全 文 ：拟南芥茎表皮蜡缺失突变体cera蜡成分分析
连金番，常 青，孙建丽，石 磊，王 倩*
（西北农林科技大学生命学院，陕西 杨凌 712100）
摘 要：陆生植物表面覆盖的表皮蜡对其与环境相互作用和维持正常生长具有重要作用。表皮蜡是由疏水的
超长链脂肪酸（VLCFAs）及其衍生化合物组成。利用化学诱变剂EMS处理拟南芥野生型种子（Col-0），分离得到茎
蜡缺失突变体 cera。遗传分析表明，该突变株系为单基因隐性突变。突变体茎显浅绿、果荚短小且低育。扫描电
镜结果显示突变体茎表皮蜡晶体缺失。气相色谱分析茎表皮蜡化学组成成分和含量的结果揭示CERA作用于C24以
上超长链脂肪酸的延伸。
关键词：角质蜡；蜡缺失突变体；拟南芥；cera
中图分类号：Q946 文献标志码：A 文章编号：1005-9369（2011）10-0099-06
Phenotypical characterization of cera mutant deficient in stem cuti-
cular wax accumulation in Arabidopsis thaliana/LIAN Jinpan, CHANG Qing,
SUN Jianli, SHI Lei, WANG Qian(College of Life Sciences, Northwest Agriculture and Forestry
University, Yangling Shaanxi 712100, China)
Abstract: The surface of terrestrial plants is covered by a layer of wax that plays important roles in plant growth
and plant-environment interaction. Wax consists of a mixture of very long chain fatty acids (VLCFAs) and other
hydrophobic components derived from VLCFAs. By chemically mutagenizing seeds of Arabidopsis thaliana with
ethyl-methylsulfonate (EMS), a mutant expressing light green stems and shorter siliques was obtained and named cera.
Genetic analysis revealed that the phenotype of cera was led by mutation of a single recessive gene. Scanning electron
microscopy on cera stem displayed a severe wax deficient phenotype. Further analysis of chemical composition and
content of epicuticular wax on cera stem surface suggested that CERA played an important role in elongating more than
C24 very long chain fatty acids in Arabidopsis thaliana.
Key words: cuticular wax; wax deficient mutant; Arabidopsis thaliana; cera
角质层是覆盖陆生植物表层组织的一层由角质
和表皮蜡组成的脂质保护层。角质层的重要组成成
分角质是由氧化的C16和C18脂肪酸构成网状的油脂
聚酯[1]。嵌入和覆盖网状角质层的表皮蜡是一类超
长链脂肪族疏水化合物[2]，嵌入角质层的非晶体状
的表皮蜡称作内表皮蜡，而覆盖在角质层表面并形
成晶体的表皮蜡称为外表皮蜡[3]。
表皮蜡在植物生长发育过程中发挥重要作用，
如防止由非气孔蒸发造成的水分散失，抗寒[4]，抵
抗紫外线辐射[5]，去除植物表皮表面外部水分，以
降低溶于外部水分中的灰尘、花粉粒和其他有害物
质对植物表皮造成的伤害 [6-7]。在抵御细菌、真菌
病原体和昆虫的入侵及植物-昆虫相互作用方面表
皮蜡也发挥重要作用 [8-9]。另外表皮蜡还能提供一
种花粉粒-柱头相互作用信号使植物在适宜时期进
行授粉[10]。
收稿日期：2010-10-28
基金项目：西北农林科技大学引进人才启动基金（Z1H1020822）
作者简介：连金番（1984-），男，硕士研究生，研究方向为拟南芥超长链脂肪酸合酶代谢。E-mail: jplian@126. com
*通讯作者：王倩，博士，研究方向为植物脂肪酸代谢的分子生物学和遗传学。E-mail: ramese@nwsuaf. edu. cn
Journal of Northeast Agricultural University
东 北 农 业 大 学 学 报第42卷第10期 42(10): 99~104
2011年10月 Oct. 2011
气相色谱-质谱分析结果显示，植物表皮蜡有
100多种成分，主要包括长链和超长链脂肪族化合
物、环状化合物以及甾醇类化合物，这些化合物
均由 20~34个碳原子超长链脂肪酸衍生而来[3]。某
些植物表皮蜡质组成成分还包括酚、固醇、环萜
以及胡萝卜素类化合物[3, 11]。表皮蜡的化学组成成
分和数量在同一株植物上的不同部位及不同的生
长发育阶段也存在差异[12]。模式植物拟南芥的表皮
蜡的化学组成成分主要是超长链脂肪酸及其衍生
物，如醇、酯、烷烃、醛、酮等[3, 11]。
植物超长链脂肪酸的合成是将质体中合成的
C16/C18的长链脂肪酸在内质网中进一步延伸。该延
长过程由位于内质网的脂肪酸延长酶复合体催化，
此复合体由四个酶组成，依次催化四步反应：①脂
酰-CoA和丙二酰-CoA由 3-酮脂酰-CoA缩合酶催
化聚合反应生成 3-酮脂酰 -CoA；② 3-酮脂
酰-CoA被 3-酮脂酰-CoA还原酶还原生成 3-羟脂
酰-CoA；③ 3-羟脂酰-CoA由 3-羟脂酰-CoA脱水
酶催化脱水生成烯脂酰-CoA；④烯脂酰-CoA经烯
脂酰-CoA还原酶还原成比第一步脂酰-CoA多两个
碳原子的脂酰-CoA[13]。
生成的超长链脂肪酸经过一系列特异生物途
径衍生为蜡的不同组分。已有文献报道，拟南芥
中表皮蜡中脂肪族成分合成有两条途径：脱羧途
径和酰基还原途径 [14]。脱羧途径从脂酰-CoA还原
酶催化超长链脂肪酸前体生成醛开始，经由醛脱
羧酶催化生成奇数碳原子的烷烃[15]，烷烃再经过一
系列的氧化生成次级醇和酮；酰基还原途径始由
对超长链脂肪酸的还原生成初级醇[16]，部分初级醇
进一步和游离脂肪酸酯化生成蜡脂[17]。
角质蜡能影响植株茎表皮色泽，所以一旦蜡合
成有关的基因发生突变导致蜡含量减少，肉眼即可识
别到植株茎表皮色泽变化。在大麦和拟南芥中蜡缺失
突变体称为 eceriferum（cer），而在玉米和甘蓝型油菜
被称为gl。目前与拟南芥蜡合成有关的多个基因已被
报道，如 CER1、 CER2、 CER3、 CER4、 CER5、
CER6和 CER10等，已从拟南芥基因组中克隆到
cer1、cer2和cer3突变体蜡缺失表型显著，但克隆的
基因在蜡合成及运输中的具体作用尚不清楚 [18-21]。
CER4编码的酶催化酰基还原途经的初级醇生成[22]。
CER5编码 ABC转运蛋白负责表皮蜡的运输 [23]。
CER6和CER10分别编码植物超长链脂肪酸合成酶
复合体的3-酮脂酰-CoA缩合酶和烯脂酰-CoA还原
酶[24-25]。在大麦中分别克隆到与CER1、CER2基因
相似性高的GL1和GL2基因。但是，目前对拟南芥
蜡合成基因的研究还不十分完善。我们利用EMS
化学诱变剂处理野生型拟南芥得到茎表皮蜡缺失突
变体 cera。该突变体茎色泽浅绿，果荚和植株较野
生型短小。本研究对该突变体进行扫描电镜观察植
株茎表皮蜡晶体形态，遗传分析，茎表皮角质蜡化
学组成成分和含量分析，为以后该基因的克隆及研
究其在角质蜡合成过程发挥的角色奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料
野生型拟南芥（Arabidopsis thaliana）：生态型
Columbia（Col-0）；拟南芥突变体 cera：由本实验室
用EMS诱变得到的茎色突变株系。
1.1.2 数据库
本试验所需数据信息来源于: http://www. ncbi.
nlm. nih. gov/, http: / /www. arabidop sis. org/（TAIR）
和http://www. genevestigator. ethz. ch/。
1.2 方法
1.2.1 EMS处理野生型拟南芥
取 2 g野生型种子（Col-0）于 100 mL无菌水
中，4 ℃过夜。加 400 mL无菌水，磁力搅拌器搅
拌，100 r·min-1离心 1 h。加入EMS使其终浓度为
0.3%（V/V），室温，100 r·min-1离心16 h。4 ℃静置
3 d，种植材料。
1.2.2 材料种植
拟南芥在 0.1%的琼脂糖中 4 ℃春化 2~4 d后培
养在黑土􀏑蛭石􀏑沙子（1􀏑1􀏑1）的混合土中。培养时
在其上层罩一层塑料膜以保持湿度，当拟南芥萌发
出 4~5片子叶后去掉塑料膜。16 h光照处理，8 h
黑暗 [26]，湿度保持在 60%~70%，温度控制在 22~
25℃，光照强度2 800 lx。
1.2.3 突变体的背景纯化与遗传分析
以拟南芥野生型Col-0为父本，突变体为母本
进行回交得到F1代，F1代自交得到F2代。种植并观
察F2代表型，统计F2代中茎浅绿色突变体和正常植
株茎色的比例。
1.2.4 电子扫描显微镜观察
取植株顶端 2.5 cm茎包于锡箔纸中，-180 ℃
东 北 农 业 大 学 学 报·100· 第42卷
真空放置 5 min。样品置于电子扫描显微镜（Hit-
achi S4700），2.5 kV加速电压，观察植株茎表皮蜡
晶体。
1.2.5 茎表皮蜡提取及组分分析
将茎浸泡在含 5 μL 1 μg·μL-1 C24􀏑0烷烃的三氯
甲烷中30 s，于液氮中干燥浓缩。浓缩后的样品转
入到气相色谱分析管中，加10 μL N，O-三氟乙酰
胺和 10 μL吡啶后，70 ℃加热 1 h，液氮干燥，加
100 μL三氯甲烷，进行气相色谱氢焰离子化检测
（GC-FID）和气相色谱-质谱（GC-MS）分析。
2 结果与分析
2.1 突变体cera的表型与遗传分析
cera突变体是经化学诱变剂EMS诱导野生型拟
南芥（Col-0）筛选得到的茎色变化植株。该突变体
茎表现为浅绿色，这种表型与蜡缺失 cer系列突变
体表型相似，因此命名为 cera（见图 1）。另外，突
变体果荚长度也较野生型短并且低育，我们将突变
体和 cer6置于潮湿环境中培养，cer6果荚长度恢复
到野生型水平，而 cera却未恢复，这说明 cera低育
并不像 cer1和 cer6一样，它们的低育是由于花粉粒
水化导致的 [14, 18, 27]。由花粉粒水化导致的低育植
株，在潮湿环境中培养，生育能力可恢复到野生型
水平。
为了探讨该突变是否由于单基因隐性突变造
成，将筛选到的cera突变体与野生型拟南芥（Col-0）
杂交得到F1代，F1所有植株均表现野生型表型。F1
自交后得到F2代，种植 96株F2，其中 73株表现野
生型表型，23株表现 cera表型，比例为3.17􀏑1（x2=
0.0577，P>0.7），证实该突变为单基因隐性突变。
2.2 扫描电子显微镜观察cera突变体茎表皮蜡
为揭示 cera突变体茎色泽变化是否与其茎表皮
蜡含量变化有关，用扫描电镜观察 cera突变体和野
生型拟南芥的茎，结果显示野生型茎表面布满晶体
状表皮蜡，这些晶体有柱状、锥状、棒状、伞状
等，然而 cera突变体茎表面却没有观察到晶体状蜡
（见图2）。cera突变体茎表皮蜡缺失的表型与 cer系
列茎表皮蜡缺失表型相似，说明CERA基因可能与
拟南芥茎表皮蜡的合成和运输有关。
图1 野生型(Col-0)和突变体cera
Fig. 1 Wild type and cera
图2 野生型和突变体cera茎表皮蜡晶体分布
Fig. 2 Stem surface morphology of wild type (left) and cera (right) by cryo-SEM
5 μm 5 μm
2.3 气相色谱氢焰离子化检测和气相色谱-质谱分
析cera突变体茎表皮蜡成分及含量
为进一步揭示 cera突变体茎表皮蜡的变化，采
用气相色谱氢焰离子化检测（GC-FID）和气相色谱-
质谱（GC-MS）测量野生型和5株 cera突变体（cera1~
cera5）茎表皮总蜡的组分和含量（见图 3），结果显
连金番等：拟南芥茎表皮蜡缺失突变体 cera蜡成分分析第10期 ·101·
C 24
acid
s
C 26
acid
s
C 30
acid
s
C 24
alco
hol
C 25
alco
hol
C 26
alco
hol
C 28
alco
hol
C 29
alco
hol
C 30
alco
hol
C 40
este
rs
C 42
este
rs
C 44
este
rs
C 46
este
rs
C 48
este
rs
C 50
este
rs
C 24
ald
ehy
de
C 26
ald
ehy
de
C 28
ald
ehy
de
C 30
ald
ehy
de
C 27
alk
ane
C 29
alk
ane
C 30
alk
ane
C 31
alk
ane
C 24
alco
hol
(15
,14
)
C 24
ket
one
15
β-A
myr
ine
组分 Composition
9.00
8.00
7.00
6.00
5.00
4.00
3.00
2.00
1.00
0
含
量（
μg·
cm-
2 ）
Con
ten
t
CotWT
cera-1
cera-2
cera-3
cera-4
cera-5
示野生型拟南芥表皮几乎检测不到 C24和 C26脂肪
酸，C30脂肪酸含量为 0.39 μg·cm-2（1 cm2茎表面含
有 0.39 μg C30脂肪酸）；cera突变体C24脂肪酸和C26
脂肪酸平均含量分别为 0.09和 0.06 μg·cm-2，所有
cera突变体均检测不到C30脂肪酸。然而在野生型
和 cera突变体中，都没有检测到C28脂肪酸。表皮
蜡中脂肪族成分合成的两种途径中各组分含量的结
果显示，酰基还原途径中C24初级醇含量 cera突变
体比野生型增加约 140%，但C26，C28和C30初级醇
含量明显减少，分别减少70%，94%和93%；在脱
羧途径中，cera突变体除C24和C26醛较野生型略增
加外，大于C26的其他组分比野生型均有明显的减
少（见图3）。但这些数据并不包含参与合成酯反应
的超长链脂肪酸以及初级醇。
图3 野生型和突变体cera茎表皮蜡化学组分与含量分析
Fig. 3 Stem wax composition of wild type and cera mutant
另外，cera突变体茎表皮中检测到属于固醇类
的β-香树脂醇，但野生型没有检测到，该物质是
合成固醇类化合物前体，但其与蜡合成的相关关
系还没有报道。值得一提的是，在5株 cera突变体
超长链脂肪酸中，部分脱羧途径代谢中间产物含
量却不一致，因此把这 5株 cera突变体分成 A组
（cera1，cera2和 cera4）和B组（cera3和 cera5），测量
结果显示B组含有比A组较多的C29的烷烃（<94%），
次级醇（<81%）和酮（<95%）。很难解释造成这种差
异的原因是因为遗传因素造成的这种差异还是由
于其他因素，例如收集样品并不是从同一植株采
集的样品，这些不同植株可能存在生长状况的差
异。为此，我们重复将 cera突变体与野生型回交得
到F1，F1自交得到F2，测量F2茎表皮蜡脂肪族组成
成分，结果与A组相似。
从拟南芥表皮蜡脂肪族组成成分碳链长度来
分析，并将酯含有的超长链脂肪酸及醇计算在内
（见图 4）。由图 4可以看出，cera突变体中C24含量
是野生型的 222%，而 C26和 C28却分别为 33%和
26%，由此得出CERA基因作用于延伸C24以上的超
长链脂肪酸。
图4 野生型和突变体cera茎表皮超长链脂肪族
C24、C26和C28组分含量分析
Fig. 4 Sum amount of C24, C26 and C28 in wild type and
cera stem wax components
C24
2.0
1.5
1.0
0.5
0
C26 C28
Col-0
cera
含
量（
μg·
cm-
2 ）
Con
ten
t
东 北 农 业 大 学 学 报·102· 第42卷
3 讨 论
拟南芥中表皮蜡中脂肪族成分合成有两条途
径：酰基还原途径和脱羧途径，作为蜡合成底物的
超长链脂肪酸及其衍生物并不是均匀的分配到这两
个途径中。Millar和Kunst等认为，在蜡合成过程
中，大部分C28和少部分C26、C30超长链脂肪及其衍
生物经由酰基还原途径合成蜡；而大部分C30和小
部分C28，C32超长链脂肪及其衍生物经由脱羧途径
合成蜡[13]。然而我们的测量结果却发现野生型拟南
芥初级醇含量C28（1.76）>>C26（0.97）>C30（0.66），醛
含量 C30（0.57）>>C28（0.15）>C26=C24=0，由此我们认
为大部分C28、C26、C24和小部分C30超长链脂肪酸及
其衍生物通过酰基还原途径参与蜡合成，而大部分
C30和少部分C24、C26、C28超长链脂肪酸及其衍生物
通过脱羧途径参与蜡合成（见图5）。
cera突变体茎色泽浅绿，遗传分析表明为单基
因隐性突变，电镜扫描显示突变体茎表皮蜡晶体缺
失，气相色谱分析数据表明突变体茎表皮蜡减少是
由C24以上超长链脂肪酸供应不足导致，这些性状
与 cut1和 cer6相仿。cer6中C26以上蜡组分减少，然
而 cut1中C24以上蜡组分就已经减少，cut1突变体
是将 35S:antisense: CER6转入拟南芥野生型中得
来。cut1突变体中CER6及其同源基因的表达都可
能有不同程度的抑制[27]。cut1却和 cera茎角质蜡化
学组分相似，即都是C24以上蜡组分明显减少。虽
然 cera和 cer6、cut1表型相似，但是 cera所表现的
由果荚短小导致的低育在潮湿环境中却不能像 cer6
和 cut1一样得到恢复，这说明 cera和 cer6的功能可
能存在差异。
野生型和 cera茎表皮蜡化学组分和含量分析表
明CERA基因在延长24个碳原子以上的超长链脂肪
酸发挥作用。鉴于上述比较，我们对CERA基因的
功能做以下分析。CERA可能是编码超长链脂肪酸
合成酶复合体的 3-酮脂酰-CoA缩合酶的CER6的
等位基因；或者是不同于CER6的延伸C24超长链脂
肪酸的合成酶；或者编码一种与CER6形成复合体
的蛋白。CERA也可能在DNA、RNA或者蛋白水平
调控延长C24以上超长链脂肪酸的合成酶方面发挥
作用，在DNA水平上，CERA可能编码一种影响
DNA甲基化或者组蛋白修饰的酶，以此阻碍编码
延长 C24以上超长链脂肪酸的合成酶的转录；在
RNA水平，CERA可能是一种转录因子影响像
CER6这样的延伸过程中的合成酶的转录，也可能
是一种类似于CER7的外切体亚基，能够降解编码
合成酶的mRNAs[28]，或者通过micro RNA来降解与
超长链脂肪酸合成有关的mRNAs；在蛋白水平，
CERA可能涉及合成酶的翻译后修饰，例如泛素
化，SUMO化，磷酸化和棕榈化等。除了上面我们
讨论的CERA在C24以上超长链脂肪酸的延伸可能的
影响外，它也可能具有酰基转移酶活性参与超长链
脂肪酸的延伸。总之，本文章的数据表明CERA基
因在拟南芥茎表皮延长 24个碳原子以上的超长链
脂肪酸过程中发挥重要作用，这值得我们克隆该基
因并作深入研究。
4 结 论
本试验发现茎色泽浅绿的 cera突变体茎表皮蜡
减少是由C24以上超长链脂肪酸供应不足导致，表
明供应拟南芥茎表皮蜡合成的C24以上超长链脂肪
酸是由特异的酶复合体催化生成。此外对野生型拟
南芥茎表皮蜡各成分详细分析表明大部分 C28、
C26、C24和小部分C30超长链脂肪酸及其衍生物通过
酰基还原途径参与蜡合成，而大部分C30和少部分
C24、C26、C28超长链脂肪酸及其衍生物通过脱羧途
径参与蜡合成。
图5 拟南芥茎表皮蜡合成途径
Fig. 5 Proposed metabolic pathways for wax
biosynthesis in Arabidopsis stems
左枝为酰基还原途经，右枝为脱羧途径
Left branch represents acyl reduction pathway and
right branch represents decarbonylation pathway
脱羧途径酰基还原途经
初级醇
酯
次级醇
酮
烷烃
醛
C18
C24
C26
C28
C30
C32
连金番等：拟南芥茎表皮蜡缺失突变体 cera蜡成分分析第10期 ·103·
[ 参 考 文 献 ]
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东 北 农 业 大 学 学 报·104· 第42卷
龙胆草斑枯病的综合防治研究
收稿日期：2011-02-16
基金项目：哈尔滨市科技创新人才研究专项资金（2007RFXXN005）
作者简介：关雪松（1984-），女，硕士研究生，研究方向为植物病害综合防治。E-mail: guanxuesong_sj1@126. com
*通讯作者：文景芝，教授，博士生导师，研究方向为植物病害综合防治。E-mail: jzhwen2000@yahoo. com. cn
关雪松 1，于荣利 2，文景芝 1*
（ 1.东北农业大学农学院，哈尔滨 150030；2.上海市农业科学院食用菌研究所，上海 201106）
摘 要：龙胆草斑枯病由Septoria spp.侵染引起，主要为害叶片，是龙胆草生长过程中危害最严重的病害。目
前缺乏对龙胆草抗病性、病害流行规律及防治技术等方面的系统研究。文章通过室内抑菌试验筛选出对该病原菌
抑制效果较好的药剂叶病康和代森锰锌。田间药效试验结果表明，硫酸小诺霉素对该病的防治效果较好，在发病
后期防治效果达 69.2%。用 70%甲基托布津（wp）处理种苗结合玉米间作和清除田间病残体，后期防治效果可达
64.2%。
关键词：龙胆草斑枯病；药剂筛选；综合防治
中图分类号：S481；S432 文献标志码：A 文章编号：1005-9369（2011）10-0105-05
Integrated control of gentian leaf blight/GUAN Xuesong1, YU Rongli2, WEN Jingzhi1
(1. College of Agriculture, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China; 2. Institute of
Edible Fungi, Shanghai Academy of Agricultural Sciences, Shanghai 201106, China)
Abstract: Gentian leaf blight caused by Septoria spp. is a serious disease in gentian production in
Heilongjiang Province in China. There are no effective methods for controlling this disease due to lack of
systematic study on disease epidemics and controlling technology as well as gentian resistance to the disease. In
the present study, yebingkang and mancozeb, which had high inhibitory effect on Septoria micropora based on the
results of inhibiting experiments, were screened out of 12 fungicides, and micronomicin sulfate exhibited 69.2% of
control efficiency in field, which was higher than other tested fungicides. An integrated control method consisting
of seed treated using 70% thiophanate-methyl and intercropping with maize as well as cleaning up the remains in
field at spring were recorded to be effective for controlling gentian leaf blight with 64.2% of control efficiency.
Key words: gentian leaf blight; fungicide screening; integrated control
龙胆草为龙胆科龙胆属多年生药用草本植物[1]，
分为条叶龙胆（Gentiana manshurica Kitag.）、粗糙龙
胆（Gentiana scabra Bunge.）、三花龙胆（Gentiana
triflora Pall.）和坚龙胆（Gentiana rigescens Franch.），
以根、根茎入药，具有清热、燥湿和泻肝胆火之功
效[2]。
龙胆草斑枯病是中药材龙胆草的主要病害 [3]，
主要为害叶片。该病首先从近地面叶片开始发生，
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Journal of Northeast Agricultural University
东 北 农 业 大 学 学 报第42卷第10期 42(10): 105~109
2011年10月 Oct. 2011