全 文 ：拟南芥中 PAP特异磷酸酶
(AtAHL)的折叠识别与结构预测＊
彭　艺　曾宗浩＊＊
(中国科学院生物物理研究所 , 北京 100101)
摘要　通过现有的序列同源性比较 、 二级结构预测 、 三维结构预测和模拟方法 , 得到了拟南芥中 PAP 特异磷酸
酶的三维结构.这是一种与酵母中的 Hal2p 蛋白质类似 , 并且 N 端为α+β , C 端为α/β 结构域的多结构域蛋白
质.分析预测所得结构 , 发现了 Mg2+等金属离子的结合位点 , 推测了对 Na+敏感的结构基础.这些结合位点与
其生化功能相关.而且 , 通过结构与功能分析 , 讨论了蛋白质数据库 (PDB)中同一个酶已有理论结构的不合理
性.
关键词　PAP特异磷酸酶 (AtAHL), 蛋白质三维结构 , 结构预测 , 拟南芥
学科分类号　Q6
　　土壤的盐碱化是农业生产中的一个重要问题.
在盐碱化的地区需要发展有更强耐盐性的作物.认
识对盐敏感的新陈代谢反应是理解与调控耐盐性的
关键.在硫酸盐的吸收中 , 无机硫酸盐通过两步激
活 , 同时消耗 2个 ATP分子 , 最后以 3′-磷酸腺苷
-5′-磷酰硫酸 (PAPS)的形式积累起来.当这个被
激活的硫酸盐还原为亚硫酸盐或者转化为其他分子
时 , 会形成一个核苷酸 , 即 3′-磷酸腺苷-5′-磷酸
(PAP)[ 1] .积累的 PAP 会对细胞产生毒性.为了
阻止 PAP 的积累 , PAP 磷酸酶催化 PAP 转化为
AMP 和无机磷酸[ 2] .已经有报道表明 , 酵母中的
HAL2 基因编码的蛋白质 (Hal2p)是一种把 PAP
水解为AMP 的核苷酸酶 , 并且是 Li+和 Na+毒性
在生物体内的主要作用目标.Hal2p 需要 Mg2+帮
助催化 , 也被低浓度的 Li+和 Na+抑制.在盐胁迫
的情况下 , Hal2p的抑制导致细胞中的 PAP 积累 ,
从而产生了各种毒效应.例如 , 酵母中硫吸收的途
径中断 , RNA加工酶被抑制.而这种抑制致使细
胞死亡[ 1 ,3] .
　　另外已经在许多植物中发现了与酵母 HAL2
类似的基因家族 , 其表达产物是 HAL2 基因编码
蛋白质 (Hal2p)的同源类似物.其中包括拟南芥
中的 AtSAL1[ 4] , AtSAL2 和 AtAHL[ 5] , 还有水稻
中的 OsRHL[ 6] .这些酶在体外均不同程度地表现
出对阳离子敏感.这些蛋白质的催化作用都需要二
价金属离子的辅助 , 却被单价 Li+抑制[ 7] , 关于它
们改进植物耐盐能力的研究还在进行.另一方面 ,
研究也发现拟南芥与酵母 HAL2 类似的基因家族
中有一个 Na+敏感的 PAP 磷酸酶 , 即 AtAHL.
AtAHL的 PAP 磷酸酶活性对生理浓度的 Na+高度
敏感 , 对 Li+适度敏感.AtAHL 是对 PAP 特异的 ,
并且能够与植物的磺基转移酶协同作用 , 也是植物
中盐毒性的目标蛋白质[ 5] .对耐盐性相关蛋白质
结构的了解可以更好地理解其生化功能 , 改进作物
的耐盐性.但是直到现在 , 拟南芥中的 PAP 特异
磷酸酶 (AtAHL), 还没有实验上的结构信息可
用.当某个蛋白质序列存在三维结构已知的同源蛋
白质时 , 预测出这个序列正确的三维结构是可能
的[ 8] .因此 , 对于一个蛋白质家族而言 , 二级结
构预测 、折叠识别的算法 、 已知的蛋白质结构及与
结构有关的实验数据 , 都可以用来推测未知结构蛋
白质的可能折叠类型.使用一些已有的计算方法 ,
我们在这里给出 AtAHL 的结构预测结果 , 以帮助
研究者更好地研究植物的耐盐性.
1　方　　法
　　采用常规的蛋白质建模方案[ 8]来预测 AtAHL
的结构.用 FASTA (version 3.3t09 , May 18 ,
2001)[ 9] 和 BLASTP (version 2.2.6 , April 9 ,
2003)[ 10] 在 PDB (Pro tein Data Bank)[ 11] 和 Swiss-
Prot 中 搜索 AtAHL 的同源 类似物.并且用
CLUS TAL W (release 1.6)[ 12] 进行多序列比对.
使用 CE (cl.sdsc.edu/ce.html)[ 13]检测 AtAHL 同
　＊国家自然科学基金资助项目 (30080004).
　＊＊通讯联系人.
　Tel:010-64855592 , E-mail:zzh@sun5.ibp.ac.cn
　收稿日期:2003-02-27 , 接受日期:2003-04-24
·566· 生物化学与生物物理进展　 　 Prog.Biochem.Biophys.　　　　　　　　 2003;30 (4)
源类似物的结构邻居.采用几种现存的方法 (例
如:GOR4 、 APSSP2 、 nnPredict 、 PredictProtein 、
Pro Predict 、 SSpro 等)[ 14～ 19] 进行二级结构预测.
以上 二 级 结 构 预 测 工 具 来 自 于 互 联 网
(www .expasy .org/ tools).结构分类信息和序列对
各种蛋白质折叠的适合程度分别采用了互联网上的
服务器 SMART[ 20 , 21] (smart.embl-heidelberg.de/)
和 3D-PSSM [ 22] .根据这些结果选择出合适的结构
模板蛋白质 , 由 CLUSTAL W (release 1.6)[ 12] 得
到待定结构蛋白质与模板蛋白质序列的初步比对.
根据模板蛋白质的二级结构 , 参照对待定结构蛋白
质的二级结构预测 , 结合 AtAHL 的生化信息以及
保守残基区域[ 5] , 最终得到用于三维结构预测和
模拟的序列比对.将最终的序列比对输入程序
MODELLER (release 6)[ 23]中就可以得到预测的三
维结构.用 PROCHECK (version 3.5)[ 24] 来检查
所得预测结构的立体化学特性.用O(x ray.bmc.
uu.se/alwyn/)检查侧链构象.最后使用 CNS
(version 1.1)[ 25]优化局部结构.
2　结　　果
2.1　AtAHL的同源类似物
　　拟南芥中的 PAP 特异磷酸酶 (AtAHL)全序
列有 373 个残基.在 PDB 中已有一个理论结构
(1FLF).这个结构整体上二级结构含量极少 , 尤
其在 C 端甚至还有一个可疑的结 (图 1a).1FLF
的这些结构特征与常见多结构域蛋白质不符合.使
用 FASTA在 PDB中寻找 AtAHL 同源序列 , 发现
还有 15个与 AtAHL 有较强同源性的序列.其中 5
个序列相同 , E 值均为 7.1×10-16 , 都来自于酵
母 (Saccharomyces cerevisiae)中的 Hal2p蛋白质 ,
其代表结构 (1QGX_A)见图 1b.还有另外 10个
序列也相同 , E 值均为 0.49 , 都来自于真菌
(Archaeoglobus fulgidus)FBPASE/ IM PASE , 其
代表结构 (1LBZ_A)见图 1c.另外 , 用 BLAS TP
搜索 PDB , 得到 3组与 AtAHL 有很强同源性的序
列 (每组内的序列均相同).从 3组序列中选择一
个代表 , 其 PDB 代码分别是 1QGX 、 1IMA 、
2HHM , 相应的 E 值分别是 1e-42 、 2e-4 、 2e-4.
其中 1IMA和 2HHM 都是属于肌醇一磷酸酶.同
时得到另外 2组序列 , 其与 AtAHL 的同源性比以
上 3组弱 , 其中代表序列 PDB代码分别是1LBZ 和
1JP4.这些蛋白质和 AtAHL 均属于磷酸酶家族 ,
而且都是既含有α螺旋又含有 β折叠的多结构域蛋
白质.E 值越低 , 两个序列同源性越强.因此 ,
分析以上两种方法搜索的结果 , 1QGX是 AtAHL
在 PDB中较好的同源类似物.另一方面 , 对蛋白
质序列库 Swiss-Pro t进行搜索 , 得到 AtAHL 同源
序列 , 都是磷酸酶家族蛋白质序列.然后 , 用
CLUS TAL W 对 AtAHL 同源序列进行多序列比
对 , 帮助确定用于结构预测的序列比对.根据以上
AtAHL同源类似物的生物功能和晶体结构的初步
分析 , 可以判断现存的理论结构 1FLF 的可靠性不
高.
Fig.1　The Structures of AtAHL and its homologues
(a) theoret ical st ructure of AtAHL in PDB (1FLF);(b) crystal st ructu re of Hal2p (1QGX);(c) crystal structure
of FBPASE/ IM PASE (1LBZ).
2.2　结构邻居与折叠识别
　　用 CE检测 AtAHL 同源类似物 1QGX的结构邻
居 , 发现用 FASTA 和 BLASTP 初次鉴定的 AtAHL
同源蛋白质1IMA 、 2HHM 、 1JP4与1QGX是高得分
的结构邻居.将待定结构序列发送到 3D-PSSM 服务
器上进行折叠识别.在具有 95%准确性的 E 值范围
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内 , 得到的结果中包括 1QGX (表 1).所有排名在
前的蛋白质都是既含有α螺旋又含有 β折叠的多结
构域蛋白质 , 其中 1QGX排名第一.
2.3　二级结构预测
　　使用各种方法进行二级结构预测 , 发现α螺旋
与 β折叠都存在.而且 , 这个结构可能含有 9 ～ 14
个α螺旋 , 11 ～ 17个β折叠.用SMART 所作分析
表明 , 我们的序列在 SCOP中也被分类为既有α螺
旋又有 β折叠的多结构域蛋白 , 而且 N 端是α+β
结构域 , C端是α/β结构域.
Table 1　Validity of the sequence of Arabidopsis thaliana PAP-specif ic phosphatase(AtAHL)to various structures
PDB code E C lass Fold Sequence ident ity
1QGX_A
2HMM_A
1JP4_A
1INP
1DK4_A
1LBZ_A
0.00274
0.00412
0.00663
0.0238
0.0551
0.0753
Mult i-domain proteins(alpha and beta)
Mult i-domain proteins(alpha and beta)
Mult i-domain proteins(alpha and beta)
Mult i-domain proteins(alpha and beta)
not in SCOP 1.53
not in SCOP 1.53
Sugar phosphatases
S ugar phosphatases
S ugar phosphatases
S ugar phosphatases
hydrolase
hydrolase
34%
21%
22%
17%
19%
23%
　＊Result s from 3D-PSSM Theading Server.The lower the value of E is , the more valid the st ructure is to the sequence.
2.4　模板选择和用于结构预测的序列比对
　　用 MODELLER预测三维结构需要有恰当的三
维结构模板及其与待定结构的序列比对.从上面的
分析 , 发现 1QGX 是一个合适的三维结构模板.
用CLUSTAL W可以得到1QGX与AtAHL 的序列
比对.在将这个比对直接输入 MODELLER之前 ,
需要检查比对中插入的空隙.各种序列比对方法 ,
为了得到最高的序列匹配指标 , 都会在序列中加入
空隙.在包含空隙的地方 , 预示着两个序列的三维
结构有较大的区别.从结构上来看 , 如果这些空隙
发生在模板上连续规则的二级结构中间 , 这些空隙
的加入就可能是不合理的.应该小心地检查待定结
构是否有可能在这些地方发生二级结构的中断.可
以作为判断依据的信息有:模板的二级结构和这些
二级结构的堆积方式 , 待定结构的序列在该区域是
否有不形成规则二级结构的倾向 , 等等.例如 , 在
β链中插入空隙或插入更多的残基有可能使整个 β
片层解体;而螺旋的中断可能导致螺旋的堆积方式
改变.这些都是三维结构的较大变化.如果对模板
结构和待定结构之间的相似性有较大的信心 , 就应
该避免这种变化的发生.因此 , 在将序列比对输入
MODELLER之前 , 检查和调整用各种自动方法得
到的序列比对是得到可靠结构的必需步骤.
　　以 AtAHL 的第 80 位到第 120 位的氨基酸序
列 为 例 (图 2).在 模 板 蛋 白 Hal2p 的 结 构
Fig.2　Predicted secondary structure of AtAHL by different methods and
alignment of the two sequences of AtAHL and Hal2p
Below the sequence of Hal2p is its actual secondary st ructure.H:helix;E:
st rand;C:coil;blank:loop;-:no-prediction.
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(1QGX)中这 段 序 列 对 应 一 个长 α螺旋.
CLUSTA L W 给出的匹配在这段序列的中部加入
了几个空隙.这是否意味着在 PAP 磷酸酶中这一
条螺旋应折为两段? 采用各种方法所作二级结构预
测都表明方框中的这段序列 (图 2)是一个连续的
α螺旋.没有理由认为在 AtAHL 中由于序列的改
变 , 这条螺旋会变成不连续的两段.连续的螺旋仍
然是最优的选择.所以在用于结构预测的序列比对
中 , 应把相应的空隙删除.根据同样类似的步骤 ,
还删除了其他几处空隙.同时 , 根据上文提到的多
序列比对的结果 , 在不影响 AtAHL 序列保守区的
序列比对前提下 , 相应地调整了空隙删除处附近区
域的序列比对.图 3示出了经过调整后用于结构预
测的序列比对.
Fig.3　Sequence alignment of Hal2p and AtAHL used for 3D structure prediction
Secondary st ructure is calculated by PROCHECK from the st ructure 1QGX of Hal2p.H:helix;E:st rand;C:loop.
Residues are numbered by the sequence of AtAHL.
2.5　同源模型的建立与检查
　　采用Hal2p的结构 (1QGX)为模板 , 配以图
3所示的待定结构序列与模板序列的比对 , 通过
MODELLER 得到了 AtAHL 的三维 结构.用
PROCHECK检查 , 这个结构的主链构象有 95.3%
的残基在最适合区域 , 4.4%的残基在附加允许区
域 (图 4), 可以说这个结构有很好的立体化学指
标.使用CNS进行优化 , 有小部分的改进.
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Fig.4　Ramachandran plot of the predicted structure of
AtAHL
95.3% of the residues are in the most favored , 4.4% in addit ional
allow ed and 0.3% in generously allowed regions.
预测的结构 N端是α+β结构域 , C 端是α/β 结构
域 (图 5).预测结构与Hal2p主链的比较见图 6.
与之相比 , 在已有的理论结构 1FLF 中80.0%的残
基在最适合区域 , 16.0%在附加允许区域 , 并且只
有很低的二级结构含量 (约 23.3%), 外加一个不
大可能形成的结 (图 1a).这表明 , 1FLF 的立体
化学指标没有我们现在通过各种方法详尽分析之后
再用 MODELLER得到的结果好.
Fig.5　Cartoon diagram of the predicted structure
for AtAHL
Fig.6　Stereo view of Cαtrace superposition of 1QGX (in blue)with the predicted structure of AtAHL(in red).
3　讨　　论
　　根据已有的 AtAHL 功能信息 , 进一步讨论我
们所得预测结构与 PDB中已经存在的AtAHL 理论
结构 (1FLF)的区别.1FLF 也是一个理论预测的
结构 , 在它的 C 端有一个结 , 这是引起我们质疑
这个结构的主要原因.而且通过各种方式检查
1FLF , 其立体化学指标不好.为了解决这个问题 ,
可以进行 AtAHL 生化功能的分析.下面我们讨论
它的功能性结合位点.
　　AtAHL 是一种类似于酵母中的 Hal2p 蛋白.
它们都有 PAP 磷酸酶的活性.Hal2p 对低浓度的
Li+和 Na+敏感;AtAHL 对生理浓度的 Na+高度
敏感 , 对 Li+适度敏感.它们在 Mg2+帮助下催化
·570· 生物化学与生物物理进展　 　 Prog.Biochem.Biophys.　　　　　　　　 2003;30 (4)
PAP 转化为 AMP 和无机磷酸[ 5] .那么 , AtAHL
应该有与 Hal2p相似的 Mg2+和 Li+等金属离子结
合位点 , 及对 Na+敏感的结构基础[ 26] .Hal2p 晶
体结构[ 26]显示Mg2+和其他金属离子的结合位点主
要由 Glu72 、 Asp142 、 Asp145和 Asp294以及 PAP
水解产物 AMP 和 Pi形成.在 AtAHL 上 , 与这些
残基匹配的是 Glu77 、 Asp144 、 Asp147 和 Asp310
(图 3中带灰度底纹大写字母表示).根据这些保守
残基可以预测 AtAHL 的结合位点.比较预测结构
与 1QGX 的结构 , 发现在 AMP 、 Pi 与 Mg2+位置
不变 的 条 件 下 , Glu77 、 Asp144 、 Asp147 和
Asp310 形成类似于 Hal2p 中由 Glu72 、 Asp142 、
Asp145和 Asp294 组成的金属离子结合位点 (S1 ,
S2 , S3) (图 7).S1 与 S3 是 Mg2+的结
合位点 , S2是单价金属离子结合位点 .Hal2p中
Fig.7　Comparision of the metal binding site in 1QGX (in
black)with that in the predicted structure (in gray)
Amino acid numbering is for the predicted st ructure.Show n are the
residues conserved in both proteins and AMP , Pi and metal ion
binding site are those in 1QGX.
Arg152 与 Asp263 之间的盐桥与 Hal2p 对 Li+和
Na+敏感的特性有关 , 这个盐桥可以改变 S2 的尺
寸.Arg152与 Asp263之间的离子对由一个涉及相
邻Glu154和 Glu238的离子网进一步稳定.从图 3
可以发现在AtAHL中 Hal2p中的Asp263被取代为
Tyr (图 3中带下划线字母), 因此在 AtAHL 中不
一定形成类似于 Hal2p 的盐桥.在 Hal2p 中
Arg152和 Glu238可能形成盐桥.从图 3可以发现
AtAHL 上的 Arg154 和 Glu254 与 Hal2p 上 的
Arg152和 Glu238匹配 (图 3 带灰度底纹小写字母
表示).预测结构与 1QGX 的结构比较 , 可以发现
AtAHL 上的 Arg154 和 Glu254 与 Hal2p 上 的
Arg152和 Glu238 几乎重合 (图 8).因此 AtAHL
上的 Arg154 与 Glu254 可 能形成 一个 盐桥.
AtAHL对 Na+高度敏感 , 对 Li+适度敏感 , 可能
是由于这个盐桥的形成使金属结合位点 S2 变大 ,
造成比较小的 Li+不能稳定结合(Albert A , Martinez-
Ripoll M , Structural Biology of the Salt Tolerance ;
www .xtal.iqf r.csic.es/CMBE/articulos/ salt_tolerance.
pdb).然而 , 在 1FLF 的结构中不存在这两个关
键结构区域.
Fig.8　Comparision of the two salt bridges
each in one of the two structures , 1QGX
(in black)and the predicted structure
(in gray)
Amino acid numbering is for the predicted st ructure.
　　引起我们对 AtAHL 结构产生兴趣的原因之
一 , 是其理论结构 1FLF 中结 (三叶草结 , 如图
1a)的存在.根据早期的观点 , 蛋白质结构中不会
有结存在[ 27] .在现存结构中 , 只发现一些似是而
非的结.从 20世纪 90年代中期起 , 陆续发现了一
些较深的结[ 28] .根据我们未发表的系统分析 , 现
存 PDB中 (2003年 3月)存在三种结:活结 (例
如 1ED8)、 三叶草结 (例如 1K3R)和 8 字形结
(例如 1YVE).这些结表现为规则二级结构以成结
方式堆积的结果.而不是像理论结构 1FLF , 由没
有二级结构的多肽链形成.事实上 , 仅仅根据
AtAHL与 1QGX的序列比对 , 得到了 34%序列同
源性这个结果 , 就能根据经验断定 AtAHL 与
1QGX整体上有相似的三维结构.根据上述基于序
列同源性的结构预测 , 也证明 AtAHL 应该是一个
无结的结构.由于与 1FLF 相关的文章未发表 , 不
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能断定其理论结构产生方法中的问题.但是 , 根据
经验推测 , 1FLF 理论结构产生方法中的问题可能
有以下几点:a.没有找到较强同源性的结构模型;
b.过分依赖各种自动化程序 , 尤其是高温模拟退
火程序;c.对最终结果的合理性未仔细分析.这
些都是结构预测中应该注意的问题.本文所提供的
结构预测信息 , 有助于拟南芥中的 PAP 磷酸酶生
化特性和生物功能进一步的研究.我们期待完整的
X射线晶体结构的发表 , 以验证我们所得到预测结
构的正确程度.
参　考　文　献
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Fold Recognition and Structure Prediction for Arabidopsis thaliana
PAP-specif ic Phosphatase(AtAHL)＊
Peng Yi , Zeng Zong-Hao＊＊
(Insti tute of Biophysics , The Chinese Academy of Sciences , Bei jing 100101 , C hina)
Abstract　The three dimensional st ructure of Arabidopsis thaliana PAP-specific phosphatase was predicted by
use of various existing methods on sequence comparison , secondary structure prediction , three dimensional
structure prediction and simulation.It w as a structure similar with that of Hal2p in Saccharomyces cerev isiae ,
consisting of an α+β N-terminal domain and an α/β C-terminal domain.In the predicted st ructure , possible
binding si tes for Mg
2+ , as w ell as fo r other metal ions , and the st ructural base sensitive to Na+ were found.
These sites w ere related w ith the biochemical function of Arabidopsis thaliana PAP-specif ic phosphatase.The
structural and functional analysis suggested that the theoretical structure of Arabidopsis thal iana PAP-specific
phosphatase , having been deposited in PDB , is not reasonable.
Key words 　 PAP-specific phosphatase (AtAHL), three dimensional st ructure , st ructure prediction ,
Arabidopsis thaliana
　＊This work was supported by a grant f rom The Nat ional Natural Science Foundation of China (30080004).
　＊＊Corresponding author.Tel:86-10-64855592 , E-mail:zzh@sun5.ibp.ac.cn
　Received:February 27 , 2003　　Accepted:Ap ril 24 , 2003
·573·2003;30 (4)　　 　　 　　　生物化学与生物物理进展　　 Prog.Biochem.Biophys.