierachical 聚类 , 采用常用的 Eisen 算法和软件
(http://rana.lbl.gov/EisenSoftware.htm)进行分析 . 不
同样品的表达谱聚类关系通过树形结构来展示 , 其
分支长短反应了关系的远近.
运用 Gene Ontology Consortium (http://www. ge-
neontology.org/)中的 Gene Ontology (GO) terms and
annotations对选出的基因进行分类, 其间所有数据均
来自于万维网. KOBAS 软件 [29]用于识别应答冷胁

表 1 5个中国野生居群的地理分布和生境气候信息
居群 地理位置 纬度 经度 海拔/m 株高/cm 年平均气温(℃)
春季平均气
温(℃)a)
年降水量
/mm
春季降水量
/mm
Hqsx 安徽潜山 30°44.77N 117°37.43E 150 28.9 16.2 15.6 1378.7 441.7
CQtlx 重庆铜梁 29°49.40N 106°03.38E 263 23.4 18.9 19.0 1088.0 279.0
JXjjx 江西九江 29°35.68N 115°54.74E 80 21.1 17.5 16.7 1521.2 628.2
SXcgx 陕西城固 32°55.93N 107°12.65E 607 39.0 13.6 13.9 843.9 186.9
XJqhx 新疆青河 46°48.72N 90°20.39E 1400 16.4 0.1 8.25 165.0 25.9
a) 新疆青河的春季为 4月初到 5月底(当地拟南芥生长季节), 其他地区的春季为 3月初到 5月底



2008 年 9 月 第 53 卷 第 18 期
2208
迫的生化和代谢途径.
(ⅳ) 实时定量 PCR (qRT-PCR). 选取了 59个有
着不同表达水平和参与不同代谢途径的基因, 通过
qRT-PCR 来验证芯片数据. 采用与整个拟南芥基因
组所有其他基因的一致性小于 70%的标准来选择基
因特异的引物位置 , 同时尽量保证产物片段大小在
120~150 bp范围内, 并且跨过一个内含子, 所有设计
借助于软件 Primer 3 (http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/
primer3/primer3_www.cgi). RT-qPCR使用ABI PRISM
7700 仪器以及 DyNAmo SYBR Green qPCR 试剂盒
(Finnzymmes, Finland). 反应体系 20 μL, 包含 0.25
μmol/L引物、2 μL (约相当于 6.25 ng总 RNA)与芯片
实验相同的 cDNA 模板以及适当的 mix(酶和荧光染
料等反应试剂). PCR反应过程: 起始聚合酶活化步骤,
94℃, 10 min; 94℃变性 30 s, 59℃退火 30 s, 72℃延伸
30 s, 40个循环. 每个循环的延伸步骤过后选择合适
的温度读取反应体系的荧光强度 . 阴性对照为反应
溶液中不加 cDNA. 拟南芥基因 EF1α 在各个居群和
各项处理当中表达几乎没有变化 , 选定其为实验的
固定内参基因, 用来标准化模板初始量之间的微小
差异. 每个反应重复 3次.
(ⅴ) CBF3的 PCR扩增和序列分析. 根据 Col生
态型的序列在编码区设计引物扩增 CBF3 的启动子区
和编码区. PCR反应为: 94℃, 50 s, 60℃, 50 s, 72℃, 2
min, 35个循环. 扩增产物用 QIAquick PCR 纯化试剂
盒 (Qiagen, Valencia, CA)纯化后用 pGEM-T Easy
Vector System (Promega, Madison, WI)克隆. 通过 PCR
筛选 50个有合适长度插入的克隆, 每种不同插入长度
的克隆中随机选 5个进行序列测定和比较.
2 结果与分析
2.1 芯片数据质量
本研究获得了 13 套表达芯片数据, 其中 7 套为
正常生长条件(Col 有重复一次), 另外 6 套为冷处理.
两个 Col 生态型在正常生长条件下芯片的重复
Pearson 相关系数为 0.965. 在 22746 个总探针组中,
有 13655 (江西九江居群冷处理)到 14963 (Col 对照)
个探针组可以检测出表达信号 (P < 0.05), 占总探针
组的(63.00±1.76)%. 冷处理样品与对照所检测出的
表达基因数目没有明显区别 . 所有芯片中至少检测
到一次表达的总基因数为 17651, 与未处理的自身对
照相比, 其中有 8981 个基因的表达量至少发生两倍
以上的变化 . 选取了这些有显著变化的基因进行聚
类分析, 结果显示, 13 张芯片分为两个大的分支: 其
一为冷处理样品, 另一为未处理的对照组(图 1). 尽
管这两个分支的拓扑结构不完全相同, 但是 AHqsx
和 CQtlx总是聚在一起, 而 XJqhx和 Col总是在基部.
而且, 用 qRT-PCR 验证芯片数据时, 在所选择的 59
个基因中, 有 40个的表达模式与芯片数据的 Pearson
相关系数大于 0.8. 而另外 19个相关系数较低的基因
大部分是因为在芯片上的信号强度较低 , 因此本身
的误差较大. 所有数据显示芯片质量较好, 适宜进一
步分析.


图 1 冷胁迫和对照样品表达谱的聚类分析
t, 冷处理; c, 对照
2.2 比较正常条件下的表达谱
在正常生长条件下, 总共有 11632个基因在 7张
芯片中表达. 总的来说, 5 个野生居群的表达谱相似,
它们之间最小的 Pearson相关系数为 0.9297. 5个野生
居群相对 Col有约 2.26% (513个基因, JXjjx)到 6.52%




2209
论 文
(1482, CQtlx)的基因表达水平相差两倍以上. 其中 25
个在野生居群中都高于 Col, 62个低于 Col. 其中有些
有意思的基因. 例如, WRKY70 是一个 WRKY 转录
因子家族的植物防卫基因[30], 所有野生居群都比 Col
表达要高, 尤其是新疆青河居群(XJqhx)的表达量是
Col的 16倍. 这些表达变化的基因, 很大一部分参与
代谢调节, 25个上调基因中的 10个和 62个下调基因
的 22 个属于这一类. 相对这一小部分在 5 个居群共
享的表达差异的基因, 大部分基因为居群特异的(表
2). 重庆铜梁居群(CQtlx)有 734个基因表达水平相对
Col上调超过两倍以上.
2.3 冷胁迫应答基因
在冷胁迫下有 12.84% (2920, SXcgx)到 19.46%
(4426, XJqhx)基因表达水平相差两倍以上(表 3).
每个居群有应答冷胁迫而表达发生变化的一组
基因. 在 5个居群中, CQtlx和XJqhx居群分别生长在
最高和最低的年平均温度环境中 , 有着最大数目的
基因应答冷胁迫(表 3). 但是它们仅仅有 934 个共享
的上调基因, 少于 CQtlx 和 AHqsx 共享的基因(1004
个基因 ). 对冷胁迫应答基因的聚类的结果也揭示
AHqsx和 CQtlx关系最近(图 1).
如果用 Col 生态型正常生长下的表达谱作为野
生居群的对照, 我们发现, 5 个野生居群共享了 768
个上调基因和 868个下调基因. 这些基因可能参与了
植物应答冷胁迫的一些共同的机制. 表 4中显示的是
SLR (Signal Log Ratio)大于 4的基因, 也就是说这些
基因相对 Col, 其表达量上升了 16倍以上. 这些基因
中, 有许多为冷胁迫应答的“标记”基因. 如 LEA类基
因, 它们编码的蛋白可在冷胁迫下稳定细胞膜, 以防
止脱水[31]. CBF2 是植物冷耐受反应中的一关键转录
因子, 在冷处理后 24 h仍维持高水平的表达. 图 2是
几个冷处理后上调基因的芯片及 qRT-PCR数据.
当把每一个居群上调或下调的基因进行功能分
类后再进行比较时 , 我们发现参与不同生物过程的
应答冷胁迫的基因数目在居群间存在差别(图 3), 尤
其是有关转运、转录、刺激应答、细胞分化、蛋白代
谢和代谢相关等生物过程.
运用 KOBAS (KEGG Orthology Based Annota-
tion System)系统[29], 分析了各个样品上调基因可能
参与的冷胁迫应答的代谢途径. 结果显示, 有 5 (Col)
到 10 (XJqhx)个代谢途径显著上调(P < 0.05)(表 5). 类
黄酮生物合成与孔状离子通道这两个途径为所有居群
和生态型共有(P < 0.01). 而蛋白折叠相关过程、MAPK
信号途径和朊病毒途径这 3个途径只在 5个中国野生
居群中显著上调, 在 Col中变化不显著. RNA聚合酶
在 4个野生居群中(AHqsx, CQtlx, JXjjx和 XJqhx)显
著上调, 而一些途径仅为两三个居群共有, 如谷胱甘
肽代谢途径仅在 CQtlx和 XJqhx里显著上调.

表 2 在正常生长条件下野生居群相对 Col的基因差异表达概况
变化基因数 a) 信号 log比值 b) 居群 总数 上调(I) 下调(D) 最大上调量 最大下调量 百分数
AHqsx 1025 551 474 5.15 −4.83 4.51%
CQtlx 1438 734 704 4.83 −4.82 6.32%
JXjjx 523 179 344 3.62 −4.49 2.30%
SXcgx 689 299 390 5.75 −4.15 3.03%
XJqhx 979 507 472 5.18 −5.74 4.30%
a) log比值大于 1的基因数; b) 信号 log比值测量的是转录水平上调或下调的变化幅度

表 3 在冷胁迫下各居群表达上调和下调的基因概况
变化基因数 a) 信号 log比值 b) 居群 总数 上调(I) 下调(D) 最大上调量 最大下调量 百分数
AHqsx 3305 1282 2023 6.08 −6.35 14.53
CQtlx 4229 1843 2386 6.23 −7.00 18.59
JXjjx 2954 1311 1643 6.01 −5.66 12.99
SXcgx 2920 1305 1615 6.69 −5.92 12.84
XJqhx 4426 1425 3001 7.26 −6.38 19.46
Col 3280 1314 1966 6.86 −6.24 14.42
a) log比值大于 1的基因数; b) 信号 log比值测量的是转录水平上调或下调的变化幅度




2008 年 9 月 第 53 卷 第 18 期
2210

图 2 4个受冷处理上调的基因的芯片数据和 qRT-PCR实验结果的比较
(a) LEA76; (b) CBF2; (c) PR-1; (d) Kin2. ■qRT-PCR; ◆芯片数据


图 3 冷胁迫下野生居群中上调和下调基因的功能分类
(a) 上调基因; (b) 下调基因




2211
论 文

表 4 冷胁迫下野生居群中高表达(SLR>4)的基因
位点 AHqsx/Col CQtlx/Col JXjjx/Col SXcgx/Col XJqhx/Col 注释
At3g17520 8.69 7.48 7.42 6.52 6.52 LEA家族蛋白
At4g29200 8.47 8.34 7.70 2.04 9.36 可能编码的蛋白
At3g15670 9.13 8.19 4.25 8.24 5.75 LEA家族蛋白, 预测
At2g21820 8.79 8.39 4.06 5.97 7.53 表达的蛋白
At5g06760 7.75 6.73 5.62 6.26 7.76 LEA家族蛋白 1
At2g15560 7.41 6.60 4.47 7.41 8.02 表达的蛋白
At2g46830 6.59 6.89 5.89 6.27 7.43 Myb相关转录因子(CCA1)
At1g66690 5.31 5.88 7.97 6.91 4.99 功能未知
At2g21320 5.65 6.34 5.88 5.91 6.84 锌指(B型)家族蛋白
At1g52690 7.05 6.13 4.67 5.21 6.72 LEA家族蛋白, 预测
At4g18650 5.84 5.72 5.89 6.24 5.72 转录因子相关蛋白
At4g25470 6.05 6.22 5.86 5.89 5.10 CRT/DRE结合因子 2 (CBF2)
At1g48100 5.31 5.22 5.26 6.34 6.19 糖苷水解酶家族蛋白 28
At2g46790 5.28 5.55 4.82 5.25 6.71 功能未知
At5g52300 7.18 5.88 3.96 4.78 5.62 低温应答蛋白
At5g10140 5.42 5.16 6.08 5.38 5.34 MADS-box蛋白(Fl-F)
At1g61800 5.34 5.07 4.59 4.96 6.65 6-磷酸葡萄糖易位蛋白
At1g60190 5.56 5.35 4.65 4.86 5.77 犰狳/β-联蛋白重复单位家族蛋白
At3g55580 3.98 4.27 5.99 5.57 5.29 RCC1家族蛋白调节子
At3g12580 4.70 5.02 4.89 3.75 6.58 热激蛋白 70, 预测
At1g80130 4.67 4.32 4.53 5.78 5.23 表达的蛋白
At5g12030 4.26 5.20 6.03 2.31 6.68 17.7 kD二型热激蛋白 17.6A
At3g22840 4.81 4.72 5.18 4.50 4.99 叶绿素 A-B结合家族蛋白
At5g52310 4.76 4.61 3.42 5.52 5.84 低温应答蛋白 78
At2g42540 5.04 4.89 3.79 5.00 5.32 冷调节蛋白(cor15a)
At4g15480 4.47 4.40 7.78 2.80 4.54 尿苷二磷酸糖基转移酶
At4g14690 4.52 4.70 5.20 4.32 5.00 早期光诱导蛋白, 预测
At3g02480 6.14 5.19 4.29 3.70 4.34 ABA应答相关蛋白
At3g12320 4.50 4.70 3.73 4.98 5.44 表达的蛋白
At5g13170 5.09 5.12 4.40 3.72 4.23 结瘤素 MtN3家族蛋白
At1g09350 1.94 2.00 5.45 7.69 5.40 肌醇半乳糖合酶, 预测
At2g27420 4.47 4.75 4.12 3.76 5.33 半胱氨酸蛋白酶, 预测
At2g47770 5.79 4.89 4.06 3.50 4.05 苯二氮受体相关蛋白, 预测
At1g16850 4.17 3.52 1.91 5.98 6.33 表达的蛋白
At5g54470 3.48 4.01 5.15 3.61 5.66 锌指(B-box型)家族蛋白
At1g51090 3.41 2.77 2.93 5.99 6.42 含有重金属相关结构域的蛋白
At1g01060 4.80 3.76 3.70 4.26 4.98 Myb家族转录因子
At5g15850 3.60 4.19 5.47 3.89 4.30 锌指蛋白(COL1)
At1g02820 3.74 3.87 4.24 4.14 5.34 LEA3家族蛋白
At1g54040 5.74 5.06 3.79 5.24 1.40 含 Kelch重复单位的蛋白
At1g73480 3.96 3.88 3.38 4.99 4.63 水解酶, alpha/beta折叠家族蛋白
At5g53970 3.94 3.82 4.34 3.63 4.64 转氨酶, 预测
At3g51240 4.14 3.92 3.93 3.96 4.27 黄烷酮 3-羟化酶(F3H)
At4g03060 3.64 3.93 5.20 3.75 3.58 依赖 2-氧戊二酸的加双氧酶
At5g24120 4.25 4.38 3.50 3.05 4.85 RNA聚合酶σ 亚基 SigE




2008 年 9 月 第 53 卷 第 18 期
2212
2.4 ICE1-CBF途径和 CBF3基因的变异
很多基因参与了植物的冷胁迫应答反应 , 近来
一些研究对这一反应进行了深入的研究及全面的总
结 [5,7,32~35]. 参与这一反应的基因可分为两个途径 :
CBF依赖途径和 CBF独立途径(又称ABA依赖途径).
越来越多的证据表明 , 这两个途径有所重叠 [33].
HOS9和 HOS10通过 CBF独立途径在调节冷驯化过
程中发挥了重要作用 [36,37]. 在本研究的芯片数据中,
HOS9 在 XJqhx 和 Col 中略微上调, 而在 AHqsx 和
SXcgx 中则下调; HOS10 在大部分居群中都下调了.
但 NCED3, 一个编码 ABA合成的限速酶基因却在所
有的冷处理样品中都上调了.
ICE1 是 CBF 途径上游的一个关键调节基因[38],
其表达无论是在正常生长条件下还是在冷处理下都
没有明显变化 . 有意思的是 , 在所有野生居群中
CBF1 和 CBF2 在一定程度上都被诱导表达了 , 但
CBF3只在 XJqhx和 Col中 24 h冷处理后仍然高水平
表达, 而在其他 4 个居群中几乎检测不到(图 4(a)).
在 Real-time PCR验证时, 我们也得到了同样的结果
(图 4(b)). 测序结果表明, 在 CBF3的编码区变化很小,
而且变化式样与它们表达式样不相符, 也就是说, 没
有 XJqhx和 Col 或 AHqsx, CQtlx, JXjjx和 SXcgx共
享的变异; 但在对 CBF3的启动子区的序列分析则发
现, 它们在长度上存在很大差异. 在 AHqsx, CQtlx,
JXjjx和 SXcgx中发现, 在CBF3编码区上游约 140 bp
的地方有约 1800 bp片段的插入, 而 XJqhx和 Col的
相应片段只有 859 bp(图 5).
3 讨论
3.1 表达谱差异
本研究所选取的 5 个野生居群代表了拟南芥在
中国从北到南的地理分布和所处的不同生境(表 1);

图 4 在野生居群和 Col中 CBF3的表达数据
(a) 芯片数据; (b) qRT-PCR数据

同时, 根据 ISSR 和 RAPD 的分析结果, 它们的遗传
距离相对较远[27]. 当以 Col为参照, 将不同野生居群
在正常生长条件下的表达谱进行比较时, 2.26% (513,
JXjjx vs Col)到 6.52% (1482, CQtlx vs Col)的基因表
达水平变化超过 2倍. 这一结果和前人的研究结果比
较一致. 例如, Vuylsteke等人[14]的研究表明, Col相对
Cvi的差异表达基因为 5.74%, Col对Ler为 4.92%, Col
对 Ler为 4.13%. Chen等人[13]发现的拟南芥 5个生态
型的大部分基因(79.7%)的表达模式相关, 这表明大
部分基因在生态型或居群间共享同一表达模式 . 比
较有意思的是, 中国野生拟南芥与 Col表达有差异的


图 5 CBF3的启动子和编码区的变异示意图
灰色区域为编码区, 黑色竖杠为变异位点, 星号为编码区的变异位点





2213
论 文
基因约有 35%~40%参与代谢途径. 这可能与 Col 经
过实验室温室历经数十年的某种选择后 , 代谢上发
生了一些变化相关.
已有报道表明, 大约 13%~18%拟南芥基因组参
与冷胁迫应答的转录变化[17,19,22]. 中国的野生居群与
这一现象较为相似(13%~19%). 当把 5个野生居群与
Col的冷胁迫应答途径对比时, 它们只共有两个途径,
即孔状离子通道和类黄酮生物合成途径 . 现已知拟
南芥受低温胁迫时, 类黄酮开始积累, 最终能提高冷
耐性[39,40]; 而一些离子, 如 Ca2+, 在冷驯化的信号传
导过程中起到了关键作用[8,34]. 激活这些途径也许对
拟南芥的冷耐受是必不可少的. 有 4个途径是中国野
生居群共有的, 即 MAPK 信号途径、蛋白折叠及其相
关加工途径、糖代谢和普里昂疾病相关基因(表 5), 这
可能表明这 4个野生居群有着较近的遗传关系, 也可
能表明这是野生居群的特性.
已有研究表明 , 表型各异的拟南芥生态型在冷
耐受性上存在差异[24~26]. 中国的 5个野生居群分布在
不同的环境中, 冷处理下在不同的居群发现一些独
特的上调途径并不奇怪. 新疆、陕西野生居群和 Col
生态型各能找到 2个独特的途径. 这些途径中有些是
与次级代谢相关, 如吲哚、吐根生物碱和类萜生物合
成, 有些是与某些特殊氨基酸代谢相关, 一些与硝基
苯降解相关 . 进一步的工作应该研究这些基因表达
的差异是否造成了居群或生态型对冷耐受性的差异.
3.2 CBF途径基因的差异
CBFs 是 C-重复结合因子(C-repeat (CRT)-bind-
ing factors, 它们属于 AP2 转录因子 (AP2-domain
transcription factors)家族[41]. 以前的研究表明, 它们
在冷耐受性方面起了关键作用 , 参与这一途径的很
多基因已被鉴定[33]. 当植物暴露在低温下, 它们就被
特异诱导表达. 过量表达 CBFs 基因会提高植物的冷
冻耐受性 [42~46]. Alonso-Blanco 等人 [24]发现一个在
CBF2 的启动子区有一段缺失的拟南芥野生居群, 它
的冷冻耐受性比其他居群要低. 有报道表明 CBF2是
CBF1 和 CBF3 的负调控因子[47]. 在野生居群 Ahqsx,
CQtlx, JXjjx和 SXcgx的CBF3的启动子区域有一个天
然的突变, 造成了该基因在冷胁迫下失活, 这无疑是
一个非常好的材料 , 可用于研究植物在不同环境下
适应的分子机制.
表 5 KOBAS鉴别的冷胁迫下上调基因中显著的代谢途径
居群 变化显著的途径 基因数 P值
AHqsx 孔状离子通道 7 0.001371
类黄酮生物合成途径 11 0.005668
蛋白折叠及其相关的加工 29 0.005668
普里昂疾病相关基因 5 0.009157
MAPK信号途径 13 0.023896
Ⅰ型糖尿病相关基因 5 0.028075
RNA聚合酶 10 0.043045
CQtlx 核糖体 97 0
Ⅰ型糖尿病相关基因 7 0.007548
谷胱甘肽代谢途径 17 0.007548
孔状离子通道 7 0.007548
蛋白折叠及其相关的加工 40 0.007548
RNA聚合酶 15 0.008617
MAPK信号途径 18 0.01184
类黄酮生物合成途径 12 0.040555
普里昂疾病相关基因 5 0.040981
JXjjx 孔状离子通道 9 6.76×10−6
Ⅰ型糖尿病相关基因 7 0.000974
蛋白折叠及其相关的加工 31 0.001807
类黄酮生物合成途径 11 0.006754
普里昂疾病相关基因 5 0.009487
RNA聚合酶 11 0.020869
MAPK信号途径 13 0.027561
SXcgx 孔状离子通道 9 4.50×10−6
类黄酮生物合成途径 13 0.000314
Ⅰ型糖尿病相关基因 7 0.000481
蛋白折叠及其相关的加工 31 0.000528
MAPK信号途径 15 0.00198
普里昂疾病相关基因 5 0.006421
硝基苯降解途径 8 0.032565
氨基磷酸酯代谢途径 8 0.032565
含硒氨基酸代谢途径 11 0.032565
XJqhx 类黄酮生物合成途径 13 0.000795
孔状离子通道 7 0.000809
蛋白折叠及其相关的加工 31 0.001138
MAPK信号途径 14 0.011414
胆汁酸代谢途径 10 0.013823
谷胱甘肽代谢途径 12 0.016746
Ⅰ型糖尿病相关基因 5 0.026830
吲哚和吐根生物碱合成途径 4 0.039014
RNA聚合酶 10 0.040351
普里昂疾病相关基因 4 0.044764
Col 类黄酮生物合成途径 12 0.004227
孔状离子通道 6 0.009712
萜类化合物生物合成途径 7 0.014355
氨基磷酸酯代谢途径 9 0.016733
酪氨酸代谢途径 15 0.032463




2008 年 9 月 第 53 卷 第 18 期
2214
致谢 感谢中国农业大学阎红老师提供的高质量芯片技术支持, 也感谢毛希增博士提供的 KOBAS分析.
参考文献
1 The Arabidopsis Genome Initiative. Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana. Nature, 2000, 408:
796—815
2 Alonso-Blanco C, Mendez-Vigo B, Koornneef M. From phenotypic to molecular polymorphisms involved in naturally occurring
variation of plant development. Int J Dev Biol, 2005, 49: 717—732
3 Koornneef M, Alonso-Blanco C, Vreugdenhil D. Naturally occurring genetic variation in Arabidopsis thaliana. Annu Rev Plant Biol,
2004, 55: 141—172
4 Mitchell-Olds T, Schmitt J. Genetic mechanisms and evolutionary significance of natural variation in Arabidopsis. Nature, 2006, 441:
947—952
5 Thomashow M F. Plant cold acclimation: Freezing tolerance genes and regulatory mechanisms. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol
Biol, 1999, 50: 571—599
6 Guy C L. Cold acclimation and freezing stress tolerance: Role of protein metabolism. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol, 1990,
41: 187—223
7 Thomashow M F. So what’s new in the field of plant cold acclimation? Lots! Plant Physiol, 2001, 125: 89—93
8 Han S, Tang R, Anderson L K, et al. A cell surface receptor mediates extracellular Ca(2+) sensing in guard cells. Nature, 2003, 425:
196—200
9 Orvar B L, Sangwan V, Omann F, et al. Early steps in cold sensing by plant cells: The role of actin cytoskeleton and membrane fluid-
ity. Plant J, 2000, 23: 785—794
10 Gibson G. Microarrays in ecology and evolution: A preview. Mol Ecol, 2002, 11: 17—24
11 Becher M, Talke I N, Krall L, et al. Cross-species microarray transcript profiling reveals high constitutive expression of metal homeo-
stasis genes in shoots of the zinc hyperaccumulator Arabidopsis halleri. Plant J, 2004, 37: 251—268
12 Weber M, Harada E, Vess C, et al. Comparative microarray analysis of Arabidopsis thaliana and Arabidopsis halleri roots identifies
nicotianamine synthase, a ZIP transporter and other genes as potential metal hyperaccumulation factors. Plant J, 2004, 37: 269—281
13 Chen W, Chang S, Hudson M E, et al. Contribution of transcriptional regulation to natural variations in Arabidopsis. Genome Biol,
2005, 6: R32
14 Vuylsteke M, van Eeuwijk F, van Hummelen P, et al. Genetic analysis of variation in gene expression in Arabidopsis thaliana. Genet-
ics, 2005, 171: 1267—1275
15 Redman J C, Haas B J, Tanimoto G, et al. Development and evaluation of an Arabidopsis whole genome Affymetrix probe array.
Plant J, 2004, 38: 545—561
16 Zhu T. Global analysis of gene expression using GeneChip microarrays. Curr Opin Plant Biol, 2003, 6: 418—425
17 Fowler S, Thomashow M F. Arabidopsis transcriptome profiling indicates that multiple regulatory pathways are activated during cold
acclimation in addition to the CBF cold response pathway. Plant Cell, 2002, 14: 1675—1690
18 Hannah M A, Heyer A G, Hincha D K. A global survey of gene regulation during cold acclimation in Arabidopsis thaliana. PLoS
Genet, 2005, 1: e26
19 Kreps J A, Wu Y, Chang H S, et al. Transcriptome changes for Arabidopsis in response to salt, osmotic, and cold stress. Plant Physiol,
2002, 130: 2129—2141
20 Maruyama K, Sakuma Y, Kasuga M, et al. Identification of cold-inducible downstream genes of the Arabidopsis DREB1A/CBF3
transcriptional factor using two microarray systems. Plant J, 2004, 38: 982—993
21 Oono Y, Seki M, Satou M, et al. Monitoring expression profiles of Arabidopsis genes during cold acclimation and deacclimation using
DNA microarrays. Funct Integr Genomics, 2006, 6: 212—234
22 Seki M, Narusaka M, Ishida J, et al. Monitoring the expression profiles of 7000 Arabidopsis genes under drought, cold and
high-salinity stresses using a full-length cDNA microarray. Plant J, 2002, 31: 279—292
23 Hannah M A, Wiese D, Freund S, et al. Natural genetic variation of freezing tolerance in Arabidopsis. Plant Physiol, 2006, 142: 98—
112
24 Alonso-Blanco C, Gomez-Mena C, Llorente F, et al. Genetic and molecular analyses of natural variation indicate CBF2 as a candidate
gene for underlying a freezing tolerance quantitative trait locus in Arabidopsis. Plant Physiol, 2005, 139: 1304—1312




2215
论 文
25 Rohde P, Hincha D K, Heyer A G. Heterosis in the freezing tolerance of crosses between two Arabidopsis thaliana accessions (Co-
lumbia-0 and C24) that show differences in non-acclimated and acclimated freezing tolerance. Plant J, 2004, 38: 790—799
26 Zuther E, Buchel K, Hundertmark M, et al. The role of raffinose in the cold acclimation response of Arabidopsis thaliana. FEBS Lett,
2004, 576: 169—173
27 He F, Kang D, Ren Y, et al. Genetic diversity of the natural populations of Arabidopsis thaliana in China. Heredity, 2007, 99: 423—
431
28 Qin G, Gu H, Zhao Y, et al. An indole-3-acetic acid carboxyl methyltransferase regulates Arabidopsis leaf development. Plant Cell,
2005, 17: 2693—2704
29 Mao X, Cai T, Olyarchuk J G, et al. Automated genome annotation and pathway identification using the KEGG Orthology (KO) as a
controlled vocabulary. Bioinformatics, 2005, 21: 3787—3793
30 Li J, Brader G, Palva E T. The WRKY70 transcription factor: A node of convergence for jasmonate-mediated and salicylate-mediated
signals in plant defense. Plant Cell, 2004, 16: 319—331
31 Bernacchia G, Furini A. Biochemical and molecular responses to water stress in resurrection plants. Physiol Plant, 2004, 121: 175—
181
32 Chinnusamy V, Zhu J, Zhu J K. Gene regulation during cold acclimation in plants. Phys Plant, 2006, 126: 52—61
33 Chinnusamy V, Zhu J, Zhu J K. Cold stress regulation of gene expression in plants. Trends Plant Sci, 2007, 12: 444—451
34 Sharma P, Sharma N, Deswal R. The molecular biology of the low-temperature response in plants. Bioessays, 2005, 27: 1048—1059
35 Smallwood M, Bowles D J. Plants in a cold climate. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 2002, 357: 831—847
36 Zhu J, Shi H, Lee B H, et al. An Arabidopsis homeodomain transcription factor gene, HOS9, mediates cold tolerance through a
CBF-independent pathway. Proc Natl Acad Sci USA, 2004, 101: 9873—9878
37 Zhu J, Verslues P E, Zheng X, et al. HOS10 encodes an R2R3-type MYB transcription factor essential for cold acclimation in plants.
Proc Natl Acad Sci USA, 2005, 102: 9966—9971
38 Chinnusamy V, Ohta M, Kanrar S, et al. ICE1: a regulator of cold-induced transcriptome and freezing tolerance in Arabidopsis. Genes
Dev, 2003, 17: 1043—1054
39 Fiorani F, Umbach A L, Siedow J N. The alternative oxidase of plant mitochondria is involved in the acclimation of shoot growth at
low temperature. A study of Arabidopsis AOX1a transgenic plants. Plant Physiol, 2005, 139: 1795—1805
40 Leyva A, Jarillo J A, Salinas J, et al. Low temperature induces the accumulation of phenylalanine ammonia-lyase and chalcone synthase
mRNAs of Arabidopsis thaliana in a light-dependent manner. Plant Physiol, 1995, 108: 39—46
41 Stockinger E J, Gilmour S J, Thomashow M F. Arabidopsis thaliana CBF1 encodes an AP2 domain-containing transcriptional activa-
tor that binds to the C-repeat/DRE, a cis-acting DNA regulatory element that stimulates transcription in response to low temperature
and water deficit. Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 94: 1035—1040
42 Gilmour S J, Fowler S G, Thomashow M F. Arabidopsis transcriptional activators CBF1, CBF2, and CBF3 have matching functional
activities. Plant Mol Biol, 2004, 54: 767—781
43 Gilmour, S J, Sebolt, A M, Salazar, M P, et al. Overexpression of the Arabidopsis CBF3 transcriptional activator mimics multiple bio-
chemical changes associated with cold acclimation. Plant Physiol, 2000, 124: 1854—1865
44 Gilmour S J, Zarka D G, Stockinger E J, et al. Low temperature regulation of the Arabidopsis CBF family of AP2 transcriptional acti-
vators as an early step in cold-induced COR gene expression. Plant J, 1998, 16: 433—442
45 Jaglo-Ottosen K R, Gilmour S J, Zarka D G, et al. Arabidopsis CBF1 overexpression induces COR genes and enhances freezing tol-
erance. Science, 1998, 280: 104—106
46 Liu Q, Kasuga M, Sakuma Y, et al. Two transcription factors, DREB1 and DREB2, with an EREBP/AP2 DNA binding domain
separate two cellular signal transduction pathways in drought- and low-temperature-responsive gene expression, respectively, in
Arabidopsis. Plant Cell, 1998, 10: 1391—1406
47 Novillo F, Alonso J M, Ecker J R, et al. CBF2_DREB1C is a negative regulator of CBF1_ DREB1B and CBF3 DREB1A expression
and plays a central role in stress tolerance in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci USA, 2004, 101: 3985—3990