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第 33卷第 1期 湖南农业大学学报(自然科学版) Vol.33 No.1
2007年 2月 Journal of Hunan Agricultural University (Natural Sciences) Feb．2007
文章编号：1007-1032(2007)01-0014-04
拟南芥心皮发育 CRABS CLAW基因的
克隆与荠菜遗传转化
赵 燕，张学文*，蒋 向
(湖南农业大学 生物科学技术学院，湖南 长沙，410128)
摘 要：CRABS CLAW(CRC)是控制拟南芥心皮发育的主要基因之一，属MADS box基因家族中的成员．根据
GenBank收录的 CRABS CLAW基因的 cDNA序列设计引物，通过 RT-PCR的方法，从哥伦比亚型拟南芥总 RNA
中扩增出 CRABS CLAW基因的全长 cDNA片段，将其克隆到 pMD18-T载体中，经测序证明该片段与 GenBank
报道的序列完全一致．以 Ti质粒载体 pWM101为基础，构建了由组成型启动子 CaMV35S调控的 CRC基因的植
物表达载体 pWM101-CRC，通过根癌农杆菌花序浸渍法转化荠菜，获得了转 CRC基因的荠菜植株. CRC基因在
荠菜中的组成型表达对荠菜心皮形态和大小都产生了一定影响．
关 键 词：拟南芥；CRABS CLAW基因；荠菜；转化
中图分类号：Q785 文献标识码：A

Cloning of Arabidopsis thaliana CRABS CLAW gene and its
transformation into Capsella bursa-posteris
ZHAO Yan，ZHANG Xue-wen*，JIANG Xiang
(College of Bioscience and Technology，HNAU，Changsha 410128，China)
Abstract：CRABS CLAW(CRC) is a key gene controlling the carpel development of Arabidopsis thaliana，encoding a
transcription factor which belongs to MADS family．To clone the gene cDNA a pair of primer was designed and
synthesized according to the CRC cDNA sequence．The full length cDNA of the gene was amplified by RT-PCR by
using the total RNA as temple that is isolated from the ecotype Colombia seedling of Arabdopsis thaliana．The cDNA
was cloned into pMD 18-T vector and be sequenced．DNA sequencing indicated that the cloned fragment is identity to
the sequence of CRC cDNA in GenBank and encodes a predicted transcription factor．The cDNA is subsequently cloned
into a Ti plasmid pWM101 and be controlled by a consistant promoter 35S of CaMV．The recombinant was transformed
into Capsella bursa-posteris which is identical in a heart shaped carple. Transgenic plant obtained and the phenotype of
carple varies in both size and shape．
Key words：Arabidopsis thaliana；CRC；Capsella bursa-posteris；transformation

自 1991年 E.M.Meyerswits实验室从拟南芥中陆
续发现一些与花器发育有关的同源盒子基因
(MADS box 基因)以来，其多数成员的功能已被揭
示出来，这些基因多参与花器器官的确定，基因产
物具有一个由 56 个氨基酸残基组成的结构域，表
现出不同程度的同源性[1]，在分生组织特定位置表
达，编码多肽为一些基因表达的转录因子．编码的
转录因子通过与一系列基因调控序列或转录因子
的相互作用，调节建成器官的结构和功能基因的表
达，从而决定分生组织特定位置的细胞分化，使花
器得以在正常时期和部位形成．
Lu等克隆了Atml1基因的cDNA并测定了其全
序列，根据DNA序列推导的产物也是一种具有
homeodomain的多肽．将其序列与GeneBank中收录
的数据对比，揭示了一组新的同源盒子基因的存
收稿日期：2006-10-24
基金项目：湖南省自然科学基金项目(00JJY2026)
作者简介：赵 燕(1964-)，女，湖南湘潭人，硕士研究
生，湖南农业大学高级实验师．*通讯作者：xwzhang@
hunau.net．
DOI:10.13331/j.cnki.jhau.2007.01.004


第 33卷第 1期 赵 燕等 拟南芥心皮发育CRABS CLAW基因的克隆与荠菜遗传转化 15
在．如控制兰花胚珠发育特异表达的O39基因，控制
矮牵牛胚珠发育的FBP7和FBPll[2]以及拟南芥中花
瓣、雄蕊、心皮、胚珠发育所必需的STK，SHP，SEP
等基因[3-5]．除了在模式植物上发现决定胚珠发育的
MADS-box基因外，在其他物种中也发现这些基因
的同源序列，Lopez-Dee等 [6] 从水稻中分离出Os
MADS13基因，发现Os MADS13可能在水稻胚珠及
种子的发育中起作用，Xu等[7]从风信子花的胚珠组
织中分离出了HoMADS1基因，其过量表达会产生
心皮状的器官，包括胚珠，认为HoMADS1在决定
心皮和胚珠的特性方面起着重要作用．Tzeng等[8]从
百合中分离出2个MADS-box基因——LMADS2和
EgMADS1，分析后发现其与FBP7和FBPll同源性很
高，而且发现前者主要在胚珠中表达，在心皮中有
较弱的表达，而后者在胚珠中特异表达．
拟南芥心皮发育主要受 CRABS CLAW(CRC)及
SPATULA(SPT)基因的控制[9]，其中 CRC 是控制心
皮发育的关键性基因．笔者从哥伦比亚生态型拟南
芥中克隆了 CRC基因的 cDNA，构建了由组成型启
动子 CaMV 35S 调控的 CRC 基因的植物表达载体
pWM101-CRC，以根癌农杆菌浸渍法转化具有心形
外型心皮形态的荠菜，筛选到转 CRC基因的荠菜植
株．CRC 基因在荠菜中的组成型表达对荠菜心皮形
态和大小都产生了一定影响．现将结果报道如下.
1 材料与方法
1.1 材 料
拟南芥(Arabidopsis thaliana)为 Columbia 生态
型；荠菜(Capsella bursa-posteris)为野生型．
载体 pMD18T-vector购自大连宝生物工程有限
公司，大肠杆菌菌株 INVαF′，农杆菌菌株LBA4404，
质粒 pWM101 均由湖南农业大学生物科学技术学
院细胞生物学研究室保存．
Trizol 购自美国 Molecular Reseach Centre，
RT-PCR 试剂盒，DNA回收试剂盒及各种限制性内
切酶，Taq 酶，T4 连接酶，IPTG，X-gal 等购自
Fermentas公司，其他试剂均为国产分析纯，基因测
序由北京中科开瑞公司完成．
1.2 方 法
1.2.1 拟南芥 cDNA 的制备
取拟南芥植株主花序上的幼嫩花蕾置 4 ℃低温
处理后，用 TRIzol 试剂一步法提取总 RNA，以总
RNA 为模板，经反转录得到 cDNA(操作参照试剂
盒说明书进行)．
1.2.2 CRC 基因的扩增
根据 GeneBank 中收录的拟南芥 CRC 基因的
mRNA序列，应用 Primer5.0软件分析其序列的酶切
位点，所设计的上游引物与其 mRNA3’序列互补，
下游引物与其 5’端序列相同．上游：5′ GAC CAT
GAA CCT AGA AGA GA 3′；下游：5′ TTT GTT CAC
TTC TTC TCA CC 3′．以 cDNA为模板，采用梯度
PCR方法扩增，选择最适反应条件为：95 ℃预变性
3 min；95 ℃变性 1 min；55 ℃退火 50 s；72 ℃延伸
90 s，共35个循环．72 ℃延伸 15 min，4 ℃终止反应．
1.2.3 CRC 基因的克隆
采用 A-T 克隆的方法，将扩增片段克隆到
pMD18-T 载体，获得 pTCRC，并转化大肠杆菌
INVαF′，在含有 IPTG，X-gal的 LB/Amp平板上筛
选白色菌落，对重组子进行菌落 PCR及酶切鉴定，
并对该片段进行测序．
1.2.4 植物表达载体的构建
利用植物表达载体 pWM101所带的CaMV 35S
启动子下游的 BamHI 和 PstI 等多克隆位点．用
BamHI 和 PstI 双酶切质粒 pTCRC，和植物表达载
体 pWM101，用小量胶回收试剂盒分别回收和纯化
CRC的 cDNA片段和载体片段．将两片段连接转化
大肠杆菌 INVαF′，在含 Kan的 LB培养基上筛选转
化菌落，通过菌落 PCR鉴定和提取质粒进行酶切鉴
定，证实重组构建质粒(pWM-CRC)的正确性．
1.2.5 植物表达载体转入感受态根癌农杆菌
LBA4404
利用液氮冻融法将 pWMCRC质粒转化根癌农
杆菌 LBA4404．转化后细菌平铺于Kan 50 µg/mL，
Str 50 µg/mL，Rif 50 µg/mL的 YEP平板培养基上，
长成的菌落即为带重组质粒的根癌农杆菌
LBA4404，用于植物的转化．
1.2.6 荠菜的转化
采用浸渍法转化野生型荠菜，当荠菜植株生长
至主花序 10 cm左右，次花序在莲座开始形成时，
将植株地上部分全部浸入 1 L的浸渍液(500 mL过
夜培养的转化农杆菌 OD600接近 0.5～0.8，悬浮在 1
L含 50 g蔗糖，200 µL Triton，的MS)中，5 min后


16 湖南农业大学学报(自然科学版) 2007年 2月
取出植株，用保鲜膜覆盖保湿，第 2天重复 1次，
然后培植植株至种子成熟．
1.2.7 荠菜转化植株的筛选
成熟种子充分干燥后 4 ℃下放置 1周，经 0.1%
升汞表面消毒 8 min，无菌水充分冲洗后，接种到
筛选培养基上进行发芽筛选，每瓶培养基中铺加约
1 000粒种子．筛选培养基(MS+GA3 4 mg/L+3%蔗
糖+0.8% 脂+50 mg/L潮霉素)中的潮霉素提供了转
基因的选择标记．转基因植株由于转入了 HPT 基
因，可以在含潮霉素的培养基上正常萌发生长．
2 结果与分析
2.1 CRC 基因 cDNA 的 RT-PCR 扩增
采用梯度 PCR扩增得到一个 600 bp左右 DNA
片段，与预期大小相符(图 1)．
1 2 3 4 5 M

1.阴性对照；2～5.分别为 52.2，55.1，57.8，58.9 ℃的扩增结果
图1 梯度 PCR 琼脂糖凝胶电泳结果
Fig.1 Agarose electrophoresis gel of the temperature gradient PCR

2.2 克隆载体的构建
利用 PCR 产物在 3′末端自动加 A 及 pMD18T-
vector 上多克隆位点突出 T 的特点，将克隆到的
CRC-DNA 片段与 pMD18T-vector 连接得到重组质
粒，命名为 pTCRC转化大肠杆菌 INVαF′ ，在含有
IPTG，X-gal的 LB/Amp平板上筛选白色菌落，通
过对重组子进行 PCR 及酶切鉴定，在约 600 bp 处
都有 CRC 的目的条带，证明已将克隆到的 cDNA
片段连接到 T-vector上．测序结果表明该片段长度
为 572 bp，与 GenBank报道的 CRC基因的 cDNA
序列完全一致．
2.3 植物表达载体的构建
以植物表达载体 pWM101为基础，利用植物表
达载体 pWM101 所带的 CaMV35S 启动子下游有
BamHI和 PstI等多克隆位点，可供外源基因插入并
在植物细胞中表达．将 CRC 基因的 cDNA 片段插
入到多克隆位点，构建了一个含潮霉素抗性基因植
物选择标记和 CaMV 35S调控的 CRC基因的植物
表达载体 pWM-CRC，如图 2所示．

图2 植物表达载体pWM-CRC 的构建
Fig.2 Construction of plant expression vector pWM-CRC
随机挑选几个转化菌落进行 PCR检测，在 600
bp处均扩增到目的条带．菌落 PCR检测结果如图 3
所示，酶切分析表明，在 600 bp处附近有明显的扩
增带，其酶切产物的大小与目的基因 CRC 的大小
相符，在 10 kb左右有明显的酶切带，其酶切产物
的大小与 pWM101载体的大小相符，说明用 PstⅠ
与 BamHⅠ进行双酶切得到了与预期大小一致的目
的片段，进一步说明了 CRC基因的表达载体构建
成功．
M 1 2 3 4

M：Marker；1～4.随机挑选的几个菌落的 PCR结果
图3 菌落 PCR 产物电泳结果
Fig.3 Analysis of PCR amplification product
2.4 荠菜的转化结果
收获浸渍转化植株种子，在筛选培养基上经潮
霉素筛选，从近 3 000 粒种子中获得了 61 株抗性
苗，转化率约为 2%．当抗性苗莲座叶长出后，移
栽到营养土中观察植株性状，其中 52 株的心皮生
长较野生型有明显变异．有的心皮增厚，径相变短，
表面呈现凹凸不平的现象(图 4)；有的则显示了荠
菜心皮轴向增长．虽然转化率不高，但浸渍转化操
作简便，收获的种子量大，还是得到了一定量的转
基因植株．

750 bp
500 bp
750 bp
500 bp


第 33卷第 1期 赵 燕等 拟南芥心皮发育CRABS CLAW基因的克隆与荠菜遗传转化 17






A.野生荠菜心皮；B，C.转基因荠菜心皮
图5 转基因荠菜心皮形态变异
Fig.5 The phenotype of transgenic carpel of Capsella bursa-pastoris
3 讨 论
Alvarez J.等[9]发现 CRC基因突变将引起雌蕊呈
现较宽而短的结构，且使两心皮在顶点处呈非融合
状态．由此看来，CRC 基因对于雌蕊的形态发育起
着非常重要的作用．荠菜与拟南芥同属十字花科植
物，但其心皮形态完全不同，拟南芥为长荚果，荠
菜属短荚果呈心型外形，其形态发育受各自的 CRC
基因控制，将拟南芥的 CRC基因导入到荠菜中，转
化结果初步表明，转化植株其心皮形态较野生型有
明显变异，每个雌蕊内的胚珠数目相对于野生型而
言有相对减少而形态增大的趋势．另外还偶尔出现
多心皮现象，尤其在第一朵成花中．此外，还可以
观察到蜜腺发育的废除．这正好与 Alvarez J.等报道
的相符．由此看来，变异株中心皮轴向增长的现象
可能是拟南芥 CRC基因在荠菜中正义表达的结果，
而变异株中心皮呈现宽而短的结构及表面出现的凹
凸不平等现象，则可能是由于 T-DNA在植物基因组
中的整合，因整合位点处于某功能区域内，该基因
正常功能被插入失活而表现出突变性状．
通过对 CRC 以及 SPT 基因和与之同源的一些
可导致心皮发育异常的基因的研究，说明对于心皮
发育，CRC 和 SPT 基因是必须的，而且二者是联
合在一起发挥作用的，它们的行为受到 A和 B器官
鉴定基因的调控[10]．第三个正在被研究的与心皮发
育有关的基因是 AGAMOUS，其职能已被鉴定是全
面控制心皮的一致性．当 AGA 基因失去作用时，
花器仍将维持其多心皮化结构，这说明仍有其他基
因参与这一过程．CRC可抑制正在发育的雌蕊的横
向生长但可促进其轴向生长，SPT基因可支持心皮
边缘的发育和由其衍生而来的组织的发育[11]．这 3
个基因相互关联并发生作用，有遗传学证据表明
CRC可增进 AGA和 SPT基因的功能．
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责任编辑：罗慧敏
英文编辑：胡东平
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