全 文 ：基金项目：甘肃省科技支撑计划“用转基因技术培育葡萄抗寒新品种的研究”(090NKCAO58)。
第一作者简介：申鹏，男，1988年出生，陕西米脂人，在读硕士研究生，研究方向为园艺植物生物技术。通信地址：730070甘肃省兰州市安宁区营门村
1号甘肃农业大学农学院，E-mail：9621264@qq.com。
通讯作者：陈佰鸿，男，1969年出生，甘肃古浪人，教授，博士，主要从事园艺植物生物技术方面的研究。通信地址：730070甘肃省兰州市安宁区营门
村1号甘肃农业大学农学院，E-mail：bhch@gsau.edu.cn。
收稿日期：2013-04-17，修回日期：2013-06-19。
拟南芥转录因子CBF2的克隆与生物信息学分析
申 鹏，毛 娟，刘爱平，陈佰鸿
（甘肃农业大学农学院，兰州 730070）
摘 要：本研究旨在克隆转录因子CBF2并对其进行生物信息学分析得到该基因相关信息。试验以拟南
芥基因组DNA为模板，根据GenBank中拟南芥转录因子CBF2(FJ491243.1)已知序列设计引物，回收扩
增的目的片段与T-easy载体连接后转入大肠杆菌(E.coli DH5α)，经蓝白斑筛选后提取重组体的质粒，经
滞后筛选、PCR、酶切鉴定无误后进行测序。经生物信息学分析，该基因全长 651 bp，其中编码区长
648 bp，编码216个氨基酸，其蛋白的分子式为C1056H1623N293O333S16，相对分子质量为24.26 kDa，等电点为
5.00，该蛋白为亲水性非分泌型蛋白，无信号肽存在；其蛋白质二级结构以α-螺旋、β-折叠和无规卷曲为
主。肽链可能含有9处丝氨酸磷酸化位点，6处苏氨酸磷酸化位点，以及2处酪氨酸磷酸化位点。本研
究通过对CBF2基因的生物信息学分析，获得了该基因的相关信息，并与已有研究结果进行比对分析，
推测该基因在植物抗逆过程中有重要的作用。
关键词：拟南芥；转录因子；CBF2；克隆；生物信息学
中图分类号：Q785 文献标志码：A 论文编号：2013-1118
Cloning and Bioinformatic Analysis of Transcription Factor CBF2 in Arabidopsis thaliana
Shen Peng, Mao Juan, Liu Aiping, Chen Baihong
(College of Agronomy, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070)
Abstract: The purpose of this study was to clone the transcription factor CBF2 and analysis of the gene related
information of the bioinformatics. Arabidopsis genomic DNA was used as templates, and primers were designed
according to the Arabidopsis transcription factor CBF2 (FJ491243.1) of known sequence. The recycling
amplified fragments were connected with T-easy vector, and then transformed into E. coli DH5α. The
recombinant plasmid after blue-white screening was sequenced after lag selection, PCR, restriction enzyme
digestion. With the bioinformatics analysis, the cloned CBF2 gene was 651 bp including code segment 648 bp,
encoding 216 amino acids, the predicted CBF2 protein’s molecular formula was C1056H1623N293O333S16, whose
relative molecular mass was 24.26 kDa and isoelectric point was 5.00. It was predicted that this protein was
hydrophilic and non-secretary protein, and there was no signal peptide. Characteristic prediction results
indicated that the secondary structure of CBF2 protein mainly included α-helix, β-sheet and random coil.
And there were night serine sites, six threonine sites, and two tyrosine sites. In this study, related information
was obtained by means of bioinformatics analysis of CBF2 gene, and through comparing with previous studies,
the gene played an important role in the plant resistance.
Key words: Arabidopsis thaliana; transcription factor; CBF2; cloning; bioinformatics
中国农学通报 2014,30(4):90-95
Chinese Agricultural Science Bulletin
申 鹏等：拟南芥转录因子CBF2的克隆与生物信息学分析
0 引言
低温在很大程度上限制植物的生长、发育、生存以
及种植范围，许多果树在低温条件下都发生不同程度
的损害，造成减产和品质下降，严重时甚至导致整个植
物死亡 [1]，危害范围最广，加上生态环境破坏日益严
重，并且伴随着生物技术的发展，有关植物如何抗冷的
生物学问题显得更加突出并且引起人们的普遍关注。
而作物的抗寒性状是由多个基因控制的，只有成簇抗
性相关基因的转录激活，才能有效提高作物的抗寒能
力，克隆并鉴定调控抗寒功能基因表达的转录因子也
就成为这一领域的研究热点。CBF转录因子是转录
因子家族之一，在低温条件下，CBF基因通过结合在
顺式作用元件CRT/DRE上，并激活其下游COR基因
的表达，从而提高植物的抗冻能力，且转入CBF基因
的植物，能够激活多个COR基因的表达，所以比单纯
转入某个COR基因的植物更加耐寒[2]。
1997年Stockinger等[3]采用酵母单杂交实验证明，
CBF1 和 CBF2 都 能 够 与 COR15A，COR15B、或
COR78/RD29A基因启动子的CRT/DRE顺式作用元件
结合，激活下游LacZ基因表达。随后Gilmour等 [4]和
Jgalo-Ottosne等[5]相继分离出了和DRE/CRT元件结合
并联合调控下游基因表达的转录因子基因，分别命名
为CBF2、CBF3。研究表明CBF1、CBF3、CBF2紧密连
锁，依次排列在拟南芥 4号染色体的短臂上。2002年
Haake等[6]鉴定出受干旱而非低温诱导表达的CBF4定
位在 5号染色体上，和其他 3个CBF基因相似，也是
COR基因表达的一个调节因子。Hsieh等[7]将拟南芥
CBF1转入番茄中，发现转基因番茄的抗旱性和耐低
温性都明显增强；Liu等[8]用CBF3转化拟南芥，他们获
得的转基因拟南芥植株的抗逆性均得到综合的改良。
也有一些关于CBF2基因的研究，Jaglo等[9]报道转拟南
芥 CBF2的油菜 (Brassica campestris)植株中，EL5值
（导致50%组织电解质渗漏出来的冰冻温度）比未转化
油菜低4.6℃。CBF基因家族成员在植物抗寒、抗旱及
抗盐碱方面可能起着很大的作用[10]，其中CBF1、CBF2
和CBF3均受低温迅速诱导表达并且激活下游多个低
温反应基因的表达，因而有利于植株抗冻性的提
高 [11]。而目前对 CBF基因家族成员的研究集中在
CBF1和 CBF3，对 CBF2了解还很少。研究发现，
CBF2对CBF1和CBF3具有反向调控的作用，当CBF1
和CBF3下游基因表达产物过量时，CBF2对CBF1和
CBF3进行反馈调节，保持各成员调控的下游基因表
达产物数量相对平衡[12]。Vogel等[13]发现拟南芥受低
温诱导表达的 25个基因中，有 19个是CBF2诱导的，
所以认为CBF2能够高效地诱导耐冷基因的表达；但
到目前为止对CBF2基因的功能仍然没一个准确的定
论，由此可见，CBF2的深入研究是相当必要的。
本试验对转录因子CBF2进行克隆和生物信息学
分析，为进一步了解转录因子CBF2基本结构、功能
等，以及研究植物的抗冻机理奠定理论基础，同时为今
后转化其他经济作物，利用CBF2基因综合改良这些
作物的抗逆性具有重要意义。
1材料和方法
1.1 材料
拟南芥试管苗由甘肃农业大学农学院果树学开放
实验室保存。
1.2菌株和载体
E.coli DH5α由本实验室保存，pGEM-Teasy Vector
载体购自Promega公司。
1.3 试剂
Taq DNA聚合酶、RNase、限制性内切酶、IPTG、
X-gal、dNTP等分子生物学试剂购于北京天根生化科
技有限公司；其他生化试剂和常规试剂均为超纯和分
析纯。
1.4 试验方法
1.4.1 拟南芥基因组总DNA的提取与检测 拟南芥基
因组总DNA提取采用CTAB法 [14]，采用 1%琼脂糖凝
胶电泳检测。
1.4.2 PCR扩增目的基因 根据GenBank中拟南芥基
因组的序列，用Oligo6.0设计如下一对PCR扩增引物，
并且加上酶切位点 SacⅠ（酶切位点：GGATC）和
BamHⅠ（酶切位点：GAGCT），引物由北京赛百盛生
物技术有限公司进行合成。P1：5’-GCGGATCCTCAT
GACTCGAAAACATAATCCA-3’；P2：5’-GCGAGCT
CTGCACTGCTTGAGCTGCATA-3’。
PCR反应体系采用 25.0 µL总体积，其中 10 ×
Buffer 2.5 µL；dNTP 2.0 µL；引物 P1 2.0 µL；引物 P2
2.0 µL；模板DNA 2.0 µL，Taq酶 0.5 µL。扩增条件：
94℃ 10 min，94℃ 1 min，60℃ 1 min，72℃ 1.5 min，35
个循环，72℃ 10 min。
1.4.3 目的片段的回收和与pGEM-Teasy Vector载体的
连接及转化 PCR扩增产物按照天根生化科技（北京）
有限公司普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒法回收，保
存在-20℃下备用。将回收产物和 pGEM-Teasy Vector
按总体积 10 µL连接，其中 2×T4 DNA ligase buffer
5.0 µL；PCR回收产物 3.0 µL；T4 DNA ligase 1.0 µL；
pGEM-Teasy Vector 1.0 µL。在37℃烘箱中连接3~4 h。
并转化大肠杆菌，在含 50 mg/L 氨苄青霉素
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(Ampicillin，Amp)的 LB固体培养基上 37℃恒温暗培
养12 h以上。
1.4.4 质粒DNA的提取和重组质粒的鉴定 采用碱裂
解法小量质粒DNA提取的方法[14-15]；PCR反应体系与
反应程序同1.2.2，用XbaⅠ和SacⅠ进行双酶切鉴定。
1.4.5 序列测定 序列测定由北京赛百盛生物技术有限
公司完成。
1.4.6 生物信息学分析 用 ProtParam软件(http://web.
expasy.org/protparam/)对该基因的分子量、等电点和不
稳定系数等进行预测；ProtScale 程序 (http://web.
expasy.org/protscale/)进行亲疏水性分析；Signal 3.0
Server 软件检测是否存在信号肽序列；TMHMM
Server v. 2.0 软件对蛋白质跨膜区段进行预测；
NetPhos2.0 Server推测其磷酸化位点。
2 结果与分析
2.1 拟南芥总DNA的提取与目的基因的扩增
用CTAB法从拟南芥叶片中提取总DNA，电泳图
谱如图1所示，目的条带清晰、完整，杂质少，可以进行
PCR扩增试验。以提取的拟南芥总DNA为模板，在引
物和酶的作用下进行PCR扩增，结果如图2所示，扩增
出与预期大小相符的目的片段长约700 bp，条带清晰，
无污染，可以进行回收利用。
2.2 目的基因的克隆与鉴定
将扩增得到的目的基因片段回收与 pGEM-Teasy
连接并转入E.coli DH5α，通过蓝白斑筛选，随机挑选
白色重组质粒提取其DNA，作为模板建立PCR反应体
系，进行PCR鉴定如图3所示，结果能够扩增出大小约
为 700 bp的片段；用 SacⅠ和BamHⅠ双酶切重组质
粒，电泳后见图 4所示，在约 700 bp位置得到清晰的
DNA条带，700 bp的小片段是从重组质粒中经双酶切
得到的被插入的目的片段。其大小与以重组质粒为模
板，PCR扩增得到的片段大小基本一致，初步断定已
1 2
1、2：拟南芥叶片总DNA
图1 拟南芥总DNA琼脂糖凝胶电泳
2000 bp
1500 bp1000 bp
700 bp
400 bp
200 bp
1 2 M
1、2：PCR扩增产物；M：Marker V
图2 PCR扩增电泳图
2000 bp
1500 bp
1000 bp
700 bp
400 bp
200 bp
M 1 2
1、2：重组质粒扩增产物；M：Marker V
图3 重组质粒DNA PCR扩增图
1 M
2000 bp
1500 bp
1000 bp700 bp
400 bp200 bp
1：酶切产物；M：Marker V
图4 重组质粒双酶切电泳图
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申 鹏等：拟南芥转录因子CBF2的克隆与生物信息学分析
经克隆出CBF2转录因子。
2.3 测序结果及对应氨基酸序列
重组质粒鉴定完成后送往赛百盛公司进行测序，
测序结果如图 5所示，克隆的CBF2基因长 651 bp，编
码 216个氨基酸，并且含有起始密码子ATG和终止子
TAA。
氨基酸组成
Ala (A)
Arg (R)
Asn (N)
Asp (D)
Cys (C)
Gln (Q)
Glu (E)
Gly (G)
His (H)
Ile (I)
数量
24
13
8
14
5
7
18
12
4
6
百分比/%
11.1
6.0
3.7
6.5
2.3
3.2
8.3
5.6
1.9
2.8
氨基酸组成
Leu (L)
Lys (K)
Met (M)
Phe (F)
Pro (P)
Ser (S)
Thr (T)
Trp (W)
Tyr (Y)
Val (V)
数量
15
10
11
9
10
20
10
5
7
8
百分比/%
6.9
4.6
5.1
4.2
4.6
9.3
4.6
2.3
3.2
3.7
图5 CBF2基因全长序列
2.5 CBF2基因的氨基酸组成及亲、疏水性分析
根 据 ProtParam 软 件 (http://web.expasy.org/
protparam/)预测表明该蛋白质的分子量为 24.26 kDa，
分子式为C1056H1623N448O333S16，；理论等电点为5.00；带负
电荷的氨基酸残基数(Asp+Glu)为32，带正电荷的氨基
酸残基数(Arg+Lys)为23；不稳定系数为55.17，此蛋白
为不稳定蛋白（标准40以下为稳定蛋白）；理论推导半
衰期大约为 30 h；脂肪系数为 59.77。在推导的CBF2
蛋白的氨基酸组成中，含量较高的氨基酸有：Ala
(11.1%)、Ser(9.3%)、Glu(8.3%)、Leu(6.9%)，不含 Ply和
Sec，如表1所示。
用在线的 ProtScale 程序 (http://web.expasy.org/
protscale/)进行疏水性分析（图 6），也可得出该蛋白为
亲水性蛋白。以SignalP3.0 Server软件检测发现该序
表1 CBF2的氨基酸含量
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中国农学通报 http://www.casb.org.cn

列中没有信号肽序列，而信息肽是引导前体蛋白通过
细胞膜分泌到胞外的一段序列，这说明拟南芥中的
CBF2蛋白为非分泌性蛋白。
2.6 拟南芥CBF2基因的蛋白质结构预测
利用 TMHMM Server v. 2.0软件对CBF2蛋白进
行蛋白质跨膜区段预测CBF2蛋白整条肽链都位于细
胞膜外，根据隐马尔可夫模型显示说明该蛋白不存在
跨膜结构域。
通过在线蛋白分析软件 Predict protein进行蛋白
质二级结构预测，CBF2蛋白质其二级结构类型为：α-
螺旋（用 H表示）占 17.59%；β-折叠（用 E表示）占
8.33%；无规卷曲（用 L表示）占 74.07%，可以看出
CBF2转录因子主要α-螺旋和无规则卷曲组成，β-转角
散布于其中。
根据NetPhos2.0 Server推测，CBF2蛋白有 9处丝
氨酸磷酸化位点、6处苏氨酸磷酸化位点和2处酪氨酸
磷酸化位点（图7）。可以推测，CBF2基因可能是通过
可逆的磷酸化反应对逆境胁迫进行感知和应答的。
横坐标为编码蛋白的氨基酸顺序，纵坐标为亲、疏水值；“-”表亲水性，“+”表疏水性。
图6 CBF2蛋白质疏水性分析
图7 CBF2基因磷酸化位点分析
3 讨论
本试验在重组体的筛选中，分别利用了蓝白斑筛
选、PCR、酶切鉴定，此 3种方法中，蓝白斑筛选是前
提，方法虽然简单，但是至关重要，其目的在于提取纯
化重组体质粒，其纯化程度相对较高时，才能进行之后
的 PCR和酶切鉴定，而 PCR和酶切 2种鉴定方法比
较，酶切要求的纯度更高，并且操作要求更加严谨。若
只用某1种或2种方法鉴定重组体，判断结果时会出现
失误，误把假阳性重组体认为是重组体。
本试验成功地克隆了拟南芥转录因子CBF2，基
因长651 bp，编码216个氨基酸，与GenBank公布的序
列比较，核苷酸同源性为99.8%，导致差异的原因有可
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申 鹏等：拟南芥转录因子CBF2的克隆与生物信息学分析
能是因为物种相同而品种之间在进化过程中发生碱基
突变，但是基本不会影响该基因表达。但由于植物抗
寒性的提高是受多基因控制的，而且还与其他环境因
子的胁迫发生存在交叉作用[16-17]，这就增强了抗寒机制
研究的复杂性，因此在进行植物抗冻性基因工程研究
时应综合考虑多种环境胁迫之间的相互作用，以及基
因的转入对植物抗外界逆境综合适应性的影响。
蛋白质的磷酸化是最普遍、最重要的一种蛋白翻
译后修饰方式。它是植物在逆境胁迫条件下体内能量
代谢和信号传递中的重要生化反应[18]。一般来说，多
肽链的氨基酸潜在的磷酸化位点越多，发挥更多功能
的可能性就越大。从预测分析中可以看到，该肽链具
有9处丝氨酸磷酸化位点、6处苏氨酸磷酸化位点和2
处酪氨酸磷酸化位点，由此可以推测CBF2基因可能
是通过可逆的磷酸化反应对逆境胁迫进行感知和应答
的。
4 结论
本试验成功地克隆了拟南芥转录因子CBF2，通
过生物信息学分析，预测得到该蛋白分子式为
C1056H1623N448O333S16，分子量为 24.26 kDa，等电点 5.00，
不稳定系数为55.17，脂肪系数为59.77，是一种非分泌
性亲水性蛋白；其二级结构包括α-螺旋17.59%、β-折叠
8.33%以及无规卷曲 74.07%，这些性质为接下来进一
步研究该基因家族的结构、生物学功能奠定了理论基
础。另外通过分析得到该蛋白具有9处丝氨酸磷酸化
位点、6处苏氨酸磷酸化位点和 2处酪氨酸磷酸化位
点，可以推测该基因可能在参与逆境胁迫反应，对增强
植物抗逆性的研究中起到重要作用。
参考文献
[1] Gilmour S J, Zarka D G, Stockinger E J, et al. Low temperature
regulation of the Arabidopsis CBF family of AP2 transcriptional
activation as an early step cold-induced COR gene expression[ J].
The Plant Journal,1998,16(4):436.
[2] 张晗,信月芝,郭惠明,等.CBF转录因子及其在植物抗冷反应中的
作用[J].核农学报,2006,20(5):406-409,448.
[3] Stockinger E J, Gilmour S J, Thomashow M F. Arabidopsis thaliana
CBF1 encodes an AP2 domain-containing transcriptional activator
that binds to the C-repeat/DRE, a cis-acting DNA regulatory
element that stimulates transcription in response to low temperature
and water deficit[J]. Proceedings of the National Academy of
Sciences of USA, 1997,94:1035-1040.
[4] Gilmour S J, Zarka D G, Stockinger E J, et al. Low temperature
regulation of the Arabidopsis CBF family of AP2 transcriptional
activator as an early step in cold–induced COR gene expression[J].
Plant J,1998,16(4):433-442.
[5] Jaglo-Ottosen K R, Gilmour S J, Zarka D G, et al. Arabidopsis
CBF1 over expression induces COR genes and enhances freezing
tolerance[J].Science, 1998,280(5360):104-106.
[6] Haake V, Cook D, Riechmann J L, et al. Transcription factor CBF4
is a regulation of drought adaptation in Arabidopsis[J].Plant
Physiology,2002,130(2):639-648.
[7] Heish T H, Lee J T, Yang P T, et al. Heterology expression of the
Arabidopsis C-Repeat/Dehydration response element binding factor
1 gene confers elevated tolerance to chilling and oxidative stresses
in transgenic tomato [J]. Plant Physiology, 2002(129):1086-1094.
[8] Liu Q, Kasuga M, Sakuma Y, et al. Two transcription factors,
DREB1 and DREB2, with an EREBP/AP2 DNA binding domain
separate two cellular signal transduction pass ways in drought and
low temperature-responsive gene expression, respectively, in
Arabidopsis [J]. Plant Cell, 1998(10):1391-1406.
[9] Jaglo K R, Kleff S, Amundsen K L, et al. Components of the
Arabidopsis C-repeat/dehydration-responsive element binding
factor cold-response pathway are conserved in Brassica napus and
other plant species [J]. Plant Physiology, 2001,127(3):910-917.
[10] 沙丽娜,郭兆奎,万秀清,等.转录因子CBF基因转化烟草抗寒性指
标的检测[J].中国林副特产,2009(1):4-7.
[11] Kanaya E, Nakajima N, Morikawa K, et al. Characterization of the
transcriptional activator CBF1 from Arabidopsis thaliana[J]. The
Journal of Biological Chemistry, 1999,274(23):16068-16076.
[12] Novillo F, Alonso J M, Ecker J R, Salina J. CBF2/DREB1C is a
negative regulator of CBF1/DREB1B and CBF3/DREB1A
expression and plays a central role in stress tolerance in Arabidopsis
[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of USA,
2004,101(11):3985-3990.
[13] Vogel J T, Zarka D G, Van Buskirk H A, et al. Roles of the CBF2
and ZAT12 transcription factors in configuring the low temperature
transcription of Arabidopsis [J].The Plant Journal, 2005,41(2):
195-211.
[14] 萨姆布鲁克 J,拉塞尔D W.分子克隆实验指南(第三版)[M].北京:
科学出版社,2002:1.
[15] 傅荣昭,孙勇如,贾士荣.植物遗传转化技术手册[M].北京:中国科
学技术出版社,1994:133-134.
[16] 徐春波,王勇,赵海霞,等.我国将CBF转录因子应用于基因工程的
研究进展[J].安徽农业科学, 2010,38(4):1723-1726,1816.
[17] 李新玲,杨传平,徐香玲,等.与逆境胁迫相关的 rd29A启动子和
CBF2基因的克隆及其表达载体构建[J].安徽农业科学,2007,35
(13):3828-3829,3853.
[18] 徐蓓,郭丽香,赵昌平,等.长穗偃麦草SnRK2.6基因克隆及生物信
息学分析[J].麦类作物学报,2012,32(1):36-43.
·· 95