全 文 ：第 34卷第 2期
2 0 1 1年 3月
河 北 农 业 大 学 学 报
JOU RNAL OF AG RICULT URAL UNIVERSI TY OF HEBEI
　 　 V ol.34 No.2
M ar .2 0 1 1
文章编号:1000-1573(2011)02-0040-03
拟南芥微管蛋白 TUA2基因
表达载体的构建及亚细胞定位
刘海浩 , 　吴立柱 , 　潘延云
＊ (河北农业大学 生命科学学院 , 河北 保定 071001)
摘要:本研究以拟南芥(Arabidopsis thaliana.Co lumbia ecotype)为材料 ,运用 PC R方法从其基因组中扩增得到
了 TUA2 基因的序列 ,将其连接到表达载体 GV3101 上 ,构建成双元载体。把该质粒用基因枪转化法转化洋葱
表皮 , 激光共聚焦显微镜观察显示 , TUA2 基因在细胞膜上表达。该结果为进一步研究 TUA2 的作用机理提供
了基础。
关　键　词:拟南芥;TUA;基因枪
中图分类号:Q 257 文献标志码:A
Onstruction of expression vector and subcellular
localization of microtubulin TUA2 gene
from Arabidopsis thaliana
LIU Hai-hao , WU Li-zhu, PANYan-yun
(Co lleg e of Life Science s , Agricultural University of Hebei , Baoding 071000 , China)
Abstract:Genome sequence o f Arabidopsis thal iana TUA 2 genes has been amplif icated by
PCR , and w as connected into the expression vector GV 3101.The recombinant plasmid w as
transformed into onion epidermis by using gene gun.Laser confocal micro scope revealed that
the TUA2 gene expression in the cell membrane.This resul t provided the basis fo r fur ther re-
search of the funct ion of TUA2.
Key words:Arabidopsis thal iana;TUA;gene gun
　　微管(M icro tubule)是真核细胞中普遍存在的
蛋白结构 ,与微丝(Microfi lament)及中间纤维(In-
termediate filament)共同组成细胞骨架(Cy to skel-
eton)。微管在细胞形态 、细胞分裂 、物质运输 、能
量转换 、信息传递 、细胞分化 、细胞伸长及细胞极性
的决定等方面起着重要的作用[ 1-3] 。
不同物种中 ,微管蛋白均有多个不同的亚型。
许多实验证据表明 ,不同的异构体微管蛋白基因常
常在特定的发育阶段或特定的组织细胞中表达 ,是
受发育过程调控的。例如 , 拟南芥 β-微管蛋白
TUB1在根中优势表达 , TUB5主要在叶中表达;α-
微管蛋白基因 TUA1 主要在雄蕊和成熟花粉中大
量表达 ,并且在开花期转录物的积累达到高峰 ,而在
成熟植株的根和叶中均不表达[ 4] 。生物体为什么需
要维持多拷贝基因来编码结构非常相近的蛋白 ,组
织特异性基因所表达的微管蛋白异构体在功能上是
＊收稿日期:2010-09-20
基金项目:国家自然科学基金项目(30570993);河北省自然基金项目(C2008000292).
作者简介:刘海浩(1985-), 男 ,河北省沧州人 ,在读硕士生 , 主要从事植物抗逆生理研究.
通讯作者:潘延云(1963-), 女 ,河北省保定市人 ,博士 , 教授 ,从事植物细胞信号转导研究.E-mail:pyycell@163.com.
　第 2期　 刘海浩等:拟南芥微管蛋白 TUA2基因表达载体的构建及亚细胞定位
否是特异的 ,这些都是有待澄清的重要的生物学
问题[ 5] 。
TUA2作为拟南芥 6 种表达 TUA 基因中的一
种 ,许多证据表明它在拟南芥的生长发育以及对逆
境胁迫应答的过程中发挥了重要作用。Sandra 等
人发现 TUA2 蛋白在拟南芥的成熟花粉中有表
达[ 6] ,而 Geline So rin等通过蛋白质组学分析表明
TUA2蛋白可能参与了拟南芥不定根的产生过
程[ 7] 。TUA2在拟南芥对盐胁迫和外源根瘤菌胁迫
的响应过程中表达发生变化 ,暗示其可能参与了这
些生理反应[ 8-9] 。另外 T UA2 也是赤霉素调节种
子萌发过程和 BR信号系统中重要的表达蛋白之
一[ 10-1 1] 。上述试验大多是运用蛋白组学的方法来
检测 TUA2 蛋白表达量的变化 , 但拟南芥 6 种
TUA 基因亚型中 , TUA2和 TUA4所表达的 cDNA
是完全相同的[ 5] ,所以从蛋白入手研究 T UA 的功
能 ,不能区分 TUA2 和 TUA4 亚型的功能的特异
性 。要想澄清 TUA 家族各成员的生物学功能 ,还
要结合基因水平分析其作用机理 。本实验室前期工
作初步表明 TUA2基因突变体在拟南芥对逆境胁
迫的反应过程中存在与野生型不同的表型 ,为了研
究其功能 , 本研究构建了 pCAMBIA1300-T UA2-
GFP 重组载体 ,并通过基因枪的方法转化到洋葱表
皮细胞中 ,一方面验证载体构建是否正确 ,为进一步
进行拟南芥的遗传转化做前期准备;另一方面对该
基因进行亚细胞定位 ,为进一步研究该基因的作用
机理等后续研究奠定基础。
1　材料与方法
1.1　材料
农杆菌(GV3101)大肠杆菌(DH5α)及质粒
pCAMB I A1300均为本室保存 ,各种限制性内切酶
LA-Taq聚合酶为 TaKaKa 公司产品 , PEASY-T
vecto r试剂盒 , T4 连接酶为北京全式金生物技术有
限公司产品 ,质粒试剂盒和胶回收试剂盒均为北京
庄盟国际生物基因科技有限公司产品 ,测序由北京
六合华大基因科技股份有限公司完成 。
1.2　方法
根据GenBank中拟南芥 TUA2基因序列设计
引物 ,上下游引物分别引入 Sac Ⅰ , S al Ⅰ酶切位点 ,
以拟南芥基因组为模板 , PCR得到目的片段 ,产物
经序列测定正确后(北京六合华大基因科技股份有
限公司测序)。用 T4 连接酶连接到双元载体
pCAMBIA1300上构建GFP 融合表达载体 ,GFP 无
靶向信号肽 ,与基因 C-端融合 , 重组质粒 pCAM-
BIA1300-TUA2-GFP 转化感受态农杆菌 GV3101
并进一步侵染拟南芥 。
质粒 pCAMBIA1300-TUA2-GFP 用基因枪转
化洋葱表皮 ,用于基因亚细胞定位的研究。将打过
基因枪的洋葱表皮放于 22℃连续光照条件下培养
40 h ,然后将洋葱表皮置于 PIPES-KOH 缓冲液(20
mmo l/L , pH7.0)中浸泡 4 h , 随后在 LSM 510
MetuZEIss型激光扫描共聚焦显微镜上进行观察 。
观察条件为:514 nm 激发光 ,激光强度为 30%。
2　结果与分析
2.1　TUA2的克隆及表达载体构建
以拟南芥基因组为模板 ,按照上述方法扩增得
到约 2 600 bp的条带(图 1),测序结果与 GenBank
上登录的拟南芥 TUA2的序列一致 ,图 2显示的是
重组质粒 pCAMBIA1300-TUA2-GFP 的构建和酶
切鉴定结果。
M.Marker;1.TUA 2
图 1　PCR 产物电泳分析
Fig.1　Identification of PCR products
M .M ark er;1.pCAM BIA1300;2.TUA2
图 2　重组质粒双酶切鉴定结果
Fig.2　Identifiction of restrict product
41
　　　　　 河 北 农 业 大 学 学 报 第 34卷
2.2　pCAMBIA1300-TUA2-GFP 载体的基因枪转
化及荧光观察
基因枪法是将外源 DNA 包被在微小的金粒表
面在高压作用下高速射入受体细胞 ,微粒上的外源
DNA 进入细胞后整合到染色体上并表达 。本试验
将 pCAMBIA1300-TUA2-GFP 质粒通过基因枪法
转化洋葱内表皮 ,激光共聚焦显微镜观察 。结果显
示 ,与对照相比 ,目的质粒转化的洋葱表皮细胞在细
胞膜上有荧光分布(图 3)。表明 ,构建的质粒能够
正确表达 TUA2 和 GFP 的融合蛋白 ,该重组质粒
可以用于后续的拟南芥遗传转化实验;T UA2蛋白
主要在细胞膜上分布(A ,B , C 箭头所指 , D为空载
对照 ,显示在细胞膜和细胞核中均有表达)。
AB:洋葱表皮细胞荧光图;C:洋葱表皮细胞质壁分离荧光图;D:空
载对照质壁分离荧光图。
图 3　TUA2 基因的亚细胞定位
Fig.3　Subcellular localization of TUA2
3　讨论
植物细胞微管受到外界环境刺激时始终保持着
动态特性 ,并响应外界刺激发生相应的动态重排。
微管的这种动态转换可参与或协助防卫物质形成天
然防御屏障 ,从而抵抗病原菌的进一步入侵[ 12] 。另
外微管在植物抵抗环境胁迫的防卫反应中也发挥着
重要作用 , Wang 等研究发现 ,拟南芥受到盐胁迫时
周质微管发生重组 ,因此认为微管重组是植物耐盐
的一种主动防卫机制[ 13] 。细胞骨架还是细胞感受
重力信号的重要环节 ,对根尖细胞中的生长素运输
以及调节气孔运动中也起重要的调控作用[ 14-15] 。
植物中微管能与细胞内许多信号因子结合并发
挥传递运输的作用 ,从而在植物的一系列信号传导
过程中担当了重要角色[ 16] 。2004年 Drobak 等人
研究表明细胞骨架结合蛋白 ADF /cofilin 、profilin
等可能参与连接上游信号因子和下游细胞骨架动态
转变的过程 ,为细胞骨架参与植物体内信号传递过
程提供了试验依据[ 17] 。张永梅等认为 NO 可能通
过调节胞内钙离子促进微管骨架系统重排从而影响
相关的生理过程[ 18] 。但微管参与的信号转导通路
及在防卫反应中的具体作用机制尚不清楚 ,还有待
更深入的研究[ 16] 。在拟南芥中至少含有 6 个表达
的 TUA基因 , TUA 基因在进化上高度保守 , 其中
TUA2与 TUA4表达的 cDNA 完全相同 , TUA2 和
TUA6的 RNA 非翻译区也高度相似[ 5] 。但 93 年
Ca rpenter JL 等人发现 TUA2基因是一个半组成型
表达的基因 ,GUS 染色结果显示 TUA2在幼嫩组织
中表达量较高 ,在衰老组织中表达量较低 ,且表达不
如 TUA4明显 ,这暗示了 TUA2与 TUA4基因在拟
南芥的生长发育过程中担当了不同的角色[ 19-20] 。本
试验前期工作表明 TUA2基因突变体在拟南芥对逆
境胁迫的反应过程中存在与野生型不同的表型 ,显示
了 TUA2基因可能参与了拟南芥对逆境胁迫的应答
过程 ,但要进一步证实该基因的功能 ,还需要更多的
实验材料和证据 ,比如该基因的拟南芥遗传转化超表
达植株以及该基因的亚细胞水平的定位等。
本试验构建了 TUA2基因的 GFP 表达载体 ,基
因枪转化洋葱表皮细胞后 ,激光共聚焦显微镜观察结
果显示 ,荧光主要出现在洋葱表皮细胞的细胞膜上。
该结果确认了载体构建时 ,目的基因的扩增及连接都
是正确的 ,能够使报告基因GFP 正确表达 ,可以进一
步用于拟南芥的遗传转化;同时 ,也检测出 TUA2基
因主要在细胞膜上表达。该结果为进一步的研究其
功能和作用机制提供了材料和数据。
参考文献:
[ 1 ] 　李永才 ,安黎 , 毕阳.微管骨架在植物适应低温胁迫中
的功能研究进展[ J] .西北植物学报 , 2006 , 26(7):
1500-1504.
[ 2] 　Gilroy S , T rew avas A.Signal pro cessing and transduc-
tion in plant cells:the end of the beginning [ J] .Nat
Rev Mo l Cell Bio l , 2001 , 2:307-314.
[ 3] 　Wasteney sg O , Galw aym E.Remodeling the cy to skele-
to n fo r g row th and form:An overv iew w ith some new
v iew s[ J] .A nnu Rev Plant Bio l , 2003 , 54:691-722.
[ 4 ] 　Thuleau P , Schroeder J I , Ranjeva R.Recent advance s
in the regulation o f plant calcium channels:evidence
fo r regulation by G2 pro teins , the cy to skele ton and
second messenger s[ J] .Curr Opin P lant Biol , 1998 , 1:
424-427.
[ 5 ] 　S teven D , Kopczak , Nancy A , et al.The small genome
o f Arabidopsis contains at least six expressed a-Tu-
bulin genes[ J] .The Plant Cell , 1992 , 5(4):539-547.
(下转第 47页)
42
　第 2期　　　 程千钉等:麝香百合`Snow Q ueen ×毛百合种间杂交种的育成
杂交种真实性鉴定的研究[ J] .沈阳农业大学学报 ,
2006 , 37(1):93-95.
[ 15] 　北京林业大学园林系花卉教研组.花卉学[ M ] .北京:
中国林业出版社 , 1990:365-366.
[ 16] 　陈佰鸿 ,李新生 , 曹孜义 , 等.一种用透明胶带粘取叶
片表皮观察气孔的方法[ J] .植物生理通讯 , 2004 , 40
(2):215-218.
[ 17] 　郝瑞娟 ,穆鼎 ,张檀 ,等.百合品种间杂交的初步研究
[ J] .西北林学院学报 , 2005 , 20(3):87-89.
[ 18] 　吴学尉 ,崔光芬 ,吴丽芳 , 等.百合杂交后代 ISS R鉴定
[ J] .园艺学报 , 2009 , 36(5):749-754.
[ 19] 　Riedy M F , Hamilton W J , Aquadro C F.Excess o f
non- pa rental bands in offspring from known primate
pedig rees a ssayed using RAPD PCR [ J] .Nucleic
Acids Res , 1992 , 20(2):918-924.
[ 20] 　Ay liffe M A , Law rence G J , Elis J G.He te roduplex
mo lecules formed betw een allelic sequences cause non-
parental RAPD bands[ J] .Nucleic Acids Res , 1994 , 22
(9):1632-1636.
[ 21] 　房经贵 , 章镇 , 马正强 , 等.AFLP 标记在两个芒果品
种间杂交 F1 代的多态性及分离方式[ J] .中国农业科
学 , 2000 , 33(3):19-24.
[ 22] 　程金水.园林植物遗传育种学[ M] .北京:中国林业出
版社 , 2000:124.
(编辑:宗淑萍)
(上接第 42页)
[ 6] 　Sandra N , Anne B , Thomas C , e t al.A reference map
o f the Arabi dopsis thaliana mature pollen pro teome
[ J] .Biochemical and Biophy sical Research Communi-
cations , 2005 , 337:1257-1266.
[ 7] 　Celine S , Luc N , Thierr y B , e t al.P ro teomic analy sis o f
different mutant geno type s of Arabidopsis led to the
identification of 11 pro teins cor rela ting with adventi-
tio us roo t development[ J] .Plant Phy siology , 2006 , 2
(140):349-364.
[ 8 ] 　Jordan B , So tto santo , Ang ie Ge lli , e t al.DNA ar ray
analy se s of Arabidopsis thaliana lacking a vacuo lar
Na+/ H + antipor ter:impact o f A tNHX1 on gene ex-
pression[ J] .The Plant Journal , 2004 , 40:752-771.
[ 9] 　Renata F D , Kathleen F K , Paul F , et al.The Arabi-
dopsis thaliana ranscriptome in re sponse to ag robac-
terium tumefaciens[ J] .M PMI , 2006 , 6(19):665 -
681.
[ 10] 　Cao D , Cheng H , Wu W , et al.Gibberellin mobilizes
distinct DELLA-Dependent transcriptomes to regulate
seed germination and flo ral development in Arabidop-
sis [ J] .Plant Physio lo gy , 2006 , 10(140):509-525.
[ 11] 　Tang W , Deng Z , Juan A , et a l.P roteomics studies o f
brassinostero id signal transduction using pref raction-
ation and tw o-dimensional D IGE [ J] .Molecula r &
Cellular Pro teomics , 2008 , 7(4):728-738.
[ 12] 　Mazars C , Thion L , Thuleau P.Organization o f cy-
to skeleton cont rolst he changes in cy to solic calcium
o f co ld shocked Nicotiana plumbagini fo lia pro to-
plasts[ J] .Cell Calcium , 1997 , 22:413-420.
[ 13] 　Wang C , Li J J , Yuan M.Salt to lerance requires co rti-
cal micro tubulen r eorg anization in a Arabidopsis[ J] .
Plant Cell Phy siolog y , 2007 , 48(11):1534-1547.
[ 14] 　Huang R F , Wang X C , Lou C H.Stomatal opening in-
duced by acety l choline is associated with cy toskeletal
components[ J] .Acta Botanica Sinica , 2000 , 6:12-16.
[ 15] 　魏宁 ,郑慧琼.细胞骨架和高等植物的向重力性[ J] .
自然杂志 , 2007.29(6):338-347.
[ 16] 　王超 ,侍福梅.植物微管动态的研究进展[ J] .安徽农
业科学 , 2009 , 37(26):12501-12502.
[ 17] 　Drobak B K , F ranklintong V E , Staig er C J.The ro le
of the actin cy toskeleton in plant cell signaling [ J] .
New Phy tologist , 2004 , 163:13-30.
[ 18] 　张永梅 ,吴忠义 , 王学臣 , 等.拟南芥保卫细胞微管骨
架的重排参与 NO 诱导的气孔关闭[ J] .科学通报 ,
2008 , 53(3):293-298.
[ 19] 　Carpenter J L , Kopczak S D , Snustad D P , et al.Semi-
constitutive expression o f an Arabidopsis thaliana al-
pha-tubulin gene[ J] .Plant Mo l Bio l , 1993 , 21(5):937
-942.
[ 20] 　H u W , Wang Y , Bowe rs C , et a l.Isolation , sequence
analysis , and expression studies o f flo rally e xpressed
cDNAs in Arabidopsis[ J] .P lant Molecula r Bio lo gy ,
2003 , 53:545-563.
(编辑:梁　虹)
47