全 文 ：拟南芥叶黄素缺失突变体叶绿素荧光猝灭的特性＊
彭长连＊＊　林桂珠
(中国科学院华南植物研究所 , 广州 510650)
摘要　研究了 3 个叶黄素组分缺失的拟南芥核基因突变体 , npq1 (缺乏玉米黄质 Z 和单环氧玉米黄质 A)、 lut2
(缺乏 lutein)和 lut2-npq1 (双突变体 , 同时缺 Z和 lutein), 及其对照野生型 (WT)在强光诱导下叶绿素荧光猝
灭的特性.与WT 相比 , 3 个突变体的叶绿素 a/ b没有明显的差异 , Fv/ Fm 则有不同幅度的增加 , 缺乏 lutein 的
突变体 lut2 和 lut2-npq1 的叶黄素循环库 (V+A+Z)显著增大.缺乏 Z 的突变体 npq1 和 lut2-npq1 在强光下 , 荧
光的非光化学猝灭 (NPQ)的诱导受到明显抑制 , lut2的 NPQ形成也受到部分抑制.强光处理 9 min 后 , 3 个突
变体和WT 的 NPQ大小顺序为WT>lut2>npq1>npq1-lut2.强光诱导过程中突变体的光化学猝灭 (qP)都小于
WT.强光下突变体显示较弱的抗光抑制能力 , 其抗光抑制能力的强弱顺序为:WT>lut2>npq1>lut2-npq1.结
果表明叶黄素循环不但与 NPQ 的形成直接相关也与 qP 有关.
关键词　拟南芥 , 突变体 , 叶黄素循环 , qP , 非光化学猝灭 (NPQ)
学科分类号　Q946
　　植物叶片吸收的光能常常会超过其光合器本身
所能利用的量 , 而干旱 、 盐渍 、温度胁迫 、 营养亏
缺等逆境条件又会进一步限制植物利用光能[ 1] .
吸收过剩的光能可以导致光合效率的持续下降 (光
抑制), 光合器已发展了多种防御机制防止过量光
的伤害 , 其中依赖叶黄素循环的无害热耗散过剩光
能途径 , 被认为是一种重要的保护机制[ 2] .
叶黄素是α或 β-胡萝卜素的氧化产物 , 叶黄素
循环是指由玉米黄质 (zeaxanthin , Z)、单环氧玉米
黄质 (antheraxanthin , A)和双环氧的紫黄质
(violax anthin , V), 在强光条件下由紫黄质脱环氧
化酶 (VDE)催化的 V ※A※Z 脱环氧反应过程 ,
以及在黑暗或弱光下由玉米黄质环氧化酶 (ZE)
催化的 Z ※A ※V 环氧化反应相互转化的作用机
制[ 3 ,4] .大量的研究表明 , 叶黄素循环与非光化学
猝灭 (NPQ)形成密切相关 , 如 NPQ 与 Z 的含量
有很好的线性相关[ 5] , 但叶黄素循环调节能量耗
散的机制仍不甚清楚.近年来 , 应用分子生物学手
段构建了几个缺失叶黄素循环组分的拟南芥突变
体 , 这些突变体的应用 , 使人们有可能更加深入和
系统地研究高等植物叶黄素循环及其不同组分的光
破坏防御机制及其生理功能[ 6] .本文研究了缺乏
叶黄素组分Z 和 A 的拟南芥突变体 npq1 、 缺乏另
一种叶黄素组分 lutein 的突变体 lut2 , 以及 Z 和
lutein都缺乏的双突变体 lut 2-npq1 , 在强光下叶绿
素荧光的猝灭以及光抑制特性 , 为进一步深入探讨
植物光破坏的防御机制奠定理论基础.
1　材料与方法
1.1　实验材料
拟南芥核基因突变体 npq1:缺失 VDE 基因 ,
V不能脱环氧化为 A 和 Z;lut2:不能合成类囊体
中含量最高的叶黄素组分 lutein;lut2-npq1:双突
变体 , Z 和 lutein 都不能形成;WT :未经过分子
改造的野生型对照.图 1是拟南芥类胡萝卜素的合
成途径[ 7 ] , 从图 1中可以看出 , 叶黄素不同组分
的相互转换过程以及不同突变体在叶黄素合成中的
抑制位点.
　　拟南芥突变体及WT 种子由 Pogson 和 Niyogi
两位博士提供 , 种子发芽后种植于培养箱 , 光强
230μmol·m-2·s-1 , 光周期 16 h (光)/8 h (暗),
日夜温度为 22℃ (日)/17℃ (夜), 生长 4 ～ 5周
后用于实验.
　＊国家自然科学基金资助项目 (30270125), 中国科学院知识创
新工程领域前沿项目 (中国科学院华南植物研究所所长基金)
和国家重点基础研究规划资助项目 (973)(G1998010100).
　＊＊通讯联系人.
　Tel:020-85232940 , E-mail:pengchl@scib.ac.cn
　收稿日期:2002-10-08 , 接受日期:2002-11-29
·251·2003;30 (2)　　　　 生物化学与生物物理进展　　 Prog.Biochem.Biophys.
Fig.1　Carotenoid biosynthetic pathway in Arabidopsis thaliana
The defects in xan thophyll metaboli sm in the npq1 and lut 2 are indicated
[ 7] .
1.2　方法
1.2.1　叶绿素荧光的测定:使用脉冲调制叶绿素
荧光仪 PAM 101/100/103 (H.Walz.Effelt rich ,
Germany)在 25℃条件下测定叶绿素荧光猝灭过
程 , 叶片先暗适应 10 min , 以 1.6 kHz的弱测量光
(PAM 101 , 光强 0.04 μmol·m-2·s-1)测定 Fo ,
再加上饱和光脉冲 (Schott lamp KL 1500 FL 103 ,
光强 8 000μmol·m-2·s-1 , 脉冲时间 2 s), 使荧光
上升到 F m , 当荧光从 F m快回落到 F o时 , 立即加
上连续的作用光 (Schott lamp KL 1500 , 光强
2 000μmol·m-2·s-1)和PAM 102提供的 100 kHz
测量光 (提高信嘈比稳定输出信号).荧光上升到
F 同时每间隔 30 s加上饱和脉冲 , 饱和脉冲期间
荧光上升到 F′m , 作用光期间荧光 F 不断下降直到
稳定 (F s), 然后关闭作用光和 PAM102 , 荧光下
降到 F′o .光化学猝灭 (qP)和非光化学猝灭
(NPQ)系数计算公式如下:
　　qP =(F′m -F s)/(F′m -F′o)
　　NPQ =(F m -F′m)/F′m
1.2.2　光合色素的分析:色素的提取和高效液相
层析 (HPLC)参照 Gilmore 和 Yamamo to 的方
法[ 8] , 使 用 Waters HPLC 仪 (Waters M ilford
USA).
1.2.3　强光处理:取完全展开的成熟叶片 (3 ～ 4
位叶)悬浮于 25℃的水浴中由 HMI Universal
Spotlight(Model HM I 575 W/GS Osram)光源提供
2 000 μmol·m -2·s-1的光强 , 叶片与光源之间放置
一块滤光片 (Scho tt 115 , Tempax)以隔热 , 检测
经不同时间强光处理叶片的 Fv/ Fm 以及在弱光
(20μmol·m-2·s-1)下恢复 2 h的 Fv/F m.
2　结　　果
2.1　强光诱导的拟南芥突变体叶绿素荧光猝灭过程
图 2是拟南芥WT 和不同叶黄素组分缺失的
突变体叶绿素荧光猝灭的详细过程 , 打开弱测量
光 , 荧光上升到 F o , 光系统 Ⅱ (PS Ⅱ)反应中心
全部开放 , 质体醌 (QA)处于完全氧化状态 , 随
后加上饱和脉冲光 , 荧光上升到 Fm , PS Ⅱ反应中
·252· 生物化学与生物物理进展　　Prog.Biochem.Biophys.　　　　　2003;30 (2)
心完全关闭 , QA 全部被还原.随后荧光快速下降 ,
当加上连续的作用光时 , 荧光又马上上升 , 然后缓
慢下降 , 直到稳定 , 这个缓慢下降的过程叫做叶绿
素荧光猝灭过程.由图 2 可见 , 与WT 相比 , 拟
南芥双突变体 lut2-npq1 的猝灭几乎完全被抑制 ,
而另外两个突变体 npq1 和 lut 2的猝灭被部分抑制 ,
npq1 的猝灭被抑制程度较 lut2 大.
Fig.2　Schematic representation of the course of chlorophyll
fluorescence quenching induced by high light(2 000 μmol
·m-2·s-1) in leaves of Arabidopsis thaliana
mutants and wildtype
2.2　强光诱导下叶绿素荧光猝灭组分的变化
当加上连续光化光的同时再加上饱和脉冲光 ,
这时的叶绿素荧光猝灭可分为光化学猝灭 (qP)
和非光化学猝灭 (NPQ)两部分 , qP 反映了 PS Ⅱ
受体 QA 的快速还原 , 然后重新氧化 , 并活化暗反
应酶系统的过程[ 9] , 而 NPQ 则表示植物无害化热
耗散过剩激发能的能力[ 2] .图3是强光下拟南芥突
变体及WT 的 qP 、 NPQ变化过程.随着照光时间
的延长 , 所有突变体及WT 的 qP 都下降 (图 3a),
强光下照光 9 min后 , WT 的 qP 与照光前相比下
降了 70%, 而突变体 lut2 、 npq1 和 lut2-npq1 的 qP
则分别下降了 77.7%、 88.6%和 81.1%.除开始
照光的 2 min 外 , 其他照光时间 qP 的大小顺序都
为WT >lut2 >npq1-lut2 >npq1 , 强光下 NPQ 的变
化趋势则与 qP相反 , 都呈上升的趋势 (图 3b).3
个突变体和 WT 的 NPQ 都是在开始照光的 1 min
内有一个快速上升的过程 , 然后则缓慢上升.其中
WT 上升最快 , 其次为 lut2 , lut2-npq1 上升最慢.
强光诱导 9 min 后 , WT 、 lut 2 、 npq1 和 lut2-npq1
的NPQ值从照光前的 0分别上升至 2.44 、 2.18 、
1.33和 1.07.其 NPQ大小顺序为WT >lut2>npq1
>npq1-lut 2.
Fig.3　Changes in qP(a)and NPQ(b)induced by high light
(2 000 μmol·m-2·s-1) in leaves of Arabidopsis thaliana
mutants and wildtype
Each data poin t is the average of th ree separate sam ples.★———★:lu t2-
npq1;□———□:lu t2;○———○:WT;△———△:npq1.
2.3　突变体及WT的 Fv/Fm变化
PS Ⅱ原初光化学效率 F v/F m是 PS Ⅱ天线色素
捕获光能效率的指标 , 与 WT 相比 , 无论是不能
合成玉米黄素的突变体 npq1 或不能合成 lutein的突
变体 lut2 , 还是玉米黄素和 lutein都不能合成的双突
变体 lut2-npq1 , 其 Fv/Fm都稍微有些升高(图 4),
其 中 lut2 、npq1 和 lut2-npq1 的 Fv/Fm 与WT 相比 ,
Fig.4　Changes in Fv/ Fm in leaves of Arabidopsis thaliana
mutants and wildtype
Each data point is the average of three separate samples.The bars are
the standard deviat ions.1:lut 2-npq1;2:lut 2;3:npq1;4 :WT.
·253·2003;30 (2)　　　　 生物化学与生物物理进展　　 Prog.Biochem.Biophys.
分别上升了 2.9%、 1.1%和 4.17%.缺乏 lutein的
突变体 F v/ Fm 上升幅度大些 , 以双突变体上升最
大.说明缺失类胡萝卜素组分的不同突变体其 PSⅡ
天线色素捕获光能的能力都有相应的提高.
2.4　突变体色素组分的变化
与WT 相比 , 突变体中叶绿素 a/b没有明显的
差异 (表 1), npq1 在强光下不能形成 Z 和 A , 而
lut 2没有 lutein , 双突变体 lut2-npq1 没有 lutein , 强
光下也不能形成 Z , 但有部分 A , 缺乏 lutein的突
变体 lut2 和 lut2-npq1 中 , 叶黄素库 (V +Z +A)
相对WT 有较大幅度的增加.
Table 1　Photosynthetic pigments in wildtype and mutants of Arabidopsis thalinan before(Dark)and after 1.5 h at
2 000 μmol·m-2·s-1 (1.5 HL)
mmol/mol
Pigment
WT
Dark 1.5 HL
lut2
Dark 1.5 HL
npq1
Dark 1.5 HL
lut2-npq1
Dark 1.5 HL
Chl a/ b 3.21±0.78 3.17±0.10 3.56±0.23 3.35±0.20 3.26±0.13 3.19±0.21 3.46±0.30 3.36±0.26
Z 0 11.42±1.20 0 25.10±2.60 0 0 0 0
A 0 18.41±2.00 0 19.70±1.40 0 0 0 20.63±1.70
V+Z+A 43.50±2.80 46.50±3.80 110.10±5.20 107.70±4.60 23.50±1.90 26.20±3.00 122.80±6.40 136.40±8.50
Lutein 112.90±4.10 124.70±6.70 0 0 103.3±7.10 116.39±4.80 0 0
　Dark:untreatment;1.5 HL:Treated by 2000μmol·m-2·s-1 light intensity for 1.5 h.
2.5　突变体对强光胁迫的响应
为了进一步研究类胡萝卜素组分在光抑制中的
保护机制 , 我们用2 000μmol·m-2·s-1强光分别处
理不同突变体及 WT 叶片 30 min 、 60 min 、
90 min 、 120 min 、 180 min 和 240 min.并测定了
其 F v/F m的变化 , 而 Fv/F m的下降是光抑制的主
要指标之一.结果表明不同突变体及 WT 对强光
光抑制的响应不同 (图 5a).双突变体 lut2-npq1 对
强光光抑制最敏感 , 强光处理 2 h 后 , 其 Fv/ Fm
就下降了 75%.WT 抗强光光抑制的能力最强 ,
强光处理 4 h 后 , Fv/F m 只下降了 53%.突变体
及WT 抗强光光抑制强弱的顺序为:WT >lut2 >
npq1>npq1-lut2.
　　当强光处理后的材料置于 20 μmol·m-2·s-1弱
光下恢复 2 h , 所有的突变体及WT 的 F v/F m都有
不同程度的恢复 (图 5b), 强光处理90 min前的恢
复程度高些 , 几个突变体及WT 恢复程度由高至
低顺序为:WT >lut2>npq1>lut2-npq1.
3　讨　　论
叶黄素类是 α或 β 胡萝卜素氧化衍生物 (图
1), 存在于所有的光合机构中 , 参与光能捕获 、 光
合机构破坏的防御 (photoprotection)和捕光天线
色素复合体 (LHC)的组装[ 10] .然而叶黄素各个
组分的功能仍不清楚 , 只有间接的证据表明 Z 的
含量与 NPQ呈线性正相关[ 5] .本文以缺乏相应叶
黄素组分的拟南芥突变体 , 研究了不同叶黄素组分
缺失对叶绿素荧光猝灭的影响 .结果表明npq1在
Fig.5　Effect of high light intensity (2 000 μmol·m-2·s-1)
on F v/ Fm(a) in leaves of Arabidopsis thaliana mutants and
wildtype and its recovery(b)
After high ligh t t reatment for di fferent t ime , the leaves w ere submit ted
to a 2 h recovery in PPFD of 20μmol·m-2·s-1.The time scale in Fig
5b refers to the exposed time of high light in Fig 5a.Each data point is
the average of three separate samples .★———★:lu t2-npq1;□———□:
lut2;○———○:WT;△———△:npq1.
·254· 生物化学与生物物理进展　　Prog.Biochem.Biophys.　　　　　2003;30 (2)
强光下不能形成 Z 和 A , lut2 则没有 lutein , 强光
下能正常诱导 Z 和 A 的生成 , 而双突变体 lut 2-
npq1 除了缺乏 lutein 外 , 强光下不能诱导形成 Z
(表 1).lutein是类胡萝卜素中含量最多的一种色
素 , 占总的类胡萝卜素近 50%, 缺乏 lutein的突变
体叶黄素库 (V+Z +A)明显增高 , A的含量也升
高 , 这可能是对缺乏 lutein 的一种补偿[ 11] .无论
是缺乏 Z 或 lutein的突变体 , 还是两者都缺乏的双
突变体 , 其叶绿素 a/b与WT 没有明显的差别 , 暗
示这些突变体的天线色素受影响较小 , 然而强光诱
导的叶绿素荧光猝灭都受到明显的影响 (图 2).
强光下缺 Z 突变体 npq1 和 lut2-npq1 的非光化学猝
灭 (NPQ)的形成被显著抑制 (图 3b), 其通过非
辐射耗散过剩激发能的能力因缺乏 Z 而明显下降 ,
结果与 Niyogi等[ 12]发现缺乏 Z 的 Chlamydomonas
reinhart ii突变体在强光下其 NPQ 的形成受到抑制
一致 , 结果直接证明了叶黄素循环与 NPQ 的形成
有关.有意思的是 , 缺 lutein的突变体 lut2 在强光
诱导下 , NPQ 的形成也部分被抑制 , 表明 lutein
也可能以某种方式参与了 NPQ 的形成.
缺乏 Z 或 lutein的突变体 , 其强光下 NPQ 诱
导不但被抑制 , 而且光化学猝灭 qP 的水平也较对
照都下降了 , 以缺乏 Z 的两个突变体 npq1 和 lut 2-
npq1 下降的幅度较大 (图 2a), 低的 qP 反映突变
体中 PS Ⅱ开放的反应中心比例和参与 CO2 固定的
电子减少 , 然而外周天线色素捕获光能的能力
(F v/F m)并不因缺乏 Z 或 lutein 而下降 , 反而较
对照稍有增加 (图 3).我们推测强光下突变体捕
获光能的能力变化不大而用于 CO2 固定的电子减
少 , 故剩余的激发能增加 , 由于缺乏与 NPQ 形成
有关的 Z 或 lutein , NPQ的诱导受到抑制 , 因而其
叶绿体在强光下会有更多的过剩激发能不能被及时
清除而容易发生光抑制现象 , 用强光光抑制处理的
结果 , 强光下抗光抑制的能力为WT >lut2>npq1
>lut 2-npq1 , 则证实了我们的推测 (图 4).
综上所述 , 我们认为叶黄素循环不但与高光下
NPQ 的诱导有关 , 也与 qP 有一定的关系.
参　考　文　献
1 　Demmig-Adam s B , Adams Ⅲ W W.Photoprotect ion and other
responses of plants to high light st ress.Annu Rev Plant Physiol
Plant Mol Biol , 1992 , 43:599～ 626
2 　Muller P , Li X P , Niyogi K K.Non-Photochemical quenching.A
response to excess ligh t energy.Plant Physiol , 2001 , 125 (4):
1558～ 1566
3 　Gilmore A M.Mechanistic aspects of xanthophyll cycle-dependent
photoprotect ion in higher plant chloroplast s and leaves.Physiol
Plant , 1997 , 99 (1):197～ 209
4 　Frank H A , Bautista J A , Josue J S , et al.Mechanism of
nonphotochemical quenching in green plants:energies of the low est
excited singlet states of violaxan thin and zeaxanthin.Biochemist ry ,
2000 , 39 (11):2831～ 2837
5 　Demmig-Adam s B , Adams Ⅲ W W.The role of xanthophyll cycle
carotenoids in the protection of photosynthesis.T rends Plant Sci ,
1996 , 1 (1):21～ 26
6 　Niyogi K K.Photoprotect ion revisited:Genet ic and molecular
approaches.Annu Rev Plant Physiol Plan t M ol Biol , 1999 , 50:
333～ 359
7 　Niyogi K K , Shih C , Chow W S , et a l.Photoprotection in a
zeaxanthin- and lutein-deficient double mutan t of Arabidopsis.
Photosynth Res , 2001 , 67 (1～ 2):139～ 145
8 　Gilmore A M , Yamamoto H Y.Resolution of lutein and zeaxanthin
using a nonendcapped , lightly carbon-loade C18 high performance
liquid chrom atographic column.J C hromatogr , 1991 , 543:137～
145
9 　Sch reiber U , S chliw a U , Bi lger W.Cont inuous recording of
photochemical and nonphotochemical chlorophyll fluorescence
quenching w ith a new type of modulat ion f luorometer.Photosynth
Res, 1986 , 10 (1):51～ 62
10 Gilmore A M , Govindjee.How higher plants respond to excess light:
Energy dissipation in photosystemⅡ.In:Singhal G S , eds.Concepts in
Photobiology:Photosynthesis and Photomorphogenesis.New Delhi:
Narosa Publishing House , 1999.513～ 548
11 Pogson B , Niyogi K K , Björkman O , et al.Altered xanthopyll
compositi ons adversely af fect chlorophyll accumulation and
nonphotochemical quenching in Arabidopsis mutants.Proc Nat l
Acad S ci USA , 1998 , 95 (22):13324～ 13329
12 Niyogi K K , Bjö rkman O , G rossman A R.The role of specific
xanthophylls in photoprotection.Proc Nat l Acad Sci USA , 1997 ,
94 (25):14162～ 14167
13 Hartel H , Lokstein H. Relationship betw een quenching of
maximum and dark-level chlorophyll f luorescence in vivo:
dependence on photosystem Ⅱ an tenna size.Biochim Biophys
Acta , 1995 , 1228 (1):91～ 94
·255·2003;30 (2)　　　　 生物化学与生物物理进展　　 Prog.Biochem.Biophys.
The Feature of Chlorophyll Fluorescence Quenching in Xanthophyll-deficient
Mutants of Arabidopsis thaliana＊
PENG Chang-Lian＊＊ , LIN Gui-Zhu
(South China Insti tu te of Botany , The Chinese Academy of S ciences , Guangzhou 510650 , China)
Abstract　The chlorophyll f luo rescence quenching in leaves of wildtype (WT)and three nuclear mutants of
Arabidopsis thaliana including npq1 (lutein-replete and violaxanthin deepoxidase-def icient), lut2 (lutein-
deficient)and lut2-npq1 (double mutant)under high light condition w as characterized.There was no obvious
difference in ratio of Chl a/b betw een mutants and wildtype , while F v/F m in mutants increased to some
ex tents.The total xanthophyll pool(V+A+Z)increased significant ly in lutein-deficient mutants(lut2 and lut2-
npq1).The NPQ induction by high light w as markedly inhibited in lut 2-npq1 and npq1 , but showed less
inhibition in lut2.The trend of NPQ value in mutants and WT exposed to PPFD during high light illuminat ion
of 2 000 μmol·m-2·s-1 fo r 1 ～ 9 min w as WT >lut2 >npq1 >lut2-npq1.qP in all three mutants decreased in
comparison with wildtype.Three xanthophyll-dificient mutants exhibited less resistance to photoinhibition than
the WT .The sequence of tolerance to photoinhibition was the same as the changes in NPQ among WT and
mutants (WT >lut2 >npq1 >lut2-npq1).The results indicated that xanthophy ll cycle w as related not only
direct ly to NPQ fo rmation , but also to qP.
Key words　Arabidopsis thalinan , mutant , xanthophyll cycle , qP , NPQ
　＊This work w as supported by grants from T he National Natural Sciences Foundation of China(30270125), Field Front iers Project of The Chinese
Academy of Sciences Know ledge Innovation Program (Director Foundation of South C hina Inst itute of Botany , The Chinese Academy of S ciences)
and The Special Funds for Major S tate Basic Research of China(G1998010100).
　＊＊Corresponding author.Tel:86-20-85232940 , E-mail:pengchl@scib.ac.cn
　Received:October 8 , 2002　　Accepted:November 29 , 2002
·256· 生物化学与生物物理进展　　Prog.Biochem.Biophys.　　　　　2003;30 (2)