全 文 ：拟南芥基因组中新的microRNA预测及分析
金伟波 1,2, 孔 栋 2, 应晓敏 1, 郭蔼光 2, 李伍举 1
（ 1.军事医学科学院基础医学研究所计算生物学中心，北京 100850；2.西北农林科技大学生命科学学院，西安 712100）
摘要:MicroRNA(miRNA)是一类存在于动植物体内、长度为 21~25nt的内源性小 RNA,对生物体的转录
后基因调控起着关键作用,但一些低丰度的 miRNA和组织特异性 miRNA往往很难发现。为了系统识别拟南芥
基因组中新的非同源miRNA,首先基于已报道的拟南芥 miRNA的特征,从全基因组范围中筛选出 453条可能的
miRNA前体;其次,为了进一步对上述 miRNA前体进行筛选,利用人的 miRNA前体数据构建了支持向量机模
型 GenomicSVM,该模型对人测试集的敏感性和特异性分别为 86.3%和 98.1%(30个人 miRNA前体和 1000个
阴性 miRNA前体),对拟南芥测试集的正确率为 93.6%(78个 miRNA前体);最后,利用 GenomicSVM预测上
述 453条 miRNA前体序列,得到了 37条候选的新的拟南芥 miRNA前体,为进一步的 miRNA实验发现研究提
供了指导。
关键词:拟南芥;基因组;microRNA;预测
中图分类号:Q74
生物物理学报 第二十三卷 第五期 二**七年十月
ACTABIOPHYSICASINICA Vol.23No.5 Oct.2007
收稿日期:2007-02-02
基金项目:国家自然科学基金项目（ 30470411，30500105）
通讯作者:李伍举，电话 /传真：(010)66931324，E-mail：
liwj@nic.bmi.ac.cn;郭蔼光，电话 /传真：(029)87026171，
E-mail：guoaiguang@yahoo.com.cn
0 引 言
MicroRNA（ miRNA）是一类存在于动植物体
内的内源性的 ncRNA[1~5]，在生物体内起调节
mRNA稳定性及翻译作用。最早被发现的miRNA
lin-4和 let-7可通过与靶 mRNA3末端形成碱基
配对来抑制翻译，后来很多新发现的miRNA也以
相似的机制发挥作用[6]。不过miRNA大家族里也
有一些成员，特别是植物 miRNA，主要是通过
RNAi途径，以完全互补或接近完全互补的方式与
靶mRNA结合，从而达到降解靶基因目的[7,8]。
miRNA在生物体的不同部位和不同的发育阶
段对基因的转录后调控都起重要的作用[1~5]，因此
发现各物种的miRNA进而揭示其功能具有重要意
义。但通过实验手段只能使部分高丰度表达的
miRNA得到有效克隆，而大量低丰度表达的
miRNA却难以得到，因此，利用计算生物学方法
发现低丰度或组织特异性表达的miRNA，进而为
实验提供帮助已成为一条切实可行的途径。到目前
为止，已发展了许多算法与软件[9~15]，如基于比较
基因组学方法的软件有MiRscan[9,10]、SRNAloop[11]、
miRseeker[12]和 miRAlign[13]等，这些程序都需要通
过序列保守性来预测miRNA前体，因此利用它们
很难有效地发现某个基因组中非同源的新的
miRNA基因。另外，最近机器学习方法也逐渐用
于真假miRNA前体的区分问题，如Nam等人[14]于
2005年开发的基于隐马氏模型（ HMM）的
ProMIR来预测人的 pre-miRNA，正确率为 75%；
Xue等人[15]利用人miRNA前体数据集中的部分数
据作为训练数据，然后采用 SVM 方法构建
miRNA前体预测模型，对阳性测试集中的 30个
miRNA前体，预测精度为93.3%（ 28/30），对两个
阴性测试集来说，预测精度分别为 88.1%
（ 881/1000）和 89.0%（ 2175/2444）；此外，Loong
等人[16]也利用 SVM方法探讨了 miRNA前体的预
测问题，在他们构建的测试集上，其敏感性与特异
性分别为84.6%与98.0%；这些预测模型主要是基
于已知的数据集来探讨miRNA前体的预测问题，
还没有用于基因组水平的miRNA前体识别。
基于上述考虑，我们采用下列策略探讨拟南芥
基因组中新的非同源miRNA的识别问题，首先对
目前已知的78条拟南芥miRNA前体进行特征统
计，并以之为基础并结合比较基因组学方法，构建
了拟南芥基因组水平的新的非同源miRNA前体预
测流程，获得了453条miRNA前体；然后利用人
的 miRNA前体数据集和支持向量机方法构建了
2007年生 物 物 理 学 报
miRNA前体预测模型 GenomicSVM，并基于此模
型预测上述 453条 miRNA前体，最终获得了 37
条候选的新的非同源的拟南芥miRNA前体，为进
一步的miRNA实验发现研究提供了指导，也为其
它物种基因组中新的非同源的 miRNA识别提供
借鉴。
1 材料与方法
1.1 在拟南芥基因组中筛选具有发夹结构的序列
拟南芥基因组从 NCBI（ htp:/www.ncbi.nih.
nlm.gov/）库中下载；根据已公布拟南芥 miRNA
的相关特征，包括前体发夹结构及自由能（ 根据
RNAfold计算所得）、GC含量、前体长度、茎区
螺旋区长度和发夹环的长度等，从拟南芥基因组中
筛选pre-miRNA-like序列。
1.2 真假pre-miRNA数据集
人的pre-miRNA从miRNA数据库[17]下载，通
过去除那些没有发夹结构的pre-miRNA，最后得到
193条人pre-miRNA作为阳性数据集。目前认为，
miRNA基因主要位于基因组的非编码区，因此可
以认为，对于一些编码蛋白的基因序列，即使它们
具有一些与真正pre-miRNA类似的特征，仍认为
是假的pre-miRNA。基于此认识，本研究构建了一
个 ENCODE阴性数据集，它根据 UCSC的
refGene列表提取出人类编码基因的序列，用
RNAfold程序[18]预测这些序列的二级结构，提取所
有与已报道人的pre-miRNA具有相似特征并具有
发夹结构的序列，最后构建的 ENCODE包含了
7893条序列。
1.3 构建GenomicSVM的训练集和检测集
为了用支持向量机（ SVM）方法来判别真假
pre-miRNA，我们构建了一个训练集（ TR）和两
个测试集 TE-human和 TE-ath。其中 TR包括 163
条随机从阳性数据集中抽取的真的pre-miRNA（ 阳
性样本）和 1000条随机从阴性数据集 ENCODE
中抽取的假pre-miRNA（ 阴性样本）的序列；TE-
human包括了剩余的 30条真 pre-miRNA和 1000
条随机从阴性数据集 ENCODE中抽取的假
pre-miRNA（ 与 TR中的数据没有重复）。TE-ath
数据集中包含了从miRNA数据库[17]下载得到的78
条具有发夹结构的拟南芥miRNA。
1.4 支持向量机模型及其评估
本研究采用支持向量机软件包LibSVM[19]，该
软件包由台湾大学林智仁等人开发，具有操作简单
和易于使用等特点，可以解决分类问题、回归问题
以及分布估计等问题，提供了四种常用核函数（ 线
性、多项式、径向基和 S形函数）供用户选择，
可以有效地解决多类问题、交叉验证选择参数和对
不平衡样本加权等，其中Grid方法用于寻找最优
的罚分参数 C和径向基函数 RBF的核心参数 γ。
该软件包下载于 htp:/www.csie.ntu.edu.tw/~cjlin/
libsvm/oldfiles/。
另外，模型效果评价是评估一个模型在实际中
能否应用的关键步骤。对于一个包含阳性样本与阴
性样本的测试集来说，预测结果包括以下四种类
型：正确预测的阳性样本数目TP与阴性样本数目
TN，假阳性样本数目 FP与假阴性样本数目 FN。
基于这些数值，可以分别计算出模型的敏感性
（ Se）、特异性（ Sp）和分类精度（ ACC），具体计
算公式如下：
Se=TP/(TP+FN) (1)
Sp=TN/(TN+FP) (2)
ACC=(TP+TN)/(TP+TN+FP+FN) (3)
2 结果与分析
2.1 拟 南 芥 miRNA特 征 统 计 及 基 因 组 中
Hairpin-like序列的搜索
通过对测试集TE-ath中的78条具有发夹结构
的拟南芥miRNA前体序列进行分析与特征统计，
得到了如表1所示的结果。然后，以表1得到的结
果作为参数，从拟南芥基因组中识别 pre-
miRNA-like序列，具体流程见图1，去除冗余后，
最终得到453条可能的前体片段。
Table1 Thecharacteristicsofknown78pre-miRNAsinA.thaliana
Length(nt) GCcontent Stemlength Lengthofhelix Looplength Freeenergy
>70 0.36~0.70 >32nt >20bp ≥5nt <-9.6kcal/mol
390
第5期 拟南芥基因组中新的microRNA预测及分析
2.2 GenomicSVM模型的训练和检测
为了进一步从大量 pre-miRNA-like序列中识
别出真正的 pre-miRNA，我们开发了用于真假
miRNA前体识别的支持向量机模型GenomicSVM。
GenomicSVM是根据pre-miRNA的二级结构特征，
并利用SVM工具来预测miRNA前体的一个模型。
该模型在训练时选用RBF作为核函数，并用Grid
策略及10-fold交叉验证的方法来搜索RBF的最优
参数 γ，然后用优化的核心参数（ γ=0.125）训练
GenomicSVM， 并 通 过 两 个 测 试 集 来 检 验
GenomicSVM 的预测效果。如表 2所示，TE-
human中的 30条真的 pre-miRNA有 25条被正确
识别，得到模型的敏感性（ 即从阳性数据集中被正
确识别为阳性数据的条数）为 83.3%；另外的
1000条阴性序列有 981条被正确地识别为假的
pre-miRNA序列，得到模型的特异性（ 即从阴性数
据集中被正确识别为阴性数据的条数）为98.1%。
GenomicSVM及所有相关资料都可从网上免费下
载得到，网址为：htp:/geneweb.go3.icpcn.com/
genomicSVM/。
2.3 拟南芥候选pre-miRNA的预测
为了检测 GenomicSVM对拟南芥 pre-miRNA
的识别效率，我们用 TE-ath作为测试集来验证。
TE-ath中共有 78条拟南芥 pre-miRNA，其中 73
条得到了正确识别（ 见表 2），正确率为 93.6%。
Table2 PerformanceoftheGenomicSVM modelontestsetsTE-humanandTE-ath
Testset TP TN FP FN Se Sp ACC
TE-human
TE-ath
25
73
981
0
19
0
5
5
0.833
0.936
0.981
0.000
0.977
0.936
然后我们将 GenomicSVM模型用于上述得到的
453条 pre-miRNA-like序列的识别，最后得到了
37条候选的 pre-miRNA，其中 20条位于基因间
区，占54.1%；9条位于基因内含子区，占24.3%；
剩余的8条位于基因编码区,占21.6%（ 表3）。但
是根据文献[20]，miRNA在编码区上不应有很高的
比例，我们推测位于编码区上的这些miRNA可能
是一些反式作用小RNA。由于本研究在发夹结构
序列的筛选过程中去除了与目前已报道拟南芥和水
稻miRNA的同源序列，因此，本研究最后得到的
37条候选序列是新的拟南芥miRNA前体。
2.4 miRNA的靶标预测
作为miRNA，其主要作用是调控靶基因的表
达，因此，上节中预测的37条候选miRNA前体，
如果是真实的miRNA，在拟南芥中应该有对应的
被调控的靶标，为此，我们开展了miRNA靶标的
预测研究。
目前认为，植物miRNA的作用方式主要通过
与靶标基因编码区以接近完全互补的方式发生作用
（ near-perfectcomplementarity），从而降解靶标
mRNA[7,8,21]，为了进一步检测上述预测的拟南芥
miRNA的功能，通过Blast程序（ W：16，S：2；
表示搜索时wordsize为16nt，仅搜索互补链）将
候选的 37条成熟 miRNA（ 分别来自于相应
pre-miRNA发夹结构的两个茎区）与 EST库作互
补检索，如表 3所示，发现这些 miRNA的靶标
Fig.1 Flowchartforthe prediction ofpre-miRNA-like
sequencesintheA.thalianausingthecharacteristicsofthe
knownmiRNAsandcomparativegenomicsmethods
A.thalianagenome
Scantheplusstrandofthewhole
genomewiththewindowsize120nt
andstepsize2nt
Predictsecondarystructureofeach
fragmentusingRNAfoldprogram
Removethefragmentswiththesimilaritymorethan
95% toalknownPre-miRNAsinA.thalianagenome
Obtain453candidatePre-miRNAs
Keepthefragmentswiththecharacteristic
ofmiRNAhairpinstructures
Onlykeepthefragmentswithfreeenergyless
than-9.7kcal/Mol
OnlykeepthefragmentswithGC
contentbetween36% and70%
Removetheredundancyandkeepthe
fragmentswiththelowestfreeenergy
Removethefragmentswiththesimilaritymorethan
85% toalknownPre-miRNAsinricegenome
391
2007年生 物 物 理 学 报
mRNA从几十到几百不等，然而对于 AthmiR010
却没有找到相应的靶标EST序列，这存在两种可
能，一种是由于目前拟南芥的EST序列还不够完
整，也就是说AthmiR010的靶标序列还没有发现；
另一种就是本研究预测的AthmiR010可能为假阳
性片段。
Table3 ThelistofpredictedmiRNAsinA.thaliana
miRNANo. Chr. ΔG(kcal/mol) Tar1 Location2 Sequence
AthmiR001
AthmiR002
AthmiR003
AthmiR004
AthmiR005
AthmiR006
AthmiR007
AthmiR008
AthmiR009
AthmiR010
AthmiR011
AthmiR012
AthmiR013
AthmiR014
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
-17.99
-10.22
-13.00
-21.51
-15.80
-10.80
-17.40
-30.60
-15.72
-18.64
-16.38
-21.80
-17.45
-22.81
33
15
26
1
2
250
2
81
41
0
46
3
40
21
Intron
Inter
Inter
Inter
Inter
Inter
Exon
Inter
Inter
Intron
Exon
Intron
Exon
Exon
UGAAUGAACAGCCUAGACAAAAUAAAGAAGGCCACAAGUUA
AAUGAUUUCUCUUAGUAAGAAAAGGAGAAAGAGGAAAUCAG
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UGAUAGACAACAGUUCUAAAGAAGGGAAGAUGAGAUUCAGG
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GAUCAAUUAUUCAAAAAACAUACACCAAAUAGAUUUUA
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AAUAUUUCUACCGGAAUUACACGUACCAAAUUAAAAUCCGG
AUAUUAUAUCUGAAAACCCGAAAUAUAAUUAUAUAUAA
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GAUAAGUCUGGCUUGGCACAACUUGAAUCACACCUGGUUGU
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AAGAGAUACACAAGAGCAGGAAAAAAAGAAGAAGAUAAAGA
GAAAAUCACAUCAUUUAUUCUCUUGAGUGAUGAUUAAUAAG
UGAAUGAAUCACUCAAGAAGAUAUUAAAAAAGUGAUGA
（ tobecontinued）
392
第5期 拟南芥基因组中新的microRNA预测及分析
（ continued）
（ tobecontinued）
miRNANo. Chr. ΔG(kcal/mol) Tar1 Location2 Sequence
AthmiR015
AthmiR016
AthmiR017
AthmiR018
AthmiR019
AthmiR020
AthmiR021
AthmiR022
AthmiR023
AthmiR024
AthmiR025
AthmiR026
AthmiR027
AthmiR028
AthmiR029
1
1
2
2
2
2
2
2
3
3
3
3
3
4
4
-18.03
-20.03
-16.00
-14.62
-25.20
-21.48
-16.51
-14.72
-20.20
-19.19
-23.06
-15.99
-9.70
-24.12
-17.51
123
3
10
250
26
6
10
47
247
10
2
8
23
250
72
Exon
Inter
Inter
Exon
Inter
Exon
Intron
Inter
Inter
Inter
Inter
Intron
Intron
Inter
Inter
UAUACAUAUAUAGAGAGAGAGAAGAGGACAAAGAGUUGAA
AGAUGAAGACUCUCAUGUCUUCAUAGAAACAAGUGAUAUGU
GCGCUAAGAAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGACA
AAAGUAAAUUUAAAUGCAUGGAGAAUAGAAGUAUAAAACU
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UAUAGCAUAAGAGAGAAAAAUGGGCAUGAAUCGAAGAAGAG
CUAAUACAUAAUGUUGUAAAGAUGGCACAAGAAGAAAC
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UUCUUCUUCUUCUUCACCAUCGAAAAGAGAUAAUGAACCAA
GAAGAAGAAAAAACAGAGAACAAAAGGAUCAACGAGAUCGA
UGAAGACGAAGAAGAAGAGUUGGAGAACAAGAAGAUGG
AAUCAUCAUCAGUCUGCAUAGAAGAAUCAAGAAGCUAAAGA
AUCUUAAAAACGAAAAUAAUAAUAAAAAUCAAGAAACAUAG
AUUCUUGAGGAAUGUGAAGUUACCAAGUCUGAUUGAUU
393
2007年生 物 物 理 学 报
（ continued）
miRNANo. Chr. ΔG(kcal/mol) Tar1 Location2 Sequence
AthmiR030
AthmiR031
AthmiR032
AthmiR033
AthmiR034
AthmiR035
AthmiR036
AthmiR037
4
4
4
5
5
5
5
5
-25.40
-21.24
-18.49
-19.90
-21.20
-17.95
-20.05
-16.43
9
253
9
3
250
4
3
31
Inter
Intron
Intron
Inter
Inter
Inter
Inter
Intron
AUCAUUCAGAUGCAUCAUCCAAAUGGAUCAUGUAAAUGAAU
CAUUUGGAUGUAAAUGCUAAAUGAUGAAACAAACAGGACCU
AAAUAUAUAACACAAAAAUAAACAAAUAAUACUAUAAU
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CCCCCAAACUUAUUUCACACCGUCUCGGUGUAAAGAUAAUU
CCGGAAAAAAGACUAACGAAAAACAAAGAGAAAAUGAA
AUUAAAUAUCAAAUGAUUAAACAAACACUAGAAACAUCAUU
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AAUGAAAAUGCUAAAUGAUGAAACAAACAGGACCUAAC
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CAAAAACCGAAGAUGAUCAGCGAAACAUUAAAAAAAAAAAA
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AGCUCCAAGAUGUGUAAGAGUGCCUUAAAUGACUCAAAACA
UACGAAAAGAUUAGAAAGAGUCUAAAAACAACUCUGAAACU
AUGUUUGAAAUCAGUAAAAACUAGGACAUAUCAAAAAG
ACAAGUGCAGAAAGAUCCUUCAUAAUUUGAGCAAGAUCGUU
UACUGAUUCUACAACCUGGACAAUGACACAGACAACGAAGA
AGAAAAAAGAUUAUGAUUGAUUGCAAAAGAAAAAAAAA
1Tar:NumberofTargets;2Loc:LocationsofmiRNA(includeInter,intronandExon)
3 讨 论
miRNA在基因调控中扮演着重要的角色[22]。
Lewis等[23]研究认为，人类有1/3的基因由miRNA
调控。因此尽快找出所有的 miRNA并研究其功
能，对进一步理解基因表达调控具有重要意义。但
由于其片段较短，利用实验方法快速识别miRNA
具有很大困难[21]。因为在实验水平上，目前检测
miRNA主要是分离 18～28nt的小片段 RNA，然
后再通过克隆和测序的手段来获得。由于实验本身
的问题，使得研究者们克隆到的miRNA仅仅是表
达丰度较高的少数 miRNA，而大批的低丰度
miRNA却很难通过实验手段分离到。因此，利用
计算生物学方法来预测miRNA具有重要意义。通
过计算的方法来预测miRNA能在短时间内识别出
大量的miRNA，但同时也会产生大量的假阳性序
列，因此如何提高识别的准确率是在miRNA预测
中亟待解决的问题，也是生物信息学领域中普遍存
在的问题。
目前，对于拟南芥miRNA的预测一般仅从基
因间区入手，这将直接导致部分由基因区编码的
miRNA被遗漏。此外，目前在拟南芥的 miRNA
预测中，对于大量具有发夹结构的pre-miRNA-like
序列的筛选主要是根据miRNA的种间保守性，利
用比较基因组学方法来进行[8,24]。比较基因组学方
法虽然可以对miRNA进行有效的识别，但却很难
发现非同源的miRNA。为了克服上述缺陷，从拟
南芥基因组中找出新的miRNA，本研究首先从基
因组入手，在拟南芥全基因组范围预测 miRNA，
从而克服了目前方法对基因内编码miRNA的遗漏
的问题；然后本研究发展了一个 SVM 模型
GenomicSVM，它基于机器学习算法，对 miRNA
前体的筛选，无需比较基因组方法，也可以从大量
pre-miRNA-like序列中识别出真正的 pre-miRNA
394
第5期 拟南芥基因组中新的microRNA预测及分析
基因。检测表明该模型的敏感性为83.3%，特异性
为 98.1%。通过应用 GenomicSVM模型，最后从
453条可能的miRNA前体中预测出37条新型的拟
南芥候选miRNA。
发夹结构被认为是pre-miRNA的一个重要特
征，在miRNA前体识别中是必不可少的环节。然
而，在基因组中，往往存在着大量的具有类似结构
的序列，因此如何从这些具有类似发夹结构的片段
中找出少数真正的pre-miRNA是目前计算生物学
预 测 miRNA的 核 心 问 题 。 本 研 究 开 发 的
GenomicSVM模型具有98.1%的预测特异性，因此
应用该模型能够有效地从大量具有类似发夹结构的
序列中筛选出少数真正的pre-miRNA，然而，令人
遗憾的是该模型还存在 16.7%的假阳性识别。因
此，如何进一步优化该模型，以提高敏感性是今后
工作的重点。
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2007年生 物 物 理 学 报
ThisworkwassupportedbyagrantfromTheNationalNaturalSciencesFoundationofChina（ 30470411，30500105）
Received:Feb2,2007
Correspondingauthor:LIWu-ju,Tel/Fax：+86(10)66931324，E-mail：liwj@nic.bmi.ac.cn;
GUOAi-guang,Tel/Fax：+86(29)87026171，E-mail：guoaiguang@yahoo.com.cn
PREDICTIONANDANALYSISOFNOVELmiRNAINArabidopsisthaliana
JINWei-bo1,2， KONGDong2， YINGXiao-min1， GUOAi-guang2， LIWu-ju1
(1.InstituteofBasicMedicalSciences,AcademyofMilitaryMedicalSciences,Beijing100850;2.ColegeofLifeScience,
NorthwestA&FUniversityYangling,Xian712100,China)
Abstract:MicroRNAs(miRNAs),ranginginsizefrom 20~25nt,areagrowingfamilyofnoncoding
RNAs.Theyplayanimportantroleintheregulationofgeneexpression.Thelow abundanceofsome
miRNAsandtheirtime-andtissue-specificexpressionpaternsmakethem dificulttobeidentified.To
identifythenovelmiRNA systematicalyinA.thaliana,theauthorsfirstlyfound453pre-miRNA
candidatesfrom thegenomeusingthecharacteristicsoftheknownA.thalianamiRNAsandcomparative
genomicsmethods.Then,inordertoreducethenumberofputativepre-miRNAcandidates,theauthors
developedaSVM (supportvectormachine)model,GenomicSVM,usingthehumanmiRNA datasetas
thetrainingdataset.Themodelhadthesensitivity86.3% andspecificity98.1% respectivelyonthe
humantestdataset,whichcontained30positivehumanpre-miRNAsand1000negativepre-miRNAs.For
the78positivepre-miRNAsinA.thaliana,themodelcouldpickup73pre-miRNAsandthereforethe
corectratewas93.6%. Finaly, theGenomicSVM wasused to discriminatewhethereach 453
pre-miRNA-likesequencewaspre-miRNAornot.Theresultsindicatedthattherewere37novelmiRNA
candidates. Therefore, thestudy in thisreportprovidesbioinformaticshelp fortheexperimental
identificationofmiRNAsinA.thaliana.
KeyWords:A.thaliana;Genome;microRNA;Prediction
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